2009年新型甲型H1N1流感病毒基质蛋白基因进化的新探讨

目的探讨甲型H1N1流感病毒基质蛋白(M)基因的进化规律及M2蛋白的氨基酸替代情况。方法从NCBI数据库下载甲型H1N1病毒M基因179条进行预分析,最终选取50条采用MEGA4.0软件对其进行比对,采用NJ法构建进化树,同时采用MEGA4.0软件对M2蛋白氨基酸序列进行比对。结果不同地区新型甲型H1N1流感病毒M基因同源性高,达99.6%～100.0%,但与历史上流行的H1N1和H3N2流感病毒M基因差异较大,仅与1999-2002年间香港地区流行的H3N2亚型猪流感病毒同源性较近,为96.7%～97.7%。2009年流行的新型甲型H1N1流感病毒与历年来流行的H1N1人流感病毒相比,在第11、13、14、16、20、28、31、43、54、57、77、78、82、86、89、93位氨基酸位点发生了变异;与历年来流行的H1N1禽流感病毒相比,在第13、14、16、31、43、55、77、89位氨基酸位点发生了变异;与H1N1猪流感病毒相比,在第13、14、19、43、55位氨基酸位点发生了变异。2009年流行的甲型H1N1流感病毒与历年来流行的H3N2人流感病毒相比,在第11、13、16、20、28、31、43、54、57、77、78、82、86、89、93位氨基酸位点发生了变异;与历年来在欧亚大陆流行的猪流感病毒相比,所比较的19个位点均有部分毒株发生变异;而与1999-2002年间在香港流行的H3N2猪流感病毒相比,仅在第13、14、21、43位氨基酸位点发生变异。结论此次新型甲型H1N1流感病毒M基因可能由香港地区流行的H3N2猪流感病毒重组而来。M2蛋白胞外编码区氨基酸位点发生变异,提示在疫苗研制方面应注意由此带来的影响。跨膜区的突变可能是导致此次新型甲型H1N1流感病毒对金刚烷胺类特异性抗病毒药物产生耐药性的原因,第43位氨基酸位点可能为引起此次耐药的主要位点。

SARS冠状病毒M蛋白基因的克隆、鉴定及原核表达载体的构建

目的 通过逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)扩增SARS冠状病毒M蛋白基因 ,并构建M蛋白基因的原核表达载体 ,为进一步研究其功能做准备。方法 提取SARS冠状病毒总RNA ,通过RT PCR对其M蛋白基因进行扩增 ,并构建M蛋白基因的原核表达载体。结果 获得了SARS冠状病毒M蛋白基因的编码序列并将其克隆入原核表达载体pET30a。结论 成功构建SARS冠状病毒M蛋白基因的重组表达质粒 。

经典性霍奇金淋巴瘤中EB病毒潜伏膜蛋白1的表达

目的探讨经典性霍奇金淋巴瘤（ｃＨＬ）肿瘤性Ｈ／Ｒ－Ｓ细胞埃泼斯坦－巴尔病毒（ＥＢＶ）潜伏膜蛋白１（ＬＭＰ１）的表 达情况及其意义。方法 采用免疫组化ＳＡＢＣ法对３２例ｃＨＬ进行ＬＭＰ１蛋白表达的检测。结果２０／３２（６２．５％）例ＬＭＰ１ 蛋白表达阳性，在各亚型之间没有显著性差异（Ｘ２＝０．８０９， Ｐ＝０．８４７）。结论ＬＭＰ１蛋白表达有地区差异，在ｃＨＬ亚型间可

