乙型肝炎病毒外膜大蛋白与HBV DNA的关系研究

目的:探讨乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒外膜大蛋白(HBV-LP)与HBV DNA的关系。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR法,检测320例乙型肝炎患者血清中的HBV-LP水平及HBV DNA载量。结果:HBV-LP水平与HBV DNA拷贝数变化相一致,两者呈正相关(r=0.949);不同模式的HBeAg血清中HBV-LP与HBV DNA阳性率,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:血清HBV-LP水平能反映乙型肝炎患者体内HBV复制程度,是判断HBV复制的血清学指标。

EB病毒潜伏膜蛋白和肿瘤的关系

EB病毒（EBV）是人类疱疹病毒，与淋巴系统、上皮细胞肿瘤相关。其编码潜伏性膜蛋白（LMP）包含LMP1、LMP2A和LMP2B。特别是LMP1，是众多EB病毒编码蛋白质中唯一被明确证明能恶性转化原代B细胞、鼠成纤维细胞和人上皮细胞的蛋白质。研究LMP与肿瘤的关系将为防治EB病毒相关肿瘤提供新的策略。

HCV包膜蛋白E2的表达及其抗原性的检测

为研究丙型肝炎病毒 (HCV)包膜蛋白E2在原核细胞和真核细胞中的表达 ,并对表达蛋白的抗原性进行检测。将HCVE2区N端的一段基因分别克隆入原核表达载体pQE30和真核表达载体pEF1/HisC中进行E2蛋白的表达 ,采用ELISA和WB对表达蛋白的抗原性进行检测。结果在原核细胞和真核细胞中均表达了预期大小的蛋白 ,能同HCV感染者血清发生特异性反应。提示该段E2基因在原核表达系统和真核表达系统均能表达出具有抗原活性的蛋白 ,其中真核细胞表达的蛋白可被糖基化。

EB病毒-潜伏膜蛋白1致瘤机制的研究进展

EB病毒的感染与B细胞及上皮细胞来源的肿瘤密切相关,尤以致瘤基因潜伏膜蛋白1较为重要,其分子致瘤作用及机制的探讨一直是EB病毒致瘤机制研究领域中令人关注的焦点,而在临床上的应用也取得了颇具意义的进展。现就EB病毒-潜伏膜蛋白1致瘤的主要分子机制及进展作一综述。

丙型肝炎病毒E2蛋白结合蛋白的酵母双杂交筛选研究

HCV的包膜蛋白E2 (E2 )的生物学特性与HCV感染的慢性化和抗病毒免疫关系极为密切。为了进一步阐明这个多功能蛋白质与宿主蛋白的关系 ,采用酵母双杂交系统 3,在酵母细胞融合蛋白表达型人肝cDNA文库中进行筛选 ,得到 76个与E2特异性结合的阳性克隆 ,包括人类肝细胞癌相关抗原、硒结合蛋白、核苷传送系统、果糖磷酸激酶等 2 6种已知功能蛋白质基因和 14个未知功能基因。本研究结果为阐明E2在HCV致病中的作用提供了重要研究线索。

