人免疫缺陷病毒跨膜蛋白gp41在大肠杆菌中的表达

为研究廉价的 HIV血清学诊断系统 ,实现检测试剂国产化 ,用原核 p ET系统表达 HIV跨膜蛋白 gp41 .研究发现 ,全长及缺失 C端 1 / 3的 gp41在 E.coli中均不能有效表达 .仅保留 N端 1 / 3的 gp41 (包含 gp41主要抗原决定簇 ,5 94～ 61 3氨基酸 )有一定量的表达 ;通过金属螯合层析 ,产物得到部分纯化 ;Western blot显示产物有很好的反应原性 .推测 gp41在 E.coli中较低表达量可能与 m RNA的二级结构有关 .

HIV-1包膜蛋白gp41单克隆抗体研究进展

HIV- 1gp4 1在病毒侵入早期 ,发挥重要作用。针对 gp4 1的单克隆抗体作为一种良好的工具广泛地应用于以 gp4 1为靶点的抗 HIV- 1药物和疫苗研究工作中。

HIV-1包膜蛋白gp41优势抗原的构建及可溶性表达

目的:筛选1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)中国流行株中包膜蛋白gp41的优势抗原片段,构建具有区域流行代表性的HIV-1 gp41重组抗原,为改进现有HIV-1初筛试剂盒中使用的同类抗原奠定基础。方法:利用免疫斑点杂交和生物信息学方法,从收集自重庆、广州、上海的区域代表性150份HIV-1感染者血清标本中筛选gp41抗原性强的候选样本,利用RT-PCR及巢式PCR方法扩增包含重要抗原表位决定蔟的gp41基因片段,与原核表达载体pQE30连接,转化大肠杆菌M15构建gp41重组抗原表达菌株,表达后经亲和层析纯化、SDS-PAGE和Western印迹鉴定。结果:兔源HRP标记的gp41多抗能识别标本中gp41抗原性差异,得到候选样本,扩增包含gp41主要抗原表位片段;构建了包含gp41抗原表达簇的重组原核表达质粒,表达、纯化后经His标签抗体Western印迹鉴定为阳性。结论:高纯度的重组优势gp41抗原的构建和鉴定,为进一步改进现有HIV初筛诊断奠定了基础。

HIV跨膜蛋白gp41和gp36原核表达及抗原性研究

目的构建HIV跨膜蛋白gp41和gp36原核表达载体,诱导表达HIV抗原,为HIV快速诊断和蛋白疫苗研究提供材料基础。方法用PCR方法对HIV-1包膜蛋白gp41和HIV-2包膜蛋白gp36基因序列进行全长、截短扩增,分别或以融合表达方式克隆入原核表达载体pQE30、pET32a（＋）及pGST-MOLUC,重组质粒经异丙基硫代半乳糖苷（isopro-pyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导表达,并经Ni-NAT或谷胱甘肽-Sepharose-4B层析柱亲和纯化HIV跨膜糖蛋白抗原,对获得的纯化抗原进行Western blot检测,利用HIV抗原制备ELISA检测试剂盒,并分析HIV临床样本。结果成功构建了HIV包膜蛋白的原核表达载体,利用亲和层析纯化得到了纯度较高的HIV包膜蛋白;Western blot分析结果证实表达纯化的HIV跨膜蛋白gp41（aa.538~718）、gp36（aa.533~764）以及gp41-gp36均能和HIV阳性血清反应;ELISA试剂盒检测临床样本显示,特异性达95%以上,灵敏度达100%。结论获得了有生物学活性的HIV截短包膜蛋白,并可用于HIV快速检测试剂盒的研发。

HIV-1跨膜蛋白gp41重组抗原的表达及其免疫反应性

目的为开发和建立敏感、特异的抗HIV-1抗体的检测方法研制重组gp41抗原。方法根据HIV-1的基因序列,设计并合成了1对PCR扩增引物,应用PCR技术从HIV-1外膜基因组中扩增出HIV-1的gp41截短体,将扩增的基因片段插入质粒pET-28a中构建成重组表达质粒pET-gp41。诱导表达并纯化gp41重组抗原,对gp41进行了初步应用分析。结果gp41在大肠埃希菌BL21(DE3)中获得高表达,表达量占菌体总蛋白量的26.08%。纯化后截短体gp41的纯度为97.94%。经间接ELISA和免疫印迹检测,纯化后的表达产物gp41具有很高的抗原特异性和免疫反应性。结论研制的重组抗原gp41有较强的抗原性和潜在的应用价值。