延边地区淋巴瘤和鼻咽癌中EB病毒类型分布特点

目的研究我国延边地区淋巴瘤与鼻咽癌中EB病毒类型的分布特点。方法采用聚合酶链反应(PCR),巢式PCR和限制性酶切技术分析检测延边地区32例淋巴瘤与31例鼻咽癌中EB病毒的类型分布。结果在延边地区,22%的淋巴瘤和81%的鼻咽癌表现为EBNA-1阳性。EBNA-1阳性的7例淋巴瘤均表现为EB病毒-1型和"F"型,其中4例(57%)为"C"变异型;而在EBNA-1阳性的25例鼻咽癌中,22例(88%)为EB病毒-1型,3例为EB病毒-2型。除1例"f"变异型以外,均为"F"型,"C"变异型占鼻咽癌的63%(10/16)。结论EB病毒-1型为延边地区的主要EB病毒株,Bam HI"f"变异型罕见。

EB病毒潜伏期膜蛋白1与自身免疫性疾病关系的研究进展

目的已经证实多种自身免疫性疾病和血液病均与EB病毒(EBV)感染有关,其中EBV潜伏期膜蛋白1(LMP 1)基因是EBV的关键致瘤基因,也是使EBV在人体内维持潜伏感染的重要片段。LMP1在感染过程中参与多种细胞通路的改变与多种细胞因子的调节,其对细胞的诸多调控作用导致了多种自身免疫性疾病的发生发展。本文主要综述EBV的感染特点及LMP1在自身免疫性疾病中参与的发病机制。

甲型流感病毒基质蛋白2胞外功能区通用疫苗的研究进展

甲型流感病毒基质蛋白2胞外功能区(matrix protein 2 ectodomain,M2e)通用疫苗的确切保护机制尚未明确,但其能减轻流感症状,抑制病毒的复制、存活和传播.通过使用M2e四聚体通用疫苗、M2e病毒样颗粒疫苗以及M2e多表位通用疫苗联合佐剂等,可提高保护效果,未来具有较大的应用价值.此文通过收集相关文献资料、结合临床实践以及相关动物实验等,综述甲型流感病毒M2e通用疫苗的研究现状、免疫机制及其特点,以期为相关研究提供理论基础.

韩国淋巴瘤与中国延边地区淋巴瘤和鼻咽癌中EB病毒类型和30bp缺失型潜伏膜蛋白-1基因表达的比较研究

目的比较韩国淋巴瘤与中国延边地区淋巴瘤和鼻咽癌中EB病毒类型的分布特点。方法采用聚合酶链反应(PCR),巢式PCR,限制性酶切分析和Southern印迹杂交技术检测EB病毒的类型分布。结果在韩国非霍奇金淋巴瘤中,57%的B细胞淋巴瘤和75%的T细胞淋巴瘤表现为EBNA-1阳性。“C”变异型为44%,“f”变异型为9%。而在15例霍奇金淋巴瘤中,4例为“CF”变异型,11例为“DF”型。在延边地区,22%的淋巴瘤和81%的鼻咽癌表现为EBNA-1阳性。除1例“f”变异型以外,均为“F”型,“C”变异型占鼻咽癌的63%。此外,30bp缺失型潜伏膜蛋白-1基因在韩国淋巴瘤病例中占80%,未缺失型占14%,两者兼有者占6%。而在延边地区,缺失型在淋巴瘤中仅占43%,在鼻咽癌中占40%。结论EB病毒-1型为韩国和延边地区的主要EB病毒株。BamHI“f”变异型在两地区均罕见。但在韩国淋巴瘤病例中,30bp缺失型LMP-1基因的检出率则明显高于我国延边地区。

鼻咽癌体外传代细胞株SUNE中EBV-LMP_1全基因的扩增

用长片段高保真度ＰＣＲ扩增系统（ｅｘｐａｎｄＴＭｈｉｇｈｆｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲｓｙｓｔｅｍ）从鼻咽癌（ＮＰＣ）体外传代细胞株ＳＵＮＥ中扩增出ＥＢ病毒（ＥＢＶ）潜伏膜蛋白（ＬＭＰ１）全基因，经凝胶电泳分析和ＤＮＡ斑点杂交进行鉴定。扩增片段长度为３．４３ｋｂ，相当于Ｂ９５－８细胞ＥＢＶ基因序列位置为１７００３３～１６６６０８ｎｔ，包括ＬＭＰ１基因的上游启动子／增强子序列、ＬＭＰ１编码序列的３个外显子、两个内含子及下游ｐｏｌｙＡ信号序列。ＬＭＰ１全基因的扩增对于深入研究ＬＭＰ１基因的结构与功能以及ＬＭＰ１在ＮＰＣ发生发展中的作用机制具有十分重要的价值。