外源突变型p53和潜伏膜蛋白1基因在转基因鼠不同器官组织中的表达

目的:观察转基因小鼠鼻腔、鼻咽、肺、食道、胃、大肠、肝、肾、脾中外源突变型p53m t和潜伏膜蛋白1基因的表达情况。方法:实验于2005-03/04在湖南中医学院中西医结合系基础研究室完成。选取4月龄转p53m t和潜伏膜蛋白1基因F0代小鼠1只,以正常同龄未转基因C57BL/6J小鼠4只作为对照。采用免疫组化分别检测转基因鼠和对照鼠鼻腔、鼻咽、肺、食道、胃、大肠、肝、肾、脾中p53m t和潜伏膜蛋白1基因的表达强度,用图像分析系统测定阳性反应物的平均灰度值。系统设定白色最大灰度为256,黑色最小灰度为0。灰度值越小,代表阳性反映程度越高。结果:实验纳入转基因鼠1只,对照鼠4只,均进入结果分析。①蛋白质阳性表达信号的定位分布:转基因鼠p53m t和潜伏膜蛋白1基因的免疫组化阳性信号均为棕黄色的颗粒或斑块,表达量高,p53m t蛋白绝大部分分布于细胞膜和胞浆内,少数位于细胞核中。对照鼠p53mt蛋白在组织中呈弱表达,潜伏膜蛋白1的蛋白阳性信号主要位于上皮细胞的细胞膜和胞浆中。②转基因鼠和对照鼠不同组织部位中p53m t基因表达的平均灰度值:转基因鼠食道、肝、脾中平均灰度值较高(131.75±17.25,135.15±13.14,139.42±11.55),在鼻腔黏膜、鼻咽组织、大肠中平均灰度值较低(96.61±12.43,109.26±9.90,109.45±6.72)。除了胃、脾外,各组织部位与对照鼠比较均有显著差异(P<0.05)。③转基因鼠和对照鼠不同组织部位中潜伏膜蛋白1基因表达的平均灰度值:转基因鼠鼻咽部平均灰度值最低(106.75±19.57),其次为鼻腔、食道、肺、胃,而在大肠、肝、脾中表达水平较高(152.29±12.17,134.98±17.79,158.35±10.75)。除鼻腔、大肠、肝、脾外,各组织部位中潜伏膜蛋白1基因的表达水平与对照鼠比较均有显著差异(P<0.05)。④转基因鼠不同组织部位中p53mt基因与潜伏膜蛋白1基因表达水平的相关性分析:转基因鼠鼻腔黏膜、鼻咽组织、食道、肺、胃、大肠、肝、肾、脾中潜伏膜蛋白1基因表达水平和p53m t基因表达水平无相关性(相关系数｜r｜分别为0.744,0.459,0.589,0.722,0.258,0.252,0.337,0.111,0.209)。结论:外源突变型p53m t基因在转基因鼠鼻腔、鼻咽和大肠中表达水平较高,潜伏膜蛋白1基因在鼻咽组织中表达呈最高。两种基因在不同器官组织部位的表达均存在显著性差异,尤以潜伏膜蛋白1基因表达的组织特异性较强,但两种基因的表达不存在相关性。

霍奇金淋巴瘤潜伏膜蛋白1、p53及bcl-2蛋白的表达及意义

目的探讨EB病毒潜伏膜蛋白(LMP1)、p53、bcl-2的蛋白表达在霍奇金淋巴瘤(HL)致病机制中的作用及其意义。方法对收集的31例石蜡包埋的HL组织进行LMP1、p53、bcl-2蛋白免疫组化染色。结果LMP1、p53、bcl-2的阳性率分别为58.1%、61.3%、35.5%。LMP1与p53相关性分析具有统计学意义。结论p53可能参与LMP1在HL致病机制中的作用,bcl-2可能与HL的致病关系不大。

乙脑病毒E蛋白的原核表达、纯化及初步鉴定

目的:构建乙脑病毒(JEV)E蛋白重组载体并在原核细胞BL21(DE3)中表达.方法:采用RT-PCR扩增片段,定向克隆入pET28a(+)中;重组载体pET28a-6His-E转化BL21(DE3),通过酶切、SDS-PAGE和Western Blotting检测其载体构建和蛋白表达;表达产物包涵体经Ni-NTA亲和层析纯化.结果:构建得到原核融合重组载体pET28a-6His-E;诱导后表达得到6His-E融合蛋白,纯化得到表达产物并进行了初步的鉴定.结论:表达并纯化得到JEVE蛋白原核表达产物.

