脊髓钝挫伤后慢病毒干扰水通道蛋白4对大鼠运动功能及Rho表达的影响

目的 探讨脊髓钝挫伤(SCC)后,慢病毒干扰水通道蛋白4(AQP4)对大鼠运动功能的影响,并观察凋亡相关因子Rho表达的变化。方法 将SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、生理盐水组(SCC组)、空载组(Vector组)和慢病毒组(AQP4RNAi组,制备慢病毒AQP4干扰模型),每组32只。SCC组、AQP4RNAi组及Vector组均采用改良Allen’s法制备SCC模型,术后12 h及术后1、3 d,采用大鼠脊髓损伤(BBB)评分评估4组后肢运动功能;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测4组脊髓组织中rho的表达;采用免疫组织化学方法检测Rho在4组脊髓组织中的表达;生物信息学分析预测AQP4与Rho之间的相关性。结果 运动功能评分结果显示,术后12 h SCC组、Vector组和AQP4 RNAi组BBB评分均为0分,术后3 d AQP4 RNAi组BBB评分较Vector组高(P<0.05)。GeneMANIA结果显示,AQP4与Rho存在间接共表达关系。RT-PCR和免疫组织化学结果显示,术后12 h及术后1、3 d AQP4RNAi组脊髓组织中rho表达均低于Vector组(P<0.05);SCC组脊髓组织中rho表达均高于Sham组(P<0.05)。结论 大鼠SCC后脊髓组织中Rho表达上调,而干扰AQP4能使其Rho表达下调,减少神经细胞凋亡,有利于大鼠运动功能恢复。

鸡斑联蛋白基因的慢病毒干扰载体的构建及筛选

本试验旨在构建4条鸡斑联蛋白(zyxin)基因的RNAi慢病毒载体,对其进行滴度测定,并进行有效干扰靶点的筛选,为以后开展鸡zyxin基因抗球虫机理的研究奠定基础。提取鸡胸腺组织的RNA,反转录,扩增zyxin基因的编码区,并将其克隆到真核表达载体Pex-6上。设计针对zyxin的shRNA序列,应用基因重组技术插入到Lv3慢病毒表达载体中,将lv3-shRNA载体与包装质粒pGag/Pol、pRev、Pvsv-G共转染293T细胞,进行病毒包装。将得到的病毒原液10倍稀释6个梯度,分别转染293T细胞,进行滴度的测定。将构建好的4条慢病毒载体与Pex-6-zyxin真核表达载体共转染293T细胞,运用RT-PCR和Western-blot方法进行有效干扰靶点的筛选。构建4条针对目的基因zyxin的RNAi慢病毒穿梭质粒表达载体CO1、CO2、CO3、CO4和1个阴性对照质粒,经测序鉴定正确;共转染293T细胞包装病毒并浓缩后滴度达1×108 TU·mL-1,适合感染目的细胞,经过筛选,CO3对zyxin在293T细胞中的表达干扰效果最佳。成功构建了zyxin基因RNA干扰慢病毒表达载体,并进行了有效干扰靶点的筛选,为进一步研究zyxin基因的功能奠定了基础。

人类疱疹病毒8型病毒干扰素调节因子编码基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的:分离、克隆人类疱疹病毒8型(HHV-8)编码的病毒干扰素调节因子(virusinterferonregulