溶酶体靶向的汉坦病毒包膜糖蛋白DNA疫苗的体液免疫评价和攻毒保护效果

目的:构建嵌合溶酶体相关膜蛋白(LAMP)的汉坦病毒糖基化蛋白DNA疫苗并对其免疫进行评价。方法:利用前期实验构建的重组质粒pVAX-Gn、pVAX-Gc、pVAX-LAMP/Gn和pVAX-LAMP/Gc以及inactivated疫苗免疫BALB/c小鼠,分别通过间接ELISA和中和试验检测免疫小鼠血清中的特异性抗体和中和抗体;攻毒实验检测小鼠体内的保护效力。结果:间接ELISA结果显示,pVAX-LAMP/Gc组特异性抗体滴度最高,依次为pVAX-Gc、pVAX-LAMP/Gn、pVAX-Gn与inactivated疫苗组;中和结果显示,LAMP组均优于相应传统DNA疫苗组,且抗体效价均优于Inactived vaccine组;攻毒实验显示,DNA疫苗和inactivated疫苗组小鼠体内无汉坦病毒特异性抗原检出。结论:LAMP分子的嵌合DNA疫苗可诱导更高水平的抗体,在小鼠体内有较好的保护效力,这一靶向策略有望成为提高DNA疫苗效价的有效方式。

芽胞杆菌及其代谢物抑制包膜病毒感染的研究进展

包膜病毒指具有一层脂质双层膜的病毒,如流感病毒、冠状病毒等,这些包膜病毒每年在世界范围内导致许多严重的疾病,严重威胁人类健康。使用抗病毒药物是预防与治疗病毒感染的主要策略,芽胞杆菌(Bacillus)及其代谢物能够抑制多种包膜病毒的感染。本文综述了芽胞杆菌代谢的粗提物、肽、酶、胞外聚合物、小双链RNA和热灭活的枯草芽胞杆菌孢子在抗包膜病毒感染中发挥的重要作用,其机制是通过直接破坏病毒包膜、阻止膜融合、与病毒基因组RNA直接配对、催化裂解病毒RNA、激活天然免疫反应等对抗病毒,期望为包膜病毒的持续预防和治疗提供参考。

血清乙型肝炎病毒包膜大蛋白检测与病毒复制的相关性研究

目的 通过检测慢性乙肝患者血清包膜大蛋白（HBV large envelope protein,HBV-LP）、乙肝病毒DNA（HBV DNA）和乙肝病毒e抗原（HBeAg）,探讨HBV-LP对于反映体内乙肝病毒复制的意义.方法 对623例慢性乙肝患者血清标本采用酶联免疫吸附试验检测HBV-LP和HBeAg,实时荧光定量PCR检测HBV DNA.结果 慢性乙肝患者HBV-LP和HBV DNA阳性率明显高于HBeAg阳性率（Х^2=22.3和9.4,P＜0.01）,HBV-LP和HBV DNA阳性率比较差异无统计学意义（Х^2=2.8,P＞o.05）,HBeAg阳性或阴性患者血清HBV-LP和HBV DNA阳性率比较均差异无统计学意义（Х^2=3.2和0.6,P＞0.05）.血清HBV-LP含量与HBV DNA拷贝数呈正相关（r=0.874,P＜0.01）,在不同HBV DNA拷贝数组别间,HBV-LPA值差异有统计学意义（F =6.987,P＜0.01）.100例健康对照者,其血清HBV DNA及HBV-LP测定结果均为阴性.结论 HBV-LP检测血清的灵敏度高于HBeAg,慢性乙肝患者血清HBV-LP与HBV DNA复制密切相关,可作为反映HBV复制的指标.

