应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白

目的 通过筛选乙型肝炎病毒 (HBV)核心启动子 (corepromoter)结合蛋白 ,为HBV复制机制的研究探索新的途径。方法 应用噬菌体表面展示技术 ,以HBV核心启动子的聚合酶链反应产物作为固相筛选分子 ,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行 5轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选过程 ,经噬斑的PCR扩增后 ,构建克隆载体 ,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果 噬菌体经富集后 ,从随机筛选的 2 0个克隆中得到 6个阳性克隆 ,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索 ,确定了和HBV核心启动子结合的肝细胞蛋白———羧肽酶N(CPN)。结论 用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HBV核心启动子的结合蛋白 ,分析了该蛋白的编码基因 ,为进一步研究HBV的复制机制创造了新的途径。

乙型肝炎病毒c基因启动子变异与血清HBeAg及HBV DNA的关系

目的 :研究乙型肝炎病毒 (HBV ) c基因启动子 (BCP)变异与 e抗原及 HBV DNA含量的关系。方法 :采用错配引物聚合酶链反应 (PCR) -限制性片段长度多态性 (RFL P)分析及荧光定量 PCR(FQ- PCR)对 10 5例血清 HBV DNA阳性 HBV感染者进行 HBV BCP基因变异及 HBV DNA定量测定。结果 :BCP变异组 HBe Ag阴性率为 84 .4 % (5 4 / 6 4 ) ,非 BCP变异组为2 6 .8% (11/ 4 1)。 BCP变异组 HBV DNA含量在 HBe Ag+ 病例 (10 8.79± 0 .85vs 10 7.4 8± 0 .39copy/ ml,P <0 .0 1)及 HBe Ag- 病例(10 8.0 5± 1 .1 6 vs10 6 .55± 0 .91 copy/ ml,P<0 .0 1)中均较非 BCP变异组高。结论 :HBV BCP变异在下调前 c/ c基因表达的同时可能促进 HBV复制 ,对 HBs Ag+ / HBe Ag- 患者需要进一步检测 HBV DNA,以免由于基因变异导致将 HBe

乙型肝炎病毒C基因启动子双变异患者中医证型特点研究

目的:探讨HBVC基因启动子(BCP)双变异慢性乙型肝炎患者的中医证型特点。方法:选择HBsAg阳性慢性乙型肝炎患者168例进行观察。中医证型分为湿热中阻、肝郁脾虚、肝肾阴虚、瘀血阻络、脾肾阳虚5型;BCP双变异检测,采用微板核酸杂交法。结果:BCP双变异的总检出率为36·31%(61/168),其中,湿热中阻型BCP双变异检出率最高(54·24%),与其他各型比较差异均有显著性意义(P<0·052);肝郁脾虚型BCP双变异检出率(36·36%)虽低于湿热中阻型(P<0·025),但却明显高于肝肾阴虚型(13·04%)及瘀血阻络型(10·53%),且差异有显著性意义(P<0·05);肝肾阴虚与瘀血阻络两型BCP双变异检出率均较低,两者比较差异有显著性意义(P>0·05)。结论:HBVBCP双变异的慢性乙型肝炎患者中医证型特点以湿热中阻为主,肝郁脾虚居次,临床治疗要重视清热利湿,舒肝健脾治法或方药的选用。

巨细胞病毒和猴空泡病毒40启动子在中国仓鼠卵巢细胞中驱动基因表达效率比较

目的比较巨细胞病毒(CMV)和猴空泡病毒40(SV40)2种启动子驱动外源基因在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞CHO-K1中的表达效率。方法分别构建由CMV和SV40启动子驱动表达绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体pWTY-02和pWTY-03。用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将表达载体质粒分别转染CHO-K1细胞,倒置荧光显微镜观察转染后CHO-K1细胞中EGFP的表达情况;流式细胞术检测EGFP的荧光强度,以比较2种启动子驱动外源基因表达的效率。结果 2种启动子均能够驱动EGFP在CHO-K1细胞中表达。转染质粒pWTY-02的CHOK1细胞的平均荧光强度明显高于转染质粒pWTY-03的CHO-K1细胞(P<0.05)。结论 CMV启动子在CHO-K1细胞中驱动EGFP的表达效率较高,为后续CHO表达系统中提高外源基因表达效率启动子的选择提供了依据。

