普鲁兰多糖为骨架的新型阳离子非病毒基因载体

通过琥珀酸酐将低分子量支化聚乙烯亚胺(PEI,分子量1000)偶联到普鲁兰多糖(Pullulan)上,合成了新型基因载体P-PEI.利用1H NMR、FTIR、粒度仪、Zeta电位仪、透射电镜和凝胶电泳对聚阳离子载体及其与质粒pDNA的复合物进行了表征.凝胶阻滞实验结果证明,载体P-PEI在体外可以通过静电相互作用稳定结合pDNA,并能有效抑制DNA水解酶及血清成分对pDNA的降解.噻唑蓝(MTT)细胞毒性测试、绿色荧光蛋白表达质粒(pGFP)及荧光素酶表达质粒(pGL3)转染实验结果表明,载体P-PEI在N/P高达12.5时对细胞MCF-7,HeLa和COS-7的毒性低于PEI;当N/P为6.25时能有效将pGFP和pGL3带入Hela细胞并表达,最佳转染效率及荧光素酶活分别为[(36.67±0.25)%和(28.73±7.19)×108RLU/mg蛋白,RLU为光强度],比Lipo 2000[(49.13±0.61)%,(58.47±7.62)×108 RLU/mg蛋白)略低.因此以Pullulan为骨架材料的P-PEI是一种新的有潜在应用价值的非病毒基因载体.

非病毒基因载体聚合物的研究进展

非病毒基因载体聚合物以其低毒、低免疫原及靶向性等优点正成为目前基因治疗的热点之一。此文从药剂学的角度综述近年来非病毒基因载体聚合物的研究现状,重点介绍了非病毒基因载体聚合物的传递途径和分类,并探讨了如何优化非病毒基因载体聚合物传递体系以提高基因治疗的疗效。

可降解非病毒基因载体PEG-b-(PG-g-PEI)的合成与表征

目的结合重组低分子量PEI和PEG结构修饰两种手段合成出新型可生物降解的非病毒基因载体聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺)。方法用相对分子质量600的聚乙烯亚胺氨解嵌段聚合物PEG-b-PBLG,合成非病毒基因载体聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺);利用核磁共振氢谱、凝胶渗透色谱、激光粒度分析仪、zeta电位仪和凝胶电泳对载体及其与DNA复合物进行了表征,并通过体外细胞实验考察了载体的细胞毒性与转染效率。结果我们成功合成出窄分布的非病毒基因载体聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺);凝胶电泳测定结果表明当N/P比大于5时载体能很好地包裹DNA;载体与DNA形成的复合物粒径为120 nm,zeta电位25 mV;通过MTT实验和体外质粒转染实验显示出载体在测量范围内具有极低的细胞毒性和很高的转染效率。结论聚合物聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺)有望作为非病毒基因传递载体。

非病毒基因载体聚乙二醇-聚乙烯亚胺的合成及其结合DNA能力的研究

以IPDI为偶联剂,合成了PEG-PEI接枝共聚物,用FT-IR、1HNMR对共聚产物进行结构表征确认,通过1H NMR计算出共聚物的分子量,并通过琼脂糖凝胶电泳试验考察共聚物与DNA的结合能力。结果表明,成功合成了PEG-PEI共聚物,当PEG接枝量为10%、25%时,PEG-PEI结合DNA的能力没有受到明显影响;当PEG接枝量为50%时,PEG-PEI结合DNA的能力有所下降。

非病毒基因载体聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物缓冲容量的研究

目的考察非病毒基因载体PEI不同的分子量及接枝PEG的量对缓冲容量的影响。方法采用电位滴定的方法，根据公式β=dc（HCl）／dpH计算获得缓冲容量。结果分子量不同的PEI缓冲容量的最大值均〉8，且pH值随着分子量的增加而降低；同一分子量的PEI接枝不同量的PEG后，缓冲容量有明显的下降，接枝PEG量越多，缓冲容量下降越大。在生理pH4～7，缓冲容量差异减小。结论PEI分子量及接枝PEG的量对缓冲容量会产生一定影响．而缓冲容量又会影响PEI介导基因传递的能力。