登革病毒包膜蛋白Ⅲ区IgG抗体捕获酶联免疫吸附试验的建立及应用

【摘要】目的建立一种高度敏感和特异的登革病毒（denguevirus，DENV）包膜蛋白Ⅲ区（envelopeproteindomain1]I，EDm）IgG抗体的检测方法，并探索这种方法在登革热诊断和血清流行病学调查中的应用价值。方法以毕赤酵母表达系统制备的重组全长DENVEDm作为抗原，建立DENVEDmIgG抗体捕获ELISA。用这种方法检测来自同一组35例DENV一1初次感染患者在2006年发病期和2010年随访期的血清标本，并将其检测的敏感性与商品化的PanbioDENVIgG抗体捕获ELISA试剂盒进行对比。结果DENVEDHIIgGELISA试剂盒对发病期和随访期血清标本检测的灵敏度分别是87％（20／23）和94％（33／35），而Panbio DENV IgGELISA试剂盒对这两个时期血清标本检测的灵敏度分别是71％（25／35）和0。DENV EDⅢ IgG ELISA试剂盒对两个时期血清检测灵敏度差异无统计学意义（X^2=0．946，P=0．331）。对于发病期血清标本，DENVEDⅢIgG ELISA试剂盒与Panbio DENV IgG ELISA试剂盒检测的灵敏度比较，差异无统计学意义（X^2=1．924，P=0．165）；而对随访期血清标本，DENV EDⅢ IgG ELISA试剂盒检测灵敏度高于Panbio DENV IgG ELISA试剂盒，差异有统计学意义（X^2=62．432，P=0．000）。结论DENVEDⅢIgG抗体捕获ELISA试剂盒对登革热患者发病期血清及随访期血清中IgG抗体的检测均具有高度的敏感性，有可能成为DF诊断和血清流行病学调查的有效工具。

丙型肝炎病毒包膜糖蛋白高变区1多抗原肽设计及免疫原性的研究

目的 应用多抗原肽 (MAP)研究丙型肝炎病毒包膜糖蛋白高变区 1(HVR1)的抗原性。方法 根据已经获得的HCV BJ株E2 /NS1区氨基酸序列 ,参照国内外学者所报道的HCVHVR1序列及抗原性参数 ,设计并合成含HCVHVR1390— 411aa序列 2 2个氨基酸的线性表位多肽 (以LP表示 )及MAP(对称 8分枝 ) ,分别以LP和MAP免疫Balb/C小鼠及家兔 ,比较其免疫原性。结果 MAP免疫原性明显强于LP ,抗体滴度 1∶40 96 0 ,而LP免疫组为 1∶12 80。结论 MAP的构型优势能明显提高HCVHVR1合成多肽抗原的免疫原性 ,提示MAP可用于HCV分子疫苗的设计。

埃博拉病毒包膜糖蛋白进化特征分析

目的研究埃博拉病毒包膜糖蛋白的进化和变异特征。方法从美国生物信息中心（NCBI）数据库选取1976至2014年埃博拉病毒包膜糖蛋白氨基酸序列100条，通过多序列比对和蛋白进化树分析埃博拉病毒包膜糖蛋白的进化和变异特征。结果1976至2014年，不同亚型埃博拉病毒包膜糖蛋白氨基酸序列间的同源性为54．00％～65．00％，同亚型包膜糖蛋白氨基酸序列同源性为95．00％～100．00％。2014年在不同地域分离到的同亚型埃博拉病毒的包膜糖蛋白氨基酸序列并不完全一致，但是变异很小，同源性达到了99．70％～100．00％。2014年来自塞拉利昂的扎伊尔一埃博拉病毒包膜糖蛋白氨基酸同源性达到了100．00％，但是来自几内亚的三条扎伊尔一埃博拉病毒糖蛋白氨基酸序列有一定变异。不同亚型埃博拉病毒包膜糖蛋白分别在进化树的不同分支上：2014年分离自塞拉利昂的扎伊尔一埃博拉病毒包膜糖蛋白在一大分支上；1976至2014年分离自塞拉利昂以外国家的扎伊尔一埃博拉病毒糖蛋白在另一个大分支上。结论埃博拉病毒包膜糖蛋白氨基酸变异具有时间性和地域性。2014年流行于不同地域的扎伊尔一埃博拉病毒可能是同一来源的两个不同变种，没有迹象表明不同亚型埃博拉病毒之间具有“混合杂交现象”发生。