花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子在转基因棉花中的表达

利用GUS作为报告基因 ,通过GUS组织化学定位法检测棉花转化愈伤组织、体细胞胚 ,R0 代棉花根、茎、叶、花器官以及正在发育的胚GUS基因表达情况 ,详细阐述了CaMV 3 5S启动子在棉花细胞中的表达轮廓。结果表明 ,在愈伤组织细胞有丝分裂和增殖过程中GUS基因能稳定表达并遗传给后代细胞 ;在根、茎、叶细胞中检测到GUS表达活性。在胚胎发育过程中 ,最早检测到GUS表达活性的为开花 1 1d的鱼雷胚和胚乳。随着胚胎的发育 ,GUS表达活性逐渐增强并扩展到子叶微管组织 ,表明CaMV 3 5S启动子是随着胚胎发育进程被逐渐调节的。在花粉和特殊的纤维细胞中 ,也检测到GUS的表达活性。资料证明 ,该启动子在棉花不同发育时期的大部分组织和细胞中都是表达的。

基于CMV启动子表达鹦鹉热衣原体PmpD-N蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建

为构建表达鹦鹉热衣原体多型外膜蛋白D的N端(PmpD-N)蛋白重组火鸡疱疹病毒(HVT),以鹦鹉热衣原体CB7株DNA为模板,通过PCR扩增pmpD-N基因,构建带有巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达盒,采用细菌人工染色体技术构建HVT重组子,转染细胞获得HVT重组病毒,并在体外评价该重组病毒的相关特性。结果表明,转染细胞后成功获得HVT重组病毒。通过Western blot和IFA分析表明,重组病毒表达了PmpD-N蛋白。Confocal分析表明,PmpD-N蛋白分布在细胞的胞核、胞浆和细胞表面。HVT重组病毒的复制特性和野生型HVT一致。HVT重组病毒能够激活巨噬细胞促炎性细胞因子IL-6和NO的产生。该试验成功构建了含有CMV启动子,能够表达PmpD-N蛋白的HVT重组病毒,为下一步进行动物试验和分析该病毒的免疫效力奠定了基础。

乙型肝炎病毒核心启动子的T^(1762)A^(1764)变异与干扰素疗效的关系

目的为探讨乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)区域T1762A1764变异对干扰素治疗疗效的影响。方法41例HBeAg阳性、HBVDNA阳性及ALT升高的慢性乙型肝炎(CHB)患者给予干扰素治疗,在治疗前后均应用聚合酶链反应(PCR)技术并对其产物直接测序分析,并定期检测肝功能及HBVDNA。结果治疗前41例CHB患者中有22例存在T1762A1764变异,占54%。干扰素治疗6个月后,HBVDNA阴转率在T1762A1764变异株感染患者中显著高于野生株感染的患者(64%vs37%,P<0.01);HBeAg阴转率在变异株感染患者中显著高于野生株感染的患者(55%vs42%,P<0.05);两组ALT复常率差异无显著性(54%vs46%,P>0.05)。在野生株治疗有效的6例患者中有1例患者出现T1762A1764变异株。结论CP区域T1762A1764变异可提高干扰素治疗疗效,干扰素治疗可能会增加T1762A1764变异的机会。

