病毒宏基因组学检测猪博卡病毒及其遗传进化分析

为了探明导致某养猪场中仔猪腹泻的病原,本试验将患病仔猪样本处理并提取核酸后进行病毒宏基因组测序,对测序结果进行序列比对分析和遗传进化分析,并对样本核酸进行PCR检测验证。结果显示,RNA样本中只注释到A型流感病毒(H1N1和H3N2),读数比为6.8%,未发现其他猪病相关RNA病毒。DNA样本注释到的病毒主要为猪博卡病毒(PBoV),读数比为34.5%,命名为PBoV-SDPD-2022;其余猪病相关病毒包括猪巨细胞病毒、猪乳腺腺病毒和猪细环病毒,读数比均小于1.0%。基于全基因组、NS 1基因和VP 1基因构建的系统发育进化树均显示,PBoV-SDPD-2022与参考毒株PBoV3_VIRES_HuB01_C1处于同一分支,属于PBoV G3群。与21株参考毒株相比,PBoV-SDPD-2022 NS1蛋白的编码基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为49.6%~97.2%和38.5%~95.3%;VP1蛋白的编码基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为47.9%~97.9%和34.8%~98.8%;NP1蛋白的编码基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为35.2%~98.5%和26.9%~97.4%。与G3群参考毒株相比,PBoV-SDPD-2022 NS1蛋白在第654位点处有1个氨基酸的缺失;VP1蛋白在第151、152位点处有2个氨基酸的插入,且包含基序YLGPF(VPl aa 18~22)和HDLAY(VP1 aa 41~45);NP1蛋白在第15、16、35、36、212位点处发生氨基酸的缺失,在第95位点处有1个氨基酸的插入。PCR检测证实样本核酸为PBoV阳性。结果表明,导致该养猪场仔猪腹泻的优势病原是G3群PBoV。本试验有助于进一步了解我国PBoV基因组序列特征,并为未来PBoV流行病学调查提供了参考依据。

病毒宏基因组在医学上的应用与未来展望

新型新冠病毒的爆发,给人类安全健康带来了巨大的威胁。在过去的经验中,发现和鉴定新病毒以及确定新病毒与疾病的关系是预防、诊断和治疗新发病毒性传染病的首要任务。在过去十几年中,随着高通量测序技术的迅速发展,病毒宏基因组的理论以及技术已被证明在公共卫生,临床病原学诊断等方面发挥着重要的作用。此前,人们对病毒的认识被限制于病毒感染人体进而引起疾病,但是近些年随着人类基因组和微生物组研究表明,病毒与人体之间存在更广泛的相互作用,部分病毒对人体无害,甚至是有益的。本文主要针对近些年来对病毒宏基因组的兴起与发展,研究的策略以及在医学上的一些应用前景进行综述,并提出病毒宏基因组的一些未来展望。

病毒宏基因组学的研究现状及应用

病毒宏基因组学(Metagenomics)是一种新兴的病毒组学研究技术,它突破了传统技术方法的局限,而直接以环境中所有病毒的遗传物质为研究对象,可以快速地鉴定出环境中所有的病毒组成,从而是一种发现新病毒,监控病毒变异的分子流行病毒学研究的有力手段。在短短的几年里,人们用这种方法发现了很多有意义的病毒,并扩大了很多病毒的宿主范围,增强了人们对环境中包括各种媒介生物的病毒组成的了解,研究领域涉及到人类肠道、动物组织、血液、水体等,充分显示出其在病毒发现、病原溯源、微生物预警等方面的实用意义。笔者在本文中简要介绍了病毒宏基因组学的进展及应用前景。