云南省边境地区禽流感H5N1亚型病毒基质蛋白2基因进化分析

目的了解2008--2012年云南省边境地区禽流感H5N1亚型病毒基质蛋白2（M2）和离子通道蛋白基因变异特征及遗传进化关系。方法于2008--2012年采集云南省边境地区（越南、老挝、缅甸与云南省交界处）家禽和野生鸟类棉拭子样品1240份，经H5N1亚型特异性多重RT—PCR检测，对阳性样品病毒M基因进行扩增，克隆至pMD18-T载体测序，获得M2基因序列，并与已知参考毒株序列进行序列比对及系统发育分析。结果自1240份样品中检出H5N1亚型阳性样品71份，阳性率为5．72％；选择其中的30份阳性样品进行病毒M2基因测序，共获得14种不同序列，存在3个不同进化分支：1．2．1、1．2．2、2，各有5、7、2份。通过基因系统发育分析发现，M2基因与HA基因呈现不同进化关系；M2蛋白涉及表位、金刚烷胺抗性和禽源、人源毒株的关键性氨基酸位点存在替代或突变。结论2008--2012年期间云南边境H5N1亚型病毒M2基因具有遗传差异，M2基因进化分支1．2．2毒株已成为当地流行的优势毒株。

流感病毒基质蛋白2胞外域作为广谱流感疫苗靶点研究现状

流感是由流感病毒引起的呼吸系统疾病,接种流感疫苗是预防流感的重要手段。疫苗的主要抗原是流感病毒表面蛋白血凝素和神经氨酸酶,但这两者都存在抗原漂移的现象,给疫苗设计带来巨大困难。广谱流感疫苗的候选抗原之一是高度保守的流感病毒基质蛋白2胞外域(matrix protein 2 ectodomain,M2e)。M2e在天然感染的情况下免疫原性较弱,但是可通过相关的佐剂、包裹材料和蛋白疫苗提高免疫原性。此文介绍了加强M2e免疫效果方式的研究以及M2e疫苗的临床研究进展。

基于基质蛋白2的通用流感疫苗研究现状

疫苗是预防流感最为有效的方式.由于流感病毒存在抗原漂移和抗原转换的特性,使得现有疫苗不能很好应对未知的季节性流感以及新发流感大流行,因而研发一种能够对多个亚型流感病毒提供交叉保护的通用疫苗具有重要意义.流感病毒基质蛋白2（matrix protein 2,M2）,尤其是其胞外区,在甲型流感病毒的所有亚型中几乎是完全保守的,是很有前途的候选抗原,可以发展成为广谱重组流感疫苗.针对M2设计的流感疫苗临床前以及部分临床试验已经证明其可以保护动物抵抗同源和异亚型甲型流感病毒的攻击.

西尼罗病毒E蛋白结构域Ⅲ特异性单克隆抗体的研制

目的研制针对西尼罗Ⅲ重组融合蛋白的特异性单克隆抗体。方法用西尼罗Ⅲ重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠,用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并用间接ELISA方法进行筛选,所获得的单抗经间接ELISA、免疫印迹和间接免疫荧光试验进行鉴定。结果共获得了3株能稳定分泌针对西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ的特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为4F7、6H3和8E4,其单抗亚类鉴定分别属于IgG1、IgG1和Ig2a。这3株单克隆抗体均能与重组西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ发生特异性反应,而与日本脑炎病毒无交叉反应,并且,8E4和6H3识别同一抗原位点,4F7识别西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ的另一抗原位点。结论本实验成功研制出针对西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ的特异性单克隆抗体,为我国建立西尼罗河病毒的病原学检测方法并与日本脑炎病毒进行鉴别诊断提供了技术贮备。