转乙型肝炎病毒表面抗原基因小鼠肝细胞质膜蛋白质组学研究

目的分析转HBsAg基因小鼠与正常小鼠肝细胞质膜的差异蛋白质组，为了解乙型肝炎发病机制，寻找药物作用靶标提供指导。方法构建6月龄转HBsAg基因C57小鼠模型，检测转基因组小鼠和正常对照C57小鼠肝脏病理变化。以转基因组和正常对照C57小鼠肝脏为材料，蔗糖密度梯度离心结合磁珠纯化法纯化肝细胞质膜，Western印迹验证纯化的质膜组分纯度，二维凝胶电泳结合ImageMaster软件图像分析质膜蛋白质，获得的差异蛋白质点经胰酶酶切后，进行差异蛋白质的液相色谱串联质谱分析鉴定。结果转HBsAg基因小鼠肝脏呈现肝炎表现，而正常对照C57小鼠肝脏未见异常。蔗糖密度梯度离心结合磁珠纯化法可以有效富集小鼠肝质膜组分，并减少线粒体的污染。小鼠肝脏质膜组分中，共获得30个≥2倍的差异蛋白质点，成功鉴定到11个可能与HBV感染相关的差异蛋白质，其中9个蛋白质在转基因鼠肝质膜中表达上调，2个蛋白质表达下调。这些差异蛋白质包括细胞支架蛋白、心脏钙离子释放通道蛋白、细胞色素B5和ATP合成酶a亚基等。结论本研究鉴定了一批与HBsAg基因表达相关的小鼠肝脏质膜蛋白质，它们可能是乙型肝炎的药物作用靶标，本研究将为进一步探讨HBV感染的机制提供指导。

血清乙型肝炎病毒包膜大蛋白检测与病毒复制的相关性研究

目的 通过检测慢性乙肝患者血清包膜大蛋白（HBV large envelope protein,HBV-LP）、乙肝病毒DNA（HBV DNA）和乙肝病毒e抗原（HBeAg）,探讨HBV-LP对于反映体内乙肝病毒复制的意义.方法 对623例慢性乙肝患者血清标本采用酶联免疫吸附试验检测HBV-LP和HBeAg,实时荧光定量PCR检测HBV DNA.结果 慢性乙肝患者HBV-LP和HBV DNA阳性率明显高于HBeAg阳性率（Х^2=22.3和9.4,P＜0.01）,HBV-LP和HBV DNA阳性率比较差异无统计学意义（Х^2=2.8,P＞o.05）,HBeAg阳性或阴性患者血清HBV-LP和HBV DNA阳性率比较均差异无统计学意义（Х^2=3.2和0.6,P＞0.05）.血清HBV-LP含量与HBV DNA拷贝数呈正相关（r=0.874,P＜0.01）,在不同HBV DNA拷贝数组别间,HBV-LPA值差异有统计学意义（F =6.987,P＜0.01）.100例健康对照者,其血清HBV DNA及HBV-LP测定结果均为阴性.结论 HBV-LP检测血清的灵敏度高于HBeAg,慢性乙肝患者血清HBV-LP与HBV DNA复制密切相关,可作为反映HBV复制的指标.

丙型肝炎病毒包膜糖蛋白高变区1多抗原肽设计及免疫原性的研究

目的 应用多抗原肽 (MAP)研究丙型肝炎病毒包膜糖蛋白高变区 1(HVR1)的抗原性。方法 根据已经获得的HCV BJ株E2 /NS1区氨基酸序列 ,参照国内外学者所报道的HCVHVR1序列及抗原性参数 ,设计并合成含HCVHVR1390— 411aa序列 2 2个氨基酸的线性表位多肽 (以LP表示 )及MAP(对称 8分枝 ) ,分别以LP和MAP免疫Balb/C小鼠及家兔 ,比较其免疫原性。结果 MAP免疫原性明显强于LP ,抗体滴度 1∶40 96 0 ,而LP免疫组为 1∶12 80。结论 MAP的构型优势能明显提高HCVHVR1合成多肽抗原的免疫原性 ,提示MAP可用于HCV分子疫苗的设计。