病毒宏基因组高通量测序在临床感染性疾病诊断中的应用

目的以1例恶性胸腺瘤并发外阴部感染患者溃疡部位拭子标本为模型,建立适用于临床病毒检测的宏基因测序平台。方法提取该患者外阴部水疱液中的全部核酸,通过不依赖序列的单引物扩增(SISPA)后进行Ion Torrent PGM高通量测序,筛选出与病毒相关的测序读长(reads)与NCBI数据库中的序列进行比对,分析标本中病毒核酸的种类及丰度,并与荧光定量PCR法比较。结果共获得320 049条读长,4 288条(1.3%)与病毒相关,其中2 629条为噬菌体基因,其余1 659条读长中与人类疾病相关的有单纯疱疹病毒2型(HSV-2)14条(0.84%)、指环病毒属(Anellovirus)1 361条(82.0%)、多瘤病毒属(Polyomavirus)19条(1.14%)、乳头瘤病毒属101(Papillomavirus 101)6条(0.40%),反转录病毒科80条(4.82%)、痘病毒科45条(2.7%)、其他病毒如植物、鱼类、禽类病毒117条(7.05%)、未分类病毒17条(1.02%);疱疹病毒序列鉴定结果表明,14条读长注释为HSV-2(NC_001798),且用荧光定量PCR确认为HSV-2阳性,两法结果一致;噬菌体序列分析发现2 629条读长为噬菌体基因,其中1 251条为肠杆菌噬菌体(占47.6%),1 331条为葡萄球菌噬菌体(占50.6%)。结论初步建立了基于Ion Torrent PGM的病毒宏基因组测序平台并成功检测出HSV-2,为其在临床中的应用提供了实验依据。

病毒宏基因组学与输血安全

研究血液病毒组学对监测流行病和保障临床输血安全十分重要。目前,全国采供血机构已经全面检测可经血传播的常见病毒（HBV、HCV和HIV）,但是受血者仍有可能感染其他已知或未知的病毒,尤其是大部分受血者在接受输血时正处在免疫力低下的状态,这使他们更容易受病毒的侵染从而导致严重的后果。为了预防输血传播某些未受监控的病毒,采供血机构实行一些措施,比如排除高危行为献血者、制备去白细胞的血液制品以及对血液制品进行物理或化学手段的病毒灭活处理。但是迄今为止,并没有1种对所有血液制品都通用,以及对各种类型的病毒都有效的病毒灭活方法,比如对病毒核酸有破坏作用的病毒灭活方法,对无包膜的病毒灭活效果却不理想,而且不能对含有高病毒载量的血浆制品进行彻底灭活。因此,我们需要1种可以发现可能影响输血安全的未知病毒的方法。病毒宏基因组学结合了高通量测序技术,被认为是鉴定和监测血液中可能存在的已知和/或未知病毒的最有前景的方法。

病毒宏基因组学在新发病毒快速确认中的优势

新发病毒性传染病已成为人类健康的巨大威胁。自然界存在大量的未知新型病毒,它们可能构成人类未来新发传染病的传染源。由于未知新型病毒遗传信息与已知病毒差异较大,因而传统的病毒检测方法难以有效发现它们。近年来,随着病毒分子生物学和下一代测序等技术的发展,一些新的病毒高通量检测方法应用于未知新型病毒的挖掘中,其中病毒宏基因组学检测技术越来越成为人类猎取未知病毒的高效工具。本文阐述病毒宏基因组学技术的原理、主要技术流程,其在新发病毒快速确认中的优势以及新发病毒感染与特定疾病的关联分析策略,并对该技术在未来临床病毒感染诊断中的应用提出展望。

病毒宏基因组学的研究概况及应用

病毒宏基因组学(Viral metagenomics)是新兴起的研究环境中病毒多样性及其分子生物学信息的技术。此技术已在人类健康、动植物病毒检测、环境中病毒多样性分析方面得到广泛应用,对病毒的系统研究、病原体分析及预防具有重要意义。为拓展病毒宏基因组学的应用范围和现实作用,综述了病毒宏基因组学在动植物健康、环境问题以及病毒研究领域的研究概况及其应用展望。

病毒宏基因组学在动物病毒研究中的应用及研究进展

近年来,新发人畜共患病呈现逐年递增的趋势,人类想要征服新发人畜共患病,就必须提前发掘潜在的新的致病性病原,并针对新病原进行基因组分析、流行病学调查、致病机制及疫苗开发等方面的研究。病毒宏基因组学是在宏基因组学基础上发展起来研究特定环境中病毒的新兴技术,该技术结合深度测序技术(第二代、第三代测序技术)已经在人类、动物、特定环境中挖掘出大量的新病毒,该技术不依赖于病毒培养及病毒序列,在国内外被广泛应用于新发人畜共患病病原的挖掘与临床诊断。就病毒宏基因组学在动物病毒研究中的应用及研究进展进行了介绍。