乙型肝炎病毒核心基因启动子变异与血清HBeAg及病毒载量关系的探讨

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)核心基因启动子(BCP)变异与e抗原(HBeAg)及病毒载量的关系。方法(1)研究对象为176例HBV慢性感染者(轻、中、重度慢性乙型病毒性肝炎,肝炎肝硬化,慢性重型肝炎和原发性肝癌)。(2)研究方法:①采用PCR微板核酸杂交结合ELISA检测显示技术,对患者血清进行检测HBVBCP区核苷酸(nt)1762碱基A→T和1764G→A联合突变。②采用PCR结合荧光探针检测技术,检测患者血清乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)含量。③采用ELISA检测技术,检测患者血清HBV标志物(HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBe及抗-HBc)。结果(1)在176例HBV慢性感染者中检出HBVBCP区T1762A1764变异者73例,HBVBCP变异的阳性率为41.5%。HBVBCP变异在HBeAg阴性病例的阳性率为49.4%(44/89),显著高于HBeAg阳性病例的阳性率33.3%(29/87)(P=0.03)。(2)HBVBCP变异阳性组的HBVDNA含量显著高于HBVBCP变异阴性组的含量(P=0.000)。BCP阳性组HBVDNA含量在HBeAg阳性病例及HBeAg阴性病例中均较BCP阴性组高(P=0.000)。结论(1)HBVBCP变异可引起HBV感染者的HBeAg阴转。(2)HBVBCP变异可使HBV致病力增强,病毒复制水平提高。(3)对HBsAg阳性/HBeAg阴性患者需要进一步检测HBVDNA,以免由于基因变异导致将HBeAg阴性者误认为病毒的免疫清除或静息而延误抗病毒治疗时机。

高灵敏度电化学发光PCR方法检测花椰菜花叶病毒35 S启动子

大多数转基因植物中使用花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus,CaMV)35 S作为启动子,因此可通过检测该启动子来判断植物样品中是否含有转基因成分。实验将高灵敏度电化学发光PCR方法用于检测转基因烟草中的CaMV35 S启动子,将该启动子的PCR产物与生物素标记的探针杂交,可以起到特异性筛选产物的作用;与发光标记物——三联吡啶钌标记的探针杂交,从而实现电化学发光检测。两种探针同时与待测样品的PCR产物进行杂交,进一步对样品进行特异性筛选,从而提高了检测的准确性,避免了假阳性结果的产生。实验结果表明:该法可以准确的区分待测样品中是否含有35 S启动子,从而区别转基因烟草和非转基因烟草。电化学发光PCR方法灵敏度高,可靠性强,操作简便,结果准确,有望成为一种高效的转基因植物检测方法。

乙型肝炎病毒基本核心启动子和前C基因序列分析

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)基本核心启动子(BCP)区及前C(PreC)区基因的变异情况,并且分析其发生频率、分布规律及其与临床病情的关系。方法应用套式PCR扩增nt1660-1935的HBV DNA片段及PCR产物直接测序的方法检测BCP区及Pre-C区基因的变异情况。结果130例乙型肝炎患者标本中,BCP区nt1762/nt1764发生双突变者75例(57.69%),Pre-C区nt1896发生突变者20例(15.38%),并且这两种突变在重型肝炎组(75.00%)及肝硬化组(72.22%)所占比例均明显高于慢性肝炎组(52.56%);此外,在BCP区及Pre-C/C区还发现了一些突变频率较高的其他突变位点(如nt1753,nt1766,nt1846,nt1899,nt1915),其中nt1753突变仅发生于有nt1762/1764双突变的患者,与重型肝炎及肝硬化的发生有一定关系;在BCP区有4处核苷酸突变共存者10例,其中重型肝炎组(12.50%)及肝硬化组(13.88%)所占比例明显高于慢性肝炎组(5.12%)。结论HBV BCP区nt1762/nt1764双突变和Pre-C区nt1896突变与肝炎的活动、重型化及肝硬化的发生有关;BCP区其他位点的突变共存对肝炎病情的进展也有重要影响。