EB病毒编码潜伏膜蛋白－1与鼻咽癌免疫治疗

综述近年来EB病毒（Epstein—Barrin virus）编码的潜伏膜蛋白1（Iatent membrane protein，LMP－1）对鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）患者免疫系统影响和对其进行免疫治疗方面的研究进展情况，并着重介绍针对潜伏膜蛋白1的免疫治疗研究现状。

基于流感病毒保守抗原的广谱流感疫苗研究进展

流感是由流感病毒感染引起的严重急性呼吸道传染病,接种流感疫苗是预防流感最经济、安全且有效的措施.然而,传统流感疫苗难以有效应对因流感病毒抗原漂移或抗原转换而产生的无法预料的流感流行或大流行,因而开发能诱导广谱和持久免疫的广谱流感疫苗是新型流感疫苗研发的重要方向.流感病毒基质蛋白、核蛋白和血凝素茎部结构域作为流感病毒的保守抗原,是当前广谱流感疫苗的主要靶抗原.此文就基于流感病毒保守抗原的广谱流感疫苗的抗原选择、免疫保护机制、临床研究进展做一综述.

鼻咽癌组织中潜伏膜蛋白1的表达对癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨治疗前鼻咽癌组织中潜伏膜蛋白１（ＬＭＰ１） 的表达对癌细胞增殖和凋亡的影响。方法 收集未经治疗的鼻咽癌活检组织标本５５ 例，采用原位分子杂交和免疫组化检测ＥＢ 病毒编码的小ＲＮＡｓ（ＥＢＥＲｓ）和ＬＭＰ１ 以及癌细胞增殖细胞核抗原指数（ＰＣＮＡｉｎｄｅｘ，ＰＩ） 和癌组织中凋亡相关基因产物ｂｃｌ２ 的表达，以末端标记原位细胞死亡指数（ＴＵＮＥＬｉｎｄｅｘ，ＴＩ）表示癌细胞的凋亡程度。结果 （１）５５ 例未治疗鼻咽癌组织中２７ 例呈ＬＭＰ１ 阳性（４９．１％ ），其ＰＩ中位数为９０ ％ ，高于２８ 例ＬＭＰ１ 阴性病例的８０ ％ ，两者差异具有显著性，Ｐ＜ ０．０５；（２）２７ 例ＬＭＰ１ 阳性病例的ＴＩ中位数为每高倍视野１６．２ 个，高于２８ 例ＬＭＰ１ 阴性病例（１０．４ 个） ，两者差异也具有显著性，Ｐ＜ ０．０５；（３）ＬＭＰ１ 阳性与阴性病例表达ｂｃｌ２ 的癌细胞百分数差异无显著性，Ｐ＞ ０．０５；（４） 鼻咽癌组织中癌细胞的ＰＩ与ＴＩ呈正相关， Ｐ＜０ ．０１ ，但ＴＩ与表达ｂｃｌ２ 的癌细胞百分数却无相关性， Ｐ＞０ ．０５。结论 （１） 鼻咽癌组织中ＬＭＰ１ 阳性者有较高的ＰＩ。

人巨细胞病毒pp65原核表达载体构建及表达产物对特异性免疫应答的诱导

目的 构建人巨细胞病毒 pp6 5原核表达载体 ,研究纯化后的重组 pp6 5蛋白诱导特异性免疫应答的作用及其特异性。 方法 采用体外 DNA重组技术 ,构建 pp6 5原核表达载体并诱导其表达 ,通过亲和层析对表达产物进行纯化和经 Westen blot鉴定 ;用 MTT法检测重组蛋白对人外周血单个核细胞 (peripheral blood m ononuclear cell,PBMC)的激活、增殖作用 ,检测激活淋巴细胞对受 HCMV感染的人胚肺成纤维细胞 (human em bryo lung fibroblast,HEL )的杀伤作用。 结果 成功构建 pp6 5原核表达载体并诱导其高效表达 ,纯化后的 pp6 5蛋白能促进 PBMC激活和增殖 ,增殖的细胞可特异性地杀伤受 HCMV感染的 HEL细胞。 结论 经重组 pp6 5蛋白激活增殖的淋巴细胞 ,可特异性杀伤受 HCMV感染细胞 ,对 HCMV感染的免疫治疗具有十分重要的作用。