病毒宏基因组学方法鉴定出小熊猫粪便中一株新型指环状病毒

研究从2份小熊猫粪便样品中检测到了一种新型的指环状病毒,命名为AV-Chengdu1(GenBank KX611132)。全基因组测序结果表明,其基因组全长约2 900nt,GC含量为49.8%;基因组结构分析表明其含3个开放阅读框(ORF1:1 743nt,ORF2:393nt,ORF3:399nt),其中ORF1编码产物的氨基酸序列与一株来自松貂的指环状病毒的氨基酸序列(JN704611)同源性为56.4%。系统进化分析表明其与来自松貂的指环状病毒(JN704611)紧密聚类。

病毒宏基因组学在HPV感染相关性疾病中的研究进展

人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是乳多空病毒科的一种具有圆形二十面体结构的双链DNA病毒。近年来,基于第二代测序技术的病毒宏基因组学逐渐兴起,它可以直接获得特定环境中的全部病毒核酸信息,并对其进行序列进化分析。可用于研究环境中病毒的多样性、未知病毒的鉴定、实时监测病毒的变异情况以及发现可能存在的新病毒。本文主要就近年来病毒宏基因组学及其相关检测方法在HPV感染相关性疾病的研究进行综述,以期为HPV相关疾病的检测提供新的思路。

基于病毒宏基因组技术侦测牡蛎体内病毒

建立了牡蛎(Crassostrea spp.)病毒宏基因组研究方法,应用差速离心和蔗糖垫超速离心提取病毒样颗粒,核酸酶处理宿主游离核酸后提取病毒总核酸,经反转录、双链合成和核酸扩增获得足量DNA。高通量测序共获得1 661 809 000个碱基,包括6 647 236个读长(reads)信息,拼接后得到50 842个重叠群(contig),序列总长度达到14 239 389 bp。同时从reads质控图等多方面对测序数据进行分析与评估,显示测序数据质量良好。数据与病毒库进行比对,发现病毒序列来自于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)和疱疹病毒科(Herpesviridae)2个科,类单纯疱疹病毒(Simplexvirus)、心病毒(Cardiovirus)和肠道病毒(Enterovirus)3个病毒属。

动物病毒宏基因组数据分析平台的建立及应用

病毒宏基因组学(Viral metagenomics)是一门新兴的用于研究环境及宿主中病毒多样性及其生物学特性学科。为了能够更高效、科学地实现宏病毒组数据分析,本研究建立了一个动物病毒宏基因组数据分析平台。该平台的主要功能包括数据质控、数据的预处理、序列拼接和序列注释等,并根据应用需求,建立了两种基因序列注释策略:基于读长序列分析和基于重叠序列分析。应用该分析平台对一个猪源鼻拭子的混合样品中病毒基因组数据进行了分析,结果显示该样品中存在环状病毒、冠状病毒、细小病毒等60多种病毒,证明该平台可满足动物病毒宏基因组数据分析的需求。动物病毒宏基因组数据分析平台的建立为动物病毒流行病学监测及疾病防控提供有效的技术手段。

宫颈上皮内瘤变患者微环境中HPV病毒宏基因组学研究

目的探讨宫颈上皮内瘤变患者宫颈微环境内HPV病毒组成,以及HPV62亚型的流行情况。方法选取2017年9月至2018年9月舟山医院妇科门诊诊治的40例CIN患者病理组织及分泌物作为研究对象。按随机数表法分为4个文库,通过提取病毒核酸、病毒富集制成病毒文库,进行宏基因组高通量测序,分析其病毒文库HPV生物信息学组成。此外,收集110例CIN患者宫颈组织提取病毒核酸,通过巢式PCR检测其中HPV62阳性情况。结果 4个文库总体分析后,发现HPV16、HPV58、HPV51丰度较好,其次是HPV18、HPV62,其他还有HPV11、HPV6、HPV54、HPV56、HPV39、HPV52有少量表达。在110例CIN患者中,8例HPV62阳性,阳性率7.27%。结论病毒宏基因组方法对研究CIN患者微环境HPV感染型别动态变化及新序列的发现有一定优势,通过结合流行病学调查,在优化HPV临床检测试剂盒的型别组合方面有一定指导意义。