急性感染期内恒河猴外周血中人/猴嵌合免疫缺陷病毒包膜蛋白的N糖基化位点分析

目的：分析人/猴嵌合免疫缺陷病毒（SHIVSF162P3）包膜蛋白N糖基化位点的数量和分布及病毒传播能力。方法两只雌性成年（4周岁）中国恒河猴，编号Rh1和Rh2，体重分别为4和5 kg。通过静脉攻毒的方式向Rh1和Rh2接种SHIVSF162P3，每只剂量为300半数组织培养感染剂量，在攻毒后第3、7、10、14、17、21、24、28、35、42、49、56、63、70和77天采集血液样本。对样本进行病毒RNA抽提和cDNA合成，采用实时荧光定量PCR测定病毒RNA水平。对攻毒后第7、14、28和77天的血浆样本进行单基因组扩增，使用Bio-edit中的Clustal W软件进行包膜蛋白全长多序列比对，用MEGA6.06软件计算配对差异距离，采用HIV Databases中的软件计算包膜蛋白N糖基化位点和可变区氨基酸数目，比较序列多样性、N糖基化位点数量的差异。结果从接种的病毒中共扩增得到55条包膜蛋白全长序列，其核苷酸序列平均配对差异距离为（0.1666±0.0963）%。病毒载量在攻毒后第10天达到峰值，lg转换值分别为7.68和7.49拷贝/ml；在攻毒后第42天，病毒载量达到调定点，lg转换值分别为4.27和4.81拷贝/ml。攻毒后第7天，Rh1和Rh2血样中包含25个N糖基化位点的病毒包膜蛋白序列的比例分别达到83%（20/24）和94%（29/31），高于接种病毒中的比例[49%（27/55）]。随着感染时间的延长，Rh1和Rh2血浆中SHIVSF162P3病毒包膜序列的多样性逐渐增大，包含25个N糖基化位点的包膜蛋白序列比例逐渐降低，包含27个N糖基化位点病毒所占比例逐渐升高；在第28天Rh1体内包含27个N糖基化位点的序列比例达到29%（6/21），Rh2在第77天达到35%（13/37）。V1~V5区糖基化位点分析发现，N糖基化位点数目的变化主要来自于V4区。与包含27个糖基化位点的包膜蛋白序列相比，包含25个糖基化位点的病毒包膜蛋白序列在V4区缺失7个氨基酸（TWNNTIG），导致V4区在392位和396位缺少2个N糖基化位点。结论 V4区低糖基化的SHIVSF162P3在传播过程中占优势地位；而随着感染时间的延长，V4区高糖基化的SHIVSF162P3逐渐在猴体内获得复制优势。

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2中关键组氨酸位点突变体的构建与感染性

目的构建组氨酸(Histidine)位点突变的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)突变体,并检测其感染性。方法利用定点突变技术,分别将HCV包膜蛋白E2第490位和第621位的组氨酸突变为丙氨酸(Alanine),构建突变质粒H490A和H621A,采用T7体外转录法制备病毒RNA,通过电穿孔法导入Huh7.5.1细胞,免疫荧光法检测病毒蛋白的表达、电穿孔效率及细胞培养上清的感染性。结果 H490A和H621A突变型质粒经酶切及测序鉴定构建正确;体外转录获得的野生型与突变型病毒RNA均能在Huh7.5.1细胞中表达病毒蛋白,电穿孔效率高达90%以上;野生型病毒感染细胞培养上清中可检测到HCV阳性细胞,H490A病毒感染细胞培养上清中的阳性细胞数量比野生型明显减少,H621A病毒感染细胞培养上清中未检测到阳性细胞。结论成功构建了组氨酸位点突变的全长表达质粒H490A和H621A,两种突变体病毒的感染性均显著降低。