原发性肝癌患者乙型肝炎病毒前C区联合基本核心启动子变异的分析

目的:研究原发性肝癌患者乙型肝炎病毒前C区联合基本核心启动子变异情况及与基因型的关系。方法:收集乙型肝病毒感染者血清132份,HBVDNA均阳性,用半巢式聚合酶链反应扩增HBV前C及C基因部分片段,产物纯化后直接测序,检测前CA1896联合BCPT1762/A1764变异。用S基因PCR-RFLP方法确定HBV基因型。结果:乙型肝炎病毒前C区联合基本核心启动子变异在原发性肝癌组的阳性率为41.18%(14/34),显著高于慢性肝病组的11.22%(11/98)(P<0.01)。前C A1896联合BCP T1762/A1764变异在B基因型检出率与C基因型相比,差异无显著性(P>0.05)。结论:乙型肝炎病毒前C区联合基本核心启动子变异与原发性肝癌关系密切,与基因型无相关性。

棉花曲叶病毒反式作用因子AC2对病毒链基因启动子的调控作用

以棉花曲叶病毒(CLCuV)侵染的烟草叶片组织总DNA为模板,通过聚合酶链反应扩增CLCuV反式作用因子AC2并插入克隆载体。将AC2置于CaMV35S启动子下构建了瞬时的表达载体。通过基因枪法将质粒载体导入烟草和棉花叶片细胞中进行瞬时表达。结果表明,在反式作用因子AC2的激活下,病毒链基因启动子的活性明显增强,然而激活后的病毒链基因启动子的活性仍低于互补链基因方向启动子;其表达方式与互补链基因启动子相似,即在叶肉及维管组织均有较高的活性。此外还探讨了AC2应用于植物遗传操作的可能性。

CAG和MLP启动子控制的重组禽腺病毒构建

根据鸡胚致死孤儿病毒(CELOV)的序列设计引物,通过PCR方法扩增了禽腺病毒FAVI-JS株的晚期启动子(MLP),序列与CELOV的MLP同源性为99%。分别构建了MLP和商品化启动子CAG控制的表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因的禽腺病毒转移载体。通过载体与禽腺病毒FAVI-JS株在原代鸡胚肾细胞内进行同源重组,分别获得了MLP和CAG控制的表达eGFP的重组禽腺病毒,为探讨不同启动子对禽腺病毒活载体疫苗免疫效果的影响提供了条件。

不同启动子对HA-VP2重组杆状病毒蛋白表达的影响

为比较不同启动子对传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2蛋白表达的影响,择优表达体系。本研究将添加了表位附加标记HA-TAG的IBDV-VP2基因整合至含有CMV、CBA和EF1α启动子的重组转移载体中,构建HA-VP2重组杆状病毒,并通过侵染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)分析蛋白表达水平,以确定最优启动子。用Gel-Pro analyzer 4.5软件分析Western blotting条带。结果表明,含有CMV、CBA及EF1α启动子的重组杆状病毒所表达的HA-VP2蛋白强度分别为270.61、290.26及83.45,且各启动子活性差异显著(P<0.05),其中CMV与CBA启动子的活性相近能够较高效率地表达HA-VP2蛋白,但EF1α启动子活性较以上2种启动子活性较低。本研究通过比较分析不同启动子对蛋白表达水平的影响,以此择优表达体系,为禽类基因工程疫苗的发展提供新思路。

转录因子腺病毒E4启动子结合蛋白4在肿瘤中的研究进展

腺病毒E4启动子结合蛋白4(E4BP4)是一种含有碱性亮氨酸拉链的转录因子,在乳腺癌、肺癌、甲状腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中高表达,参与肿瘤的发生发展、转移和侵袭,但关于E4BP4在肿瘤研究中的相关综述较少。本文检索并总结相关文献,概述了E4BP4在不同肿瘤发生发展中的作用,为深入研究E4BP4在肿瘤中的作用机制以及基于E4BP4分子治疗靶点的探究提供理论支撑。