基于病毒宏基因组技术的浮游病毒多样性研究进展

浮游病毒通过调节微生物群落结构与功能来影响水生生态系统的演变,对浮游病毒的全面了解有利于水体污染的防治和生态环境的保持。因依赖于宿主培养的传统病毒研究中存在许多不可避免的局限性,导致对于浮游病毒多样性了解比较片面。病毒宏基因组技术的出现突破了病毒无通用分子靶基因的瓶颈,为研究已知及未知病毒与不同宿主、环境的相关性提供了有力支持。本文总结并讨论了浮游病毒多样性的研究方法及优缺点,综述了病毒宏基因组技术在浮游病毒多样性研究中的研究进展,同时也提出了病毒宏基因组研究中存在的一些问题和展望。

病毒宏基因组学及其在临床诊断中的应用

近年来SARS病毒、埃博拉病毒(Ebola virus)、尼帕病毒(Nipah virus)、新型流感病毒(如H1N1,H7N9等)等新发或再发病毒疫情不断出现,对人类健康构成严重威胁。然而面对这些新发病毒性传染病,人类还没有有效的早期预防、诊断和治疗措施,因而快速的病毒检测是临床治疗、疫情防控的关键所在。传统的病毒鉴定方法包括组织细胞培养、电子显微镜观察、抗原抗体检测、基因扩增测序等,但这些方法都依赖于成熟的体外培养体系或病毒的蛋白和核酸序列已知,因此对新发病毒或者变异度较高的病毒就无能为力。病毒宏基因组学(viral metagenomics)的出现则有效地解决了这一难题,同时也促进了人类对于未知病毒的认识。病毒宏基因组学是一种新兴的病毒学研究技术,该方法不依赖于病毒培养,无需已知病毒基因序列,它可以直接以待测样本中所有病毒的遗传物质为研究对象,一次性地鉴定出样本中的所有病毒组成。本文介绍了病毒宏基因组学的产生过程、研究方法,并对其临床应用前景及局限性进行阐述。

一起东北黑熊死亡病例的病毒宏基因组学分析

黑熊是我国重要的野生动物资源,保护黑熊是我国野生动物保护的重要内容之一。本研究使用常规细菌检测和病毒组学分析,对一起黑熊死亡案例进行病原分析。细菌学检测发现了肠出血性大肠杆菌和A型魏氏梭菌阳性,但结合临床症状,排除了细菌感染的可能。随后使用RNA和DNA病毒组技术相结合,对其进行全病毒组分析,结果发现了Parvovirus、Anellovirus、Circovirus等7个病毒信息,其中肾脏携带的病毒最为丰富,有7个科。在这些病毒中,Parvovirus、Anellovirus和Circovirus与已知病毒核苷酸同源性小于90%,而其余病毒与当前已知病毒同源性高达99%。绝大多数病毒致病性不明确,值得注意的是本研究发现的细小病毒在黑熊中呈现系统感染,且与美国的一株熊细小病毒NS1氨基酸同源性为86.8%,但其与此次黑熊死亡的关联需进一步研究。本研究首次用病毒组技术对黑熊样本病毒组进行分析,结果虽不能判定此次黑熊死亡的原因,但相关数据为了解黑熊病毒多样性提供了重要的基础数据。

病毒宏基因组学在献血人群病毒鉴定的应用研究

目的探讨宏基因组学技术在献血人群中病毒鉴定的应用潜力,并评估其在提高血液制品安全性方面的效能。方法采用前瞻性队列研究设计,收集了15名献血者的血液样本。通过QIAamp Viral RNA Mini Kit提取核酸,并使用Phusion~?High-Fidelity PCR Master Mix进行PCR扩增,随后使用NEBNext~?UltraTM DNA Library Prep Kit构建测序文库。样本通过Illumina HiSeq平台进行双端测序,再进行数据质量控制和宏基因组分析。结果在15名献血者样本中,平均总Reads数量为9.86×10^(6)±6.11×105,平均总碱基数为1.55×10^(9)±6.36×10^(7)。质量分数Q20和Q30的平均碱基数分别为1.52×10^(9)±7.04×10^(7)和1.47×10^(9)±5.95×10^(7),平均占比分别为98.81%±0.02%和95.60%±0.06%,GC含量平均占比为65.99%±0.16%。宏基因组分析鉴定出包括Dinovirus,parvovirus,torque teno virus,papillomavirus,Merkel cell polyomavirus,herpesvirus_6A,herpesvirus_6B,human pegivirus,polyomavirus在内的9类病毒。结论宏基因组学技术能够在献血样本中检测到多种病毒,包括传统筛查可能遗漏的类型。该技术可作为提高献血安全性的有效工具,有助于发现和预防病毒传播,但也需要进一步研究以优化数据处理和解释。