埃博拉病毒包膜糖蛋白进化特征分析

目的研究埃博拉病毒包膜糖蛋白的进化和变异特征。方法从美国生物信息中心（NCBI）数据库选取1976至2014年埃博拉病毒包膜糖蛋白氨基酸序列100条，通过多序列比对和蛋白进化树分析埃博拉病毒包膜糖蛋白的进化和变异特征。结果1976至2014年，不同亚型埃博拉病毒包膜糖蛋白氨基酸序列间的同源性为54．00％～65．00％，同亚型包膜糖蛋白氨基酸序列同源性为95．00％～100．00％。2014年在不同地域分离到的同亚型埃博拉病毒的包膜糖蛋白氨基酸序列并不完全一致，但是变异很小，同源性达到了99．70％～100．00％。2014年来自塞拉利昂的扎伊尔一埃博拉病毒包膜糖蛋白氨基酸同源性达到了100．00％，但是来自几内亚的三条扎伊尔一埃博拉病毒糖蛋白氨基酸序列有一定变异。不同亚型埃博拉病毒包膜糖蛋白分别在进化树的不同分支上：2014年分离自塞拉利昂的扎伊尔一埃博拉病毒包膜糖蛋白在一大分支上；1976至2014年分离自塞拉利昂以外国家的扎伊尔一埃博拉病毒糖蛋白在另一个大分支上。结论埃博拉病毒包膜糖蛋白氨基酸变异具有时间性和地域性。2014年流行于不同地域的扎伊尔一埃博拉病毒可能是同一来源的两个不同变种，没有迹象表明不同亚型埃博拉病毒之间具有“混合杂交现象”发生。

酵母双杂合体系研究丙型肝炎病毒进入肝细胞的受体

目的 :用酵母双杂合体系筛选肝细胞cDNA文库 ,寻找与丙型肝炎 (丙肝 )病毒 (hepatitisCvirus ,HCV)胞膜蛋白 2 (E2 )相作用蛋白的基因 ,探讨HCV与肝细胞的相互作用 ,寻找HCV进入细胞的受体。方法 :以HCVE2蛋白胞外区片段 ,构建酵母双杂合体系中“饵”载体 ,从成人肝细胞cDNA文库筛选与HCVE2相作用蛋白的基因。结果 :筛出的阳性克隆基因序列分析后 ,经GenBank查询 ,与人的apoCⅢ同源 ,同源性为 98%。 结论 :HCVE2蛋白能与人的apoCⅢ在酵母双杂合体系中结合 。

急性感染期内恒河猴外周血中人/猴嵌合免疫缺陷病毒包膜蛋白的N糖基化位点分析

目的：分析人/猴嵌合免疫缺陷病毒（SHIVSF162P3）包膜蛋白N糖基化位点的数量和分布及病毒传播能力。方法两只雌性成年（4周岁）中国恒河猴，编号Rh1和Rh2，体重分别为4和5 kg。通过静脉攻毒的方式向Rh1和Rh2接种SHIVSF162P3，每只剂量为300半数组织培养感染剂量，在攻毒后第3、7、10、14、17、21、24、28、35、42、49、56、63、70和77天采集血液样本。对样本进行病毒RNA抽提和cDNA合成，采用实时荧光定量PCR测定病毒RNA水平。对攻毒后第7、14、28和77天的血浆样本进行单基因组扩增，使用Bio-edit中的Clustal W软件进行包膜蛋白全长多序列比对，用MEGA6.06软件计算配对差异距离，采用HIV Databases中的软件计算包膜蛋白N糖基化位点和可变区氨基酸数目，比较序列多样性、N糖基化位点数量的差异。结果从接种的病毒中共扩增得到55条包膜蛋白全长序列，其核苷酸序列平均配对差异距离为（0.1666±0.0963）%。病毒载量在攻毒后第10天达到峰值，lg转换值分别为7.68和7.49拷贝/ml；在攻毒后第42天，病毒载量达到调定点，lg转换值分别为4.27和4.81拷贝/ml。攻毒后第7天，Rh1和Rh2血样中包含25个N糖基化位点的病毒包膜蛋白序列的比例分别达到83%（20/24）和94%（29/31），高于接种病毒中的比例[49%（27/55）]。随着感染时间的延长，Rh1和Rh2血浆中SHIVSF162P3病毒包膜序列的多样性逐渐增大，包含25个N糖基化位点的包膜蛋白序列比例逐渐降低，包含27个N糖基化位点病毒所占比例逐渐升高；在第28天Rh1体内包含27个N糖基化位点的序列比例达到29%（6/21），Rh2在第77天达到35%（13/37）。V1~V5区糖基化位点分析发现，N糖基化位点数目的变化主要来自于V4区。与包含27个糖基化位点的包膜蛋白序列相比，包含25个糖基化位点的病毒包膜蛋白序列在V4区缺失7个氨基酸（TWNNTIG），导致V4区在392位和396位缺少2个N糖基化位点。结论 V4区低糖基化的SHIVSF162P3在传播过程中占优势地位；而随着感染时间的延长，V4区高糖基化的SHIVSF162P3逐渐在猴体内获得复制优势。