以聚乙烯亚胺为骨架的非病毒基因载体的构建及其转染大鼠肝细胞的研究

目的 构建交联聚乙烯亚胺（Polyethylenemine,PEI）衍生物PEI-Bu,研究其对大鼠肝细胞系BRL-3A的细胞毒性和转染效率.方法 以PEI 800Da为骨架,1,4-丁二醇二氯甲酸酯为连接剂制备聚合物PEI-Bu,用凝胶渗透色谱法（GPC）测定分子量,动态光散射法（DLS）测定PEI-Bu/pDNA复合物的粒径和Zeta电位,琼脂糖凝胶电泳考察其复合质粒DNA的能力.MTT法榆测PEI-Bu对BRL-3A的细胞毒性,以荧光素酶质粒作为报告基因,测定PEI-Bu/pDNA复合物在BRL-3A细胞中的转染效率.结果 GPC 测定分子量为Mw4289Da,多分散指数1.31,复合物的粒径为138-16lnm,Zeta电位为2.4-4.3mV,凝胶电泳表明在质量比大于1时 PEI-Bu 具有复合DNA的能力,在同一浓度下PEI-Bu的细胞的毒性小于PEI 25kDa （p〈0.01）,PEI-Bu/pDNA在质量比为5时达到最高转染效率,高于PEl25kDa （p〈0.01）.并与Lipofectamine2000 相当 （P〉0.05）.结论 PEI-Bu对BRL-3A 细胞是一种低细胞毒性、高转染效率的非病毒基因载体,在肝细胞基因治疗领域中具有潜在的应用前景.

原子转移自由基聚合(ATRP)阳离子化菊粉作为非病毒基因载体的研究

利用原子转移自由基聚合(ATRP)将聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯[P(DMAEMA)]偶联到菊粉多糖(Inulin)上,合成了新型基因载体PDIN.利用核磁共振仪、动态光散射分析仪、透射电子显微镜和凝胶电泳对PDIN及其与质粒pDNA的复合物进行了表征.凝胶阻滞实验结果表明,PDIN可以通过静电相互作用稳定结合pDNA.噻唑蓝(MTT)细胞毒性测试、溶血实验、绿色荧光蛋白表达质粒(pGFP)及β半乳糖苷酶表达质粒(pβgal)转染实验结果表明,PDIN对MCF-7,Hela,COS7和HepG2细胞的毒性较小;其溶血率低,具有良好的血液相容性;载体PDIN能有效将pGFP和pβgal带入COS7细胞并表达,在N/P为1时转染效率最高,其β半乳糖苷酶的酶活为(3.36±0.74)U/mg蛋白,比Lipo2000转染效率[(4.33±0.77)U/mg蛋白]略低.因此,所合成的载体PDIN是一种有潜在应用价值的非病毒基因载体.

聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯及其衍生物作为非病毒基因载体的研究进展

综述了聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(PDMAEMA)及其衍生物作为非病毒基因载体的研究进展,包括PDMAEMA及其衍生物相对分子质量及结构与转染效率之间的关系、亲水性聚合物修饰的PDMAEMA和低相对分子质量的PDMAEMA接枝共聚物,并展望了PDMAEMA及其衍生物作为非病毒基因载体的发展方向。

作为非病毒基因载体的环糊精及其衍生物

环糊精由于自身的生物相容性和结构易裁剪性,通过结构修饰、聚合或超分子组合等设计被逐渐应用于非病毒基因载体系统。分别从环糊精、其小分子衍生物、含环糊精聚合物以及超分子结构综述国内外近几年的设计思路和研究进展,并探讨含环糊精及其衍生物的非病毒基因载体的"结构—安全性—基因转染效率"关系。

聚乙烯亚胺衍生物作为非病毒基因载体的研究进展

综述了通过结构修饰获得的各类聚乙烯亚胺(PEI)衍生物,如PEG修饰、小分子PEI共聚、连接配体或其它高分子骨架物等,及其在基因转染和细胞毒性方面的研究进展。

生物可降解聚合物作为非病毒基因载体的研究进展

以生物可降解聚合物作为载体制备载基因纳米粒/微球是一类颇具潜力的非病毒基因载体,有望成为新型的安全有效的基因传递系统。现将近年载基因乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微粒的制备方法,促进质粒DNA从PLGA微粒中释放的方法以及能迅速释药的新型生物可降解载基因微粒等的研究概况作一综述,以期为生物可降解聚合物作为非病毒基因载体的研究提供理论参考。

聚乙烯亚胺非病毒基因载体结构修饰研究进展

聚乙烯亚胺(PEI)作为最经典的非病毒基因载体之一,由于其高转染效率,在基因递送领域受到极大的关注,但其毒性限制了聚乙烯亚胺的应用。本文综述了对聚乙烯亚胺进行不同的结构修饰,如多糖修饰、聚乙二醇(PEG)修饰和低分子聚乙烯亚胺衍生物等,以实现在不显著降低转染效率的前提下减少细胞毒性。

非病毒基因载体脂质-聚阳离子复合物的研究进展

基因递送系统运载基因的能力是基因治疗的关键因素之一。脂质-聚阳离子复合物是一种新型的药物递送系统,脂质体与高分子基因载体具有协同增效作用,具有良好的稳定性、低细胞毒性以及高转染效率。

可降解的非病毒基因载体的研究进展

选择合适的基因载体是基因治疗成功与否的一个关键环节,合适的基因载体应该具备较高转染效率,较好的组织相容性以及生物安全性等特点。相较于传统的病毒基因载体,非病毒基因载体具有低免疫原性,易于制备以及载药量大等特点,是较为理想的基因载体。而寻求可降解的非病毒基因载体可使其更为安全深入的应用到体内以及临床,意义重大。本研究就对常见的几种可降解的基因载体的转染效果及相关改性做一综述,为研究可降解非病毒基因载体的新方法提供新思路。