亚甲蓝/光化学法体外灭活RNA包膜病毒的实验研究

目的 研究亚甲蓝 (MB) /光化学法灭活 RNA包膜病毒的动力力参数条件。方法 以日本脑炎病毒为指示病毒 ,以与 MB最大吸收波长相匹配的单波长点阵式发光二极管为光源 ,将指示病毒与不同浓度的 MB工作液混合后 ,收集不同光照时间和距离的 MB/病毒混合液 ,将其接种于 Vero单层细胞后 ,空班法测定病毒滴度。结果 当光源光照度一定时 ,MB工作浓度、光源光照时间和距离是影响 MB/光化学法灭活病毒的主要动力学参数 ,1.0μg/ m l的 MB工作浓度可在理想的时间内 (≤ 5 m in)完全杀灭一定光照距离范围内 (≤ 2 .5 m )的病毒 ,同时 ,适当地延长光照时间 (≥ 2 5 m in) ,可完全杀灭更远光照距离的病毒 (≤ 3.0 m )。结论 MB/光化学法可在体外安全高效地杀灭 RNA包膜病毒 ;在光源光照度一定的条件下 ,MB工作浓度、光源光照时间和距离均可影响MB/光化学法灭活病毒的作用效果。

S/D处理血浆过程中的脂包膜病毒灭活试验观察

通过有机溶剂/去污剂对血浆中指示病毒VSV灭活的观察评估有机溶剂/去污剂对脂包膜病毒死活的效果。血浆样品与VSV病毒按9:1混合,然后用1％TNBP/1％ Triton X-100在30℃处理4h,测定开始样品中的病毒总量和S/D处理后不同时间取样内的病毒总量。实验中样品内加入1％TNBP/1％ Triton X-10015min后VSV病毒已全部灭活,灭活效果≥6.0log。按所述S/D处理方法可以完全灭活血浆内所有的脂包膜病毒而没有主要血浆蛋白的损失。

RNA包膜病毒的光诱导灭活

目的 以亚甲蓝(MB)为光敏剂,研究RNA包膜病毒光诱导灭活的影响因素。方法 以登革热病毒为指示病毒,以单波长点阵式发光二极管为光源,将指示病毒与不同浓度的MB工作液混合后,收集不同光照时间和距离的MB/病毒混合液,空班法测定病毒滴度。结果 MB < 1.0 mg/ml 时,病毒灭活效果并不理想; MB≥1.0 mg/ml时,在5min的光照时间内即可完全灭活2.5 m光照距离内的病毒,当光照距离≥3.0 m时,较高浓度的MB(2.0 mg/ml)可在较短时间内(20 min)完全杀灭病毒,而较低浓度的MB(1.0 mg/ml)则需要更长的光照时间(25 min)才可完全杀灭指示病毒。结论 MB工作浓度和光源光强度、光照时间和距离是影响RNA包膜病毒光诱导灭活效果的4个关键因素,前三者与病毒灭活效果正相关,后者则负相关。

低pH孵放法灭活静注人免疫球蛋白中脂包膜病毒效果验证的研究

选用不同核酸类型的脂包膜病毒,其中RNA病毒为水疱性口炎病毒(VSV),DNA病毒为伪狂犬病毒(PRV),将两种指示病毒分别用于验证低pH孵放法对不同厂家生产的人血静脉注射用丙种球蛋白(IVIG)的病毒灭活效果。结果表明,液体IVIG的pH值为3.8～4.4,在23～25℃环境中,孵放21天可灭活VSV和PRV,两种指示病毒的灭活效果分别为≥5.50～6.62和≥5.38～6.62logTCID50/0.1ml。因此,低pH孵放法是一种安全、有效且简便实用的灭活脂包膜病毒的方法。

辛酸盐灭活静注人免疫球蛋白中脂包膜病毒效果验证的研究

选用不同核酸类型的脂包膜病毒,其中RNA病毒为水疱性口炎病毒(VSV),DNA病毒为伪狂犬病毒(PRV),将两种指示病毒分别用于验证一定浓度的辛酸盐对某一厂家生产的人血静脉注射用丙种球蛋白(IVIG)的病毒灭活效果。结果表明,液体IVIG在辛酸钠(0.7±0.2mmol/g蛋白)、pH(5.1±0.1)、29.5~30.5℃,孵放90min可灭活VSV和PRV,两种指示病毒的灭活效果分别为≥4.00~4.12和≥5.25~5.75log TCID50/0.1ml。因此,辛酸盐是一种安全、有效、快速的灭活脂包膜病毒的灭活剂。