应用疏水层析纯化HIV-1跨膜蛋白gp41截短体包涵体

目的对表达HIV-1跨膜蛋白gp41截短体包涵体进行纯化。方法将收获的表达菌体洗涤、超声波破菌、预处理后进行疏水层析。结果纯化后的gp41截短体的融合蛋白纯度达到90％,并且具有较好的抗原性和特异性。结论利用疏水层析可以将目的蛋白进行有效的纯化,为下一步的应用打下基础。

基于跨膜蛋白gp41为作用靶点的抗HIV-1药物研究进展

高效抗逆转录病毒治疗法(highly active antiretroviral therapy,HAART)是当今抗人免疫缺陷病毒(HIV)感染的主要方法,随着HAART的广泛应用,诸如药物交互作用、不良反应和耐药毒株等问题也相继出现,因此人们致力于其他抗HIV药物的研究。gp41是HIV-1病毒表面的一种包膜糖蛋白,介导了病毒膜和宿主细胞膜间的融合,在HIV-1的侵染过程中起了关键作用。基于gp41为相关靶点的HIV-1融合抑制剂是近年来抗HIV-1药物研究的热点。概述gp41的结构及融膜机制,并对gp41为作用靶点的抗HIV-1药物的研究文献,及其研究进展做了分析。

以跨膜蛋白gp41为作用靶点的抗HIV-1药物研究进展

当今抗人免疫缺陷病毒(HIV)感染的主要方法是高效抗逆转录病毒治疗法(HAART),它为艾滋病患者提供了最好的希望,因为它阻断了HIV病毒的复制过程,改善患者的生命质量并延长生存。但随着HAART的广泛应用,诸如不良反应和耐药毒株等问题也相继出现,因此人们致力于其他抗HIV药物的研究。以跨膜蛋白gp41为相关靶点的HIV-1融合抑制剂是近年来抗HIV-1药物的研究热点。本文对HIV-1进入抑制剂中HIV融合抑制剂,gp41的结构及融膜机制等进行了介绍,并以gp41为作用靶点的抗HIV-1药物的研究进展作一概述。

T淋巴细胞相关蛋白、gp41、磷酸化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C-γ在人类免疫缺陷病毒感染患者中的表达及相关性分析

目的分析T淋巴细胞相关蛋白(MAL)、gp41、磷酸化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C-γ(pPLC-γ)在人类免疫缺陷病毒(HIV)感染患者中的表达及相关性。方法选取2020年4月至2021年4月首都医科大学附属北京佑安医院收治的70例HIV感染患者作为观察组,另外选取同期进行健康体检的70例志愿者作为对照组。通过实时荧光定量聚合酶链反应检测两组MAL表达,通过流式细胞仪检测两组gp41、pPLC-γ表达。分析MAL、gp41、pPLC-γ的表达变化与HIV感染的相关性。结果与对照组相比,观察组MAL表达下降,gp41、pPLC-γ表达上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。MAL、gp41、pPLC-γ表达与患者年龄、性别无关(P>0.05),MAL、gp41、pPLC-γ表达与患者HIV阳性时间、是否服用抗病毒药物、临床症状相关(P<0.05)。MAL与gp41呈负相关(r=-0.637,P=0.001);MAL与pPLC-γ呈负相关(r=-0.601,P=0.001);gp41与pPLC-γ呈正相关(r=0.693,P=0.001)。三项联合对HIV感染的诊断价值高于MAL、gp41、pPLC-γ单项诊断(P<0.05)。结论HIV感染患者MAL表达下降,gp41、pPLC-γ表达上升,MAL、gp41、pPLC-γ与患者HIV阳性时间、临床症状、是否服用抗病毒药物有关,其可能参与了HIV感染的发生、发展,可为HIV临床诊断提供参考。