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2中关键组氨酸位点突变体的构建与感染性

目的构建组氨酸(Histidine)位点突变的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)突变体,并检测其感染性。方法利用定点突变技术,分别将HCV包膜蛋白E2第490位和第621位的组氨酸突变为丙氨酸(Alanine),构建突变质粒H490A和H621A,采用T7体外转录法制备病毒RNA,通过电穿孔法导入Huh7.5.1细胞,免疫荧光法检测病毒蛋白的表达、电穿孔效率及细胞培养上清的感染性。结果 H490A和H621A突变型质粒经酶切及测序鉴定构建正确;体外转录获得的野生型与突变型病毒RNA均能在Huh7.5.1细胞中表达病毒蛋白,电穿孔效率高达90%以上;野生型病毒感染细胞培养上清中可检测到HCV阳性细胞,H490A病毒感染细胞培养上清中的阳性细胞数量比野生型明显减少,H621A病毒感染细胞培养上清中未检测到阳性细胞。结论成功构建了组氨酸位点突变的全长表达质粒H490A和H621A,两种突变体病毒的感染性均显著降低。

登革2型病毒与整合素β3相互作用机制的研究

目的观察登革2型病毒(dengue virus serotype2,DV2)感染后及转染DV2病毒蛋白的质粒后,EA.hy926细胞中整合素β3表达规律及表达量的变化,以初步明确DV2与整合素β3的相互作用的可能机制。方法经噬斑法测定DV2在EA.hy926中的增殖规律,并通过间接免疫荧光染色检测DV2感染后及病毒蛋白质粒转染后整合素β3表达量的变化。结果 DV2能够在EA.hy926细胞中增殖,在感染复数为1的条件下,最高病毒滴度为105pfu/ml,出现在感染后第5天,以后随着感染时间延长病毒滴度逐渐下降。DV2感染后整合素β3的表达量增高,且随感染时间的延长有渐增趋势;转染DV2E蛋白可诱导整合素β3的表达,且E蛋白与整合素β3有明显的共存,而DV2的其他病毒蛋白无明显诱导整合素β3表达的作用,且与之无明显共存。结论 DV2感染可诱导EA.hy926细胞整合素β3的表达,而E蛋白可能是DV2与整合素β3相互作用、进而介导病毒进入细胞的重要分子。

血清HBV大、中、小表面蛋白检测的临床意义

本文综述了HBV大、中、小表面蛋白相关研究进展,包括基因结构、特点、检测方法和临床意义等方面。截至目前,关于HBV大、中、小表面蛋白的临床意义尚不明确,亟需进一步研究探讨。