S/D法灭活血液制剂中脂包膜病毒效果验证的研究

选用不同核酸的脂包膜病毒，其中RNA病毒为水疱性口炎病毒（VSV），DNA病毒为伪狂犬病毒（PRV），将两种指示病毒分别用于验证S／D法处理对纤维蛋白原、凝血酶原复合物、凝血因子Ⅷ、静注丙种球蛋白、免疫血浆等血液制剂的病毒灭活效果。结果该法对所有被处理的血液制剂中的PRV及VSV灭活能力分别为≥3.38－5.88和≥3.50－4.75logTCID50／0．1ml，表明S／D法对两种病毒核酸类型的脂包膜病毒有良好的灭活效果。

日本血凝病毒包膜的抗肿瘤应用策略研究进展

日本血凝病毒包膜(HVJ-E)可以通过增强肿瘤免疫反应、诱导肿瘤细胞凋亡以及靶向药物输送以达到高效治疗癌症的目的。诸多研究表明,HVJ-E的免疫治疗联合化疗(如与DTIC联用)、放疗(如与BNCT联用)、热疗(如将MNPs与HVJ-E结合)等能够展现出协同抗肿瘤作用。但是,由于HVJ-E全身给药易出现血凝问题,HVJ-E的应用受到限制。近年研究发现,通过LbL技术对其表面进行修饰,可以降低HVJ-E的血凝问题,并增加对肿瘤的特异性。该文将简述HVJ-E在肿瘤治疗上的应用策略,为促进HVJ-E在肿瘤治疗领域的进一步开发提供参考。

贯叶金丝桃抗包膜病毒作用的研究进展

贯叶金丝桃是目前世界上应用较广泛的草药之一。以往主要用于抗抑郁症,新近发现其尚有抗包膜病毒的作用,对艾滋痛、乙型和丙型肝炎、单纯疱疹、流感等病毒感染性疾病的治疗,显示了一定的前景;其合成单体均显示出较强的毒性,而天然提取物效果确切,毒副作用较小,故其天然提取物的开发与应用值得重视。

光敏式病毒灭活仪杀灭RNA包膜病毒的实验研究

目的 研制出可在体外杀灭RNA包膜病毒的新型仪器。方法 与亚甲蓝最大吸收波长相匹配的单波长发光二极管组成的单个或点阵式发光体为光源系统 ,以日本脑炎病毒和登革热病毒为RNA包膜病毒灭活效果评估的指示病毒 ,采用空斑法测定病毒滴度 ,获得不同浓度亚甲蓝工作液以及光源不同光照度、光照时间和距离等参数条件下灭活病毒的动力学参数。结果 光敏式病毒灭活仪主要由亚甲蓝喷雾器、二极管电路和发光二极管点阵组成 ;光照时间≥ 5min ,光照度光照距离≤ 2 .5m的条件下 ,1 .0 μg/ml和 2 .0 μg/ml的MB工作液灭活病毒的效力均为 1 0 0 %。 结论 光敏式病毒灭活仪可有效地灭活RNA包膜病毒 ,同时 ,与MB最大吸收波长相匹配的光源系统提高了亚甲蓝

基于Ⅰ类包膜病毒膜融合机制的肽类抗病毒药物研究进展

病毒性疾病已成为影响人类健康的重大威胁之一,其中,由Ⅰ类包膜病毒引起的疾病传播甚广,危害极大。研究表明,Ⅰ类包膜病毒如1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)、中东呼吸综合征冠状病毒和流感病毒等在进入宿主细胞的过程中会形成六股螺旋结构,特异性地抑制其形成过程可阻断病毒与宿主细胞膜的融合,从而达到抑制病毒增殖的效果。基于Ⅰ类包膜病毒膜融合机制的肽类抗病毒药物具有生物活性高、副作用小及特异性强等优点,正逐渐成为肽类抗病毒药物研究的热点。本文对近年来基于Ⅰ类包膜病毒膜融合机制的肽类抗病毒药物的研究进展进行了较为系统的综述。