人类免疫缺陷病毒包膜糖蛋白gp41核心结构的药物研究

人类免疫缺陷病毒(HIV)包膜糖蛋白gp41在病毒包膜和靶细胞膜的融合过程中发挥重要作用。本文叙述了C多肽抑制剂研究成果、HIVgp41核心结构的特征及作用于gp41核心结构的抗HIV药物研究的最新发展。可望在不久的将来,研制出针对HIV gp41核心结构的新的抗病毒药物用于治疗和预防HIV-1感染和AIDS。

豆天蛾核型多角体病毒gp41同源基因的克隆和序列分析

目的对豆天蛾核型多角体病毒(CbNPV)的gp41同源基因进行克隆和序列分析,为进一步研究该病毒基因组的结构打下基础。方法从豆天蛾幼虫尸体中分离纯化了豆天蛾核型多角体病毒,提取其基因组DNA,用shotgun法构建了DNA片段的文库,并进行了全基因组测序。对CbNPV的gp41同源基因进行序列分析。结果CbNPV的gp41同源基因长度为933bp,编码310个氨基酸。氨基酸序列同源性分析结果表明,CbNPVGP41与I类NPV及II类NPVGP41的同源性分别为53%～61%和56%～73%。结论初步推测,CbNPV与II类NPV的亲缘关系可能更近。

HIV-1膜蛋白基因片段杆状病毒转移载体克隆及重组体的构建

目的 构建编码HIV 1外膜糖蛋白的gp12 0和gp4 1基因杆状病毒转移载体 ,并在昆虫细胞中表达gp12 0和gp4 1重组蛋白。方法 从HIV 1基因克隆PNL4 3(NY5 /LAV)中应用聚合链反应扩增目的基因gp12 0和gp4 1,克隆到PGEM T载体中,限制性内切酶酶切、DNA序列分析鉴定目的基因 ,再经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后定向克隆到杆状病毒转移载体PACSecG2T中 ,再次测序鉴定。通过在sf9昆虫细胞中同源重组、空斑筛选、病毒鉴定、SDS PAGE、Western blot对重组病毒和重组蛋白进行分析。结果 限制性内切酶酶切和DNA序列分析表明 ,gp12 0和gp4 1正确克隆到杆状病毒转移载体PACSecG2T中 ;SDS PAGE和Western blot结果表明在昆虫细胞中成功表达了HIV外膜糖蛋白gp12 0和gp4 1。结论 成功构建了PACSecG2T gp12 0和PAC SecG2T gp4 1杆状病毒转移载体 ,并在杆状病毒 昆虫细胞表达系统中表达了HIV 1gp12 0和gp4 1重组蛋白 ,Wes tern

利用 gp41蛋白的合成肽抗原检测 HIV-1抗体

采用固相多肽合成技术对人免疫缺损病毒-1型(HIV-1)gp41蛋白的一段代表优势抗原表位的22肽进行了化学合成,经反相高效液相层析(HPLC)和多肽序列测定表明,合成肽成品均质性良好,其氨基酸序列与设计相符。利用该合成肽作为包被抗原,以间接 ELISA 法检测 HIV-1血清抗体,其特异性、灵敏性和重复性均达到与国外生产的 gp41合成肽抗原相同的水平.

茶尺蠖核型多角体病毒SalI 1·1 k片段的克隆及gp41部分序列分析

茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)是尚未完成基因组测序的一种杆状病毒。为了解其基因组的信息,从病虫中分离纯化了茶尺蠖NPV,提取基因组DNA,构建了EoNPV DNA的SalI酶切片段文库,并对阳性克隆进行测序,获得了EoNPVgp41基因的部分序列。序列同源性分析结果表明,EoNPV与LdMNPV之间gp41基因的同源性较高,而与AcMNPV及BmNPV的同源性较低。