电化学DNA传感器制备及用于花椰菜花叶病毒35S启动子快速检测

[目的]构建一种新型DNA电化学传感器,并用于花椰菜花叶病毒35S启动子片段检测。[方法]通过使用氨基化多壁碳纳米管对玻碳电极进行修饰,利用氨基化多壁碳纳米管对硫堇-金纳米粒子-DNA纳米复合物的吸附固定得到用于识别目标DNA的捕获界面,并将亲和素-辣根过氧化物酶修饰的金纳米粒子作为结构末端的信号分子,完成夹心结构传感器组装。试验采用循环伏安法对辣根过氧化物酶催化过氧化氢得到的还原电流进行测试。[结果]该传感器可实现对目标DNA定量检测,线性范围为1×10-18~1×10^(-11)mol/L,检测限低至6.95×10^(-20)mol/L,可特异性识别错配序列,并且表现出良好的重现性和稳定性。[结论]该传感器在转基因食品的检测方面有良好的应用前景。

慢性HBV感染者HBV前C区/基本核心启动子区基因突变与临床应用

目的:探讨2010年10月至2013年6月来我院门诊及住院慢性HBV感染者中HBV前C(Pre C)区/基本核心启动子(BCP)区基因突变与其病程进展的相关性。方法:165例慢性HBV感染者血清生化指标检测,血清HBV DNA含量和HBe Ag定性检测,HBV Pre C区/BCP区突变率比较,分析Pre C区l896、BCP区1762/1764变异在HBV携带者(As C)、慢性乙型肝炎(CHB)和慢性乙型肝炎肝硬化(CHB-LC)患者中的分布。结果:血清生化指标在慢性HBV感染者病程发展中呈现相关性。与As C组比较:CHB组、CHB-LC组患者血清ALT、AST、AFP、TBA水平升高,差异有显著性意义(p<0.01),呈显著正相关,而TP、Alb、A/G水平降低,差异有显著性意义(p<0.05),呈负相关。HBe Ag(+)、HBe Ag(-)的标本中,BCP的突变率高于前C区突变率,差异有非常显著性意义。BCP区1762/1764双突变的突变率高于Pre C1896突变率。As C、CHB、CHB-LC 3组患者Pre C A1896、BCP区1762/1764变异率依次升高,与As C组比较,CHB组差异有显著性意义(P<0.05);CHB-LC组差异有非常显著性意义(P<0.01)。结论:对165例慢性HBV感染者观察,HBe Ag(+)/HBe Ag(-)患者及其病程不同发展阶段,Pre C/BCP出现相关联的突变率。特别需要注意的是HBe Ag(-)的慢性HBV感染者BCP区的突变率高于Pre C区的突变率,需要慎防HBV复制的危害性。HBV Pre C区/BCP区突变率可以预测到慢性HBV感染者病情的发展程度,对临床此类患者的研究具有重要意义。

慢性乙型肝炎45例HBV基本核心启动子变异及HBV-DNA定量检测

采用聚合酶链反应 -酶联免疫吸附法检测 4 5例慢性乙型肝炎乙肝病毒基本核心启动子 (HBV-Bcp)变异及 HBV- DNA定量 ,结果 HBV - Bcp变异阴性组 HBV- DNA定量值明显低于 HBV- Bcp变异阳性组 (P<0 .0 5 ) ,提示 HBV- Bcp变异可促进乙肝病毒繁殖 ,对慢性乙型肝炎患者检测 HBV- Bcp变异有一定的临床意义。

携蜂毒素基因重组腺病毒载体的构建

目的构建含巨细胞病毒 (cytomegalovirus ,CMV)启动子或甲胎蛋白 (α fetoprotein ,AFP)调控序列驱动下的蜂毒素基因的重组腺病毒 ,进行体外抗肿瘤效果的比较。方法人工合成蜂毒素基因时 ,用Kozak序列优化翻译起始区 ,并进行人类最适密码子的转换 ,然后置于CMV启动子或AFP调控序列之后 ,用细菌内高效同源重组法构建腺病毒质粒 ,脂质体转染 2 93细胞进行包装。结果目的基因成功地重组人腺病毒质粒。结论上述蜂毒素 腺病毒载体构建时的几个特点 ,有助于载体的顺利构建 。