pp67-mRNA在肾移植术后人巨细胞病毒感染中的诊断价值

目的探讨pp67对。肾移植术后人巨细胞病毒（HCMV）活动性感染及指导抗病毒治疗上的作用。方法采用NASBA测定32例肾移植术后患者外周血中的pp67，同时通过免疫荧光技术（IFA）对早期抗原pp65（CMV-Agpp6S）的检测来判断HCMV活动性，术后第3周，第7周分别用ED-TA管采血5-7rnl，每人每次两管做实验样本，立即送检并将二者结果相比较。其中检测结果有一项阳性的患者，选择更昔洛韦进行对症抗病毒治疗，对pp67-mRNA和pp65抗原检测双阳性患者，在选择更昔洛韦对症治疗时，并随访观察每周采血行pp67检测CMV活动情况，同时CMV抗原血症法检测，将二者结果比较，了解pp67与HCMV活动性感染及CMV病的关系。结果共采集样本128份，其中44份样本CMV-Agpp65阳性，19份样本pp67-mRNA阳性，8例CMV-Agpp65和pp67-mRNA均为阳性。临床诊断为HCMV病患者12例。CMV-Agpp65抗原检测灵敏度（91．7％）高于pp67-mRNA（66．7％），pp67-mRNA特异性（95．O％）高于CMV．Agpp65（50．0％）抗原检测。而在HCM~临床症状出现感染并治疗后期，随访发现选择以pp67作为抗病毒治疗指标较CMV-Ag更早转阴，可以明显缩短用药时间（P〈0．05）。结论CMV-Agpp65、pp67-mRNA对器官移植术后HCMV感染均具有诊断意义，应用NASBA法能更加快捷准确检测巨细胞病毒，pp67较准确地反映了肾移植术后HCMV的活动性，能更好的指导临床抗病毒治疗并提供了较客观的依据。

膜蛋白Flotillin-1与细胞膜PrPC内吞相关性研究

目的研究膜蛋白Flotillin-1是否与PrP。蛋白内吞相关。方法利用免疫印迹法观察不同细胞株中Flotillin-1表达情况；利用免疫共沉淀的方法，检测Flotillin-1和PrPc蛋白在Cu2＋存在条件下相互作用的情况。结果①免疫印迹法显示Flotillin-1在多种细胞株中均有表达，且表达量没有明显差别；②免疫共沉淀实验（IP）结果提示在cu2＋处理条件下细胞中有PrPc与Flotillin-1蛋白复合体的形成，并且与cu2＋浓度以及cu2＋处理时间相关；结论膜蛋白Flotillin-1与细胞膜PrPc内吞过程存在相关性。

鼻咽癌组织端粒酶催化亚单位与LMP1的表达及其相关性研究

目的研究EB病毒潜伏膜蛋白(LMP1)和人端粒酶催化亚单位(端粒酶逆转录酶hTERT)在鼻咽癌组织中的表达,探讨鼻咽癌中hTERT与EB-LMP1之间的相关性。方法应用免疫组化技术检测64例鼻咽癌组织中hTERT与EBV-LMP1的表达,统计、分析hTERT与EB-LMP1之间的相关性。结果鼻咽癌组织hTERT的阳性率为78.1%(50/64),LMP1阳性率为67.2%(43/64);50例hTERT阳性标本中,有39例LMP1阳性,二者均阳性的百分率为78.0%(39/50),14例hTERT阴性标本中,10例LMP1阴性,二者均阴性的百分率为71.4%(10/14),二者之间高度相关(χ2=9.98,P<0.01)。结论鼻咽癌中,EV病毒潜伏膜蛋白与端粒酶催化亚单位的表达高度相关。