家蚕核型多角体病毒gp41基因的融合表达及功能鉴定

为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedro virus,BmNPV)中GP41蛋白的包装功能,从BmNPV基因组中克隆了gp41基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1-gfp中,构建重组转移载体pFastBac1-gp41-gfp,再利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)筛选重组杆状病毒,在家蚕BmN细胞系中进行融合表达和定位分析。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,经重组杆状病毒r-gp41-gfp感染的BmN细胞新增一条大小为65 kD左右的蛋白条带,证明该融合蛋白在BmN细胞中成功表达。用激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光充满于细胞质中,不能形成聚集体。与野生型BmNPV混合感染的实验也表明荧光出现的位置与多角体无关,说明GP41-GFP蛋白不能附着在多角体表面,融合表达可能影响了GP41蛋白与多角体的结合。

HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp41基因真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型包膜糖蛋白gp41基因并构建真核表达载体,进一步为制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以克隆好的HIV-1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gp41基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5′端分别引入KpnⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性的扩增gp41基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gp41编码基因的真核表达载体,并进行酶切及测序鉴定分析pcDNA 3.1(+)/gp41。结果重组质粒经KpnⅠ,XhoⅠ双酶切成5.4 kb与1.0 kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了gp41基因片断,测序结果表明编码框正确。结论成功构建了HIV-1 B亚型包膜糖蛋白gp41基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/gp41。

人类免疫缺陷病毒1型gp41结构与功能的研究进展

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)通过其包膜糖蛋白(Env)介导侵入靶细胞。Env由受体特异性结合单位gp120和膜融合单位gp41组成。HIV-1的gp41分为3个功能区:膜外区、跨膜区和膜内区。膜外区是病毒感染时膜融合的主要结构基础;跨膜区通过疏水残基使Env锚定在脂质膜上;膜内区则表现多重功能,参与病毒的感染、复制、装配等过程。膜内区的功能由其特定的结构域或基序完成,包括3个慢病毒裂解肽(LLP-1、LLP-2、LLP-3)、含Tyr基序(Y712XXL和Y802W803)和双Leu基序(LL855/856)等。病毒诱导的融合过程中,包含Kennedy表位在内的膜内区发生拓扑学改变,表明gp41的3个功能区之间存在相互作用。这些进展对了解HIV-1的感染、复制和致病机制,开发新的抗病毒药物具有重要意义。

棉铃虫病毒gp41基因的克隆表达及抗体制备

根据棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(Helicoverpa armigerasingle nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HaSNPV)gp41基因的序列,设计引物,引入适当的酶切位点,通过PCR的方法扩增目的片段。将扩增出的基因片段克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组质粒并转化至大肠杆菌中,经IPTG诱导表达。纯化蛋白产物并免疫家兔产生抗血清。该抗血清可与原核表达的His-GP41融合蛋白及在感染的昆虫细胞中表达的GP41蛋白发生特异性免疫反应。该抗体的获得为深入研究GP41的功能提供了基础。

二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体的构建及原核表达

目的构建二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,构建含二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体突变基因质粒pUC57-d41,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,定向插入pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用SDS-PAGE、Western blot鉴定表达产物。对目的蛋白进行纯化和复性,并进行抗原结合活性及相对稳定性检测。结果重组载体pET-d41经酶切鉴定,证实构建正确。表达产物相对分子质量约为28000,与理论预期值完全相符。目的蛋白最高表达量可占菌体总蛋白的45.48%。经Ni-NTA亲和层析法纯化并复性后,蛋白纯度达95%以上,抗HIV-1 gp41 dsFv具有抗原结合活性,稳定性优于scFv。结论已成功构建了二硫键稳定的抗HIV-1 gp41单链抗体(dsFv)基因原核表达载体,并获得表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

杜仲抗HIV gp41活性部位的研究

目的:研究杜仲活性成分对HIV gp41六股螺旋束的抑制作用,为寻求新的抗HIV病毒进入抑制剂提供实验依据。方法:杜仲萃取物配制成1 mg/ml的样品液,用高效液相色谱法检测样品对HIV gp41六股螺旋束结构形成的抑制作用,并采用酚试剂法检测样品中鞣酸含量。结果:杜仲提取物浓度1 mg/ml可有效降低gp41峰高,1mg/ml的样品中含鞣酸10μg/ml。结论:杜仲可抑制HIV gp41六股螺旋束的形成,其有效成分可能不包括鞣酸。