藏猪呼吸道疾病临床样本中病毒的宏基因组学分析

为了解我国川西高原地区藏猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease complex,PRDC)相关病毒的种类和流行情况,本研究从四川省甘孜藏族自治州地区采集藏猪呼吸道样本共计119份,其中健康藏猪鼻拭子66份(来自6个猪场),PRDC明显症状的藏猪鼻拭子、肺组织及肺泡灌洗液53份(11个猪场)。将健康组和发病组样本制成两个pool样提取总核酸反转录成cDNA,建库后使用Illunima novaseq测序。经序列分析表明,健康藏猪呼吸道样品主要以细菌噬菌体为主,动物相关病毒仅检测到疱疹病毒科(Herpesviridae)的mardivirus。发病组样本的病毒种群包括14个病毒科的16种病毒,可引起PRDC的病毒有猪圆环病毒2型(PCV-2)、细环病毒(TTSuV)、猪细胞巨化病毒(PCMV)和非洲猪瘟病毒(ASFV)等。使用SOAPdenovo软件组装出两株PCV-2,三株TTSuV和一株Porprismacovirus的全基因组。遗传演化分析结果显示,两株PCV-2属于PCV-2d亚型,三株TTSuV均属于k2型,其中SCgz-1属于k2b亚型,SCgz-2和SCgz-3属于k2a亚型。Porprismacovirus毒株与越南的人源Human 16806x66_213毒株聚为单独一分支,而与猪源毒株则遗传距离较远。RDP4重组分析显示,该毒株为人源Human 16806x66_213毒株和猪源Porcine 17668x82_593毒株的重组毒株,该重组方式在国际上未见报道。本研究首次对川西高原地区藏猪的呼吸道相关病毒开展调查研究,发现藏猪呼吸道疾病相关病毒种类繁多,并存在不同家畜间、人和家畜间跨种传播的可能,应予以更多关注。同时,本研究也为藏猪呼吸道疾病的防控提供参考。

病毒宏基因组学及其在动物病毒鉴定中的应用

病毒宏基因组学(viral metagenomics, VM)是一种以待测样本中存在的病毒群体为研究对象,基于高通量基因测序技术来研究样本中病毒组构成的技术。相对于一代测序技术,高通量测序技术具备通量高、速度快、对未知病毒具有良好检出性等优势。因此,VM对研究环境中病毒多样性、快速检测已知和未知病毒、实时监测特定病毒动态变化等具有重要意义。近年来,VM技术已应用到动物传染病防控等多个领域,包括动物神经系统、呼吸道系统和肠道组织中病毒组检测与分析,针对新发传染病病原高精度识别等。本文从病毒宏基因组学的技术发展、原理以及在动物病毒鉴定中的应用等进行了综述。

宏基因组学技术分析山羊瘤胃病毒的多样性

反刍家畜瘤胃内微生物丰富多样,病毒(主要是噬菌体)亦是其重要组成部分。瘤胃内所有的病毒可统称为瘤胃病毒组(ruminal virome),可以利用宏基因组学(metagenomics)技术进行研究。解析山羊瘤胃病毒组的组分及功能有望更全面地了解其在瘤胃微生态区系中的地位和作用。为使测序结果能覆盖瘤胃中绝大部分病毒群落,不仅在样品的预处理阶段要尽量避免病毒样颗粒的损失,而且要保证瘤胃病毒组总DNA的提取质量和产量均满足宏基因组测序的要求。本研究比较了制备瘤胃液病毒组分的4种流程:(P1)离心+稀释、(P2)离心+稀释+过滤、(P3)离心+稀释+过滤+聚乙二醇沉淀、(P4)离心+稀释+过滤+聚乙二醇沉淀+氯仿处理。提取核酸后采用Illumina Novaseq 6000平台对瘤胃病毒基因组DNA进行测序,并对病毒群体结构进行分析比较,以筛选出瘤胃病毒组样品制备的最优流程。结果表明,聚乙二醇沉淀有助于病毒核酸提取,而氯仿处理过度影响病毒组分产量;山羊瘤胃内病毒群落主要是尾状病毒目的长尾病毒科、肌尾病毒科和短尾病毒科噬菌体。研究结果为深入分析噬菌体在山羊瘤胃微生态区系中的作用奠定了基础。