血清乙肝病毒外膜大蛋白检测及其与病毒复制的关系

目的探讨血清乙型肝炎病毒外膜大蛋白(LHBs)检测对于判定乙型肝炎病毒(HBV)复制的临床意义。方法分别采用ELISA法、时间分辨免疫荧光分析法和实时荧光定量PCR法检测340份慢性乙型肝炎患者血清中LHBs、Pre-S1蛋白、HBV-M和HBVDNA,并进行相关性分析。结果340份慢性乙型肝炎患者血清中LHBs水平与HBVDNA拷贝数变化相一致,两者呈正相关(r=0.899,P=0.038);在不同模式的HBeAg血清中,LHBs与HBVDNA的阳性率差异均无统计学意义(P均>0.05);HBVDNA阳性血清中LHBs阳性率(83.15%)明显高于Pre-S1蛋白和HBeAg的阳性率(50.54%和54.48%),差异有统计学意义(P均<0.05)。结论血清LHBs水平能反映HBV感染者体内HBV复制程度,其灵敏度高于Pre-S1蛋白和HBeAg,可作为判断HBV复制新的血清学指标。

乙型肝炎病毒基因型和DNA载量与外膜大蛋白关系研究

目的探讨乙型肝炎病毒基因型和DNA载量与外膜大蛋白关系。方法采用荧光定量PCR方法、ELISA法和时间分辨免疫荧光分析法分别检测140例慢性乙型肝炎患者血清中HBV DNA、LHBs（Hepatitis B Virus Large Envelope Protein，LHBs）和HBV血清标志物，对HBV DNA阳性标本进行基因测序鉴定基因型，并进行相关性分析。结果HBV LHBs与HBV DNA阳性率在HBeAg阴性和阳性组中差异均无统计学意义（P〉0．05）；HBV LHBs吸光度A值与HBV DNA载量存在良好的相关性，相关系数为0．9267；乙型肝炎病毒B、C基因型间HBV-LHBs吸光度A值差异无统计学意义（P〉0．05）。结论血清LHBs水平与HBV DNA载量存在良好的相关性，能反映HBV感染者体内HBV复制程度，可作为判断HBV复制新的血清学指标；HBV LHBs的含量与HBV基因型无关。

EB病毒潜伏膜蛋白2的B细胞表位免疫原性研究

目的 分析EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白2（LMP2）B淋巴细胞表位的免疫原性.方法 利用生物信息学技术筛选出EBV LMP2可能的优势B淋巴细胞表位LMP2199-209、LMP2318-322和LMP2381-391,将其相应基因片段分别克隆至pET32a（＋）载体并转化至大肠埃希菌BL21（DE3）菌株诱导表达,表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白免疫印迹分析鉴定,通过Ni-NTA离子螯合亲和层析柱纯化.分别以纯化的表位蛋白作为免疫原,皮下多点注射BALB/c小鼠,设pET32a（＋）蛋白和PBS为对照.分别以3个表位蛋白作包被抗原,ELISA法检测第0、3、6周小鼠血清中相应表位特异性抗体IgG,并于免疫后第6周检测各免疫组小鼠血清抗体识别天然EBV抗原的能力.结果 在原核表达体系中分别获得了表位LMP2199-209、LMP2318-322和LMP2381-391融合表达产物.纯化的表位蛋白免疫小鼠,血清中分别能检测到相应的表位特异性抗体IgG,其抗体水平随着免疫次数的增加而呈现逐渐升高的趋势,表位LMP2318-322免疫组第3、6周小鼠血清抗体显著高于pET32a（＋）蛋白对照组（F=493.85、773.99,均P＜0.05）,LMP2381-391免疫组第3、6周抗体水平亦显著高于pET32a（＋）蛋白对照组（F=926.33、309.14,均P＜0.05）,而表位LMP2199 209免疫组至第6周特异性抗体高于pET32a（＋）蛋白对照组（F=87.27,P＜0.05）.3个表位蛋白免疫小鼠血清抗体IgG均能识别EBV天然抗原,以表位LMP2199-209和LMP2381-391免疫组抗EBV-IgG生成水平尤为显著.结论 筛选的EBV LMP2可能的优势B淋巴细胞表位LMP2199-209、LMP2318-322和LMP2381-391通过原核表达体系中制备的表位蛋白,具有较好的免疫原性,可进一步用于EBV感染及其相关肿瘤表位疫苗的研究.