聚乳酸-聚乙醇酸纳米粒作为非病毒基因载体

生物可降解材料聚乳酸-聚乙醇酸制备的载基因纳米粒是一种颇具潜力的非病毒基因载体,可望成为一类新型的安全有效的基因传递系统。本文分别从聚乳酸-聚乙醇酸纳米粒的优势、影响其细胞内摄和基因转染效率的因素以及存在不足与解决措施几个方面对近年来国内外有关聚乳酸-聚乙醇酸纳米粒作为非病毒基因载体的研究进展进行了简要综述。

层层自组装纳米粒作为非病毒基因载体

基因治疗的效果严重依赖于基因载体。与传统包封技术相比,在自组装技术基础上发展起来的以DNA为聚阴离子,与荷正电的高分子材料在溶液中形成纳米粒的方法,已成为目前最重要的非病毒基因载体制备手段,具有良好的应用前景。采用层层自组装(layer-by-layer assembly,LbL)技术可提高基因装载率,其优势还在于纳米粒表面性质的可控性:在温和的条件下实现多种材料在载体表面的固定,实现载体多功能化等。本文将对近年来国内外有关层层自组装纳米粒作为非病毒基因载体的研究进展以及本课题组在此方向的研究进行简要综述。

非病毒基因载体介导短发夹RNA转染抑制肿瘤细胞生长

利用肿瘤细胞表面抗原G250的单克隆抗体G250mAb和聚乙二醇(PEG)修饰非病毒基因载体聚乙烯亚胺(PEI),获得肿瘤靶向基因载体G250mAb-PEI-PEG.该载体对HeLa细胞的基因转染效率达到70%,远远高于对非肿瘤细胞NIH3T330%的转染效率.通过该基因载体将Nucleostemin(NS)基因的特异性短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)高效率地转入靶细胞HeLa,RNA干扰下调了细胞中NS的表达,显著抑制了HeLa细胞的增殖能力,引起HeLa细胞凋亡,而对NIH3T3细胞的增殖和活性没有显著影响.研究结果表明,非病毒基因载体G250mAb-PEI-PEG可靶向性、高效率的转染HeLa细胞,应用于基因治疗,这对于宫颈癌的临床治疗具有重要的意义.

利用核定位信号提高非病毒基因载体转化效率的研究进展

关于非病毒基因载体运用一直是基因工程研究关注的焦点,外源性基因穿过细胞膜屏障的方法较为成熟,而通过细胞核屏障的效率较低,通常需要借助核定位信号来完成。目前采用的方法各不相同,可导致核定位信号对转化效率的影响因素众多,如核定位信号与外源性DNA的连接方式、核定位信号的数量、类型、修饰,外源性阳离子聚合物、pH值等。因此,如何利用核定位信号中有效提高非病毒基因的转化效率值得研究探讨,本文就此作一综述。

氧化还原调控的甲氧基聚乙二醇-二硫键-聚乙烯亚胺非病毒基因载体的研制

合成了氧化还原调控的甲氧基聚乙二醇-二硫键-聚乙烯亚胺[methoxy poly(ethylene glycol)-SS-polyethylenimine,mPEG-SS-PEI]。采用薄层色谱验证了该聚合物中二硫键的存在。琼脂糖凝胶电泳结果显示,mPEG-SS-PEI-pEGFP复合物在含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液中稳定。透射电镜观察表明,不含二硫键的mPEG-PEI及mPEG-SS-PEI与pEGFP复合物的粒径均约为200 nm。体外转染试验中,荧光显微镜定性及流式细胞定量结果均表明,与mPEG-PEI-pEGFP相比,mPEG-SS-PEI-pEGFP能显著提高对U87细胞的转染效率。原因是mPEG-SS-PEI-pEGFP复合物进入细胞后能在较高浓度谷胱甘肽的还原下脱去PEG,从而恢复PEI的质子泵效应。并且,聚合物中加入二硫键未显著增加PEG化PEI的体外细胞毒性。

主体分子型非病毒基因载体的基础应用

设计并制备了一种新的具有分子探针功能的主体分子型非病毒载体-邻菲啰啉-β-环糊精衍生物主体分子(DZY-1),应用凝胶电泳法研究探讨了DZY-1与DNA相互作用及客体分子对该主体分子诱导DNA凝聚的影响;并进一步研究探讨了单一主体分子、主/客体分子配合物诱导DNA分子凝聚和聚合所形成的超分子聚合物抗限制性内切酶(HindⅢ)酶解的特性.应用扫描电子显微镜(SEM)观测到该主体分子、主/客体分子配合物与DNA分子相互作用形成超分子聚合物的微观结构形态.阐述了其作为非病毒基因载体可能的传递机制,为设计、制备新的非病毒基因载体提供了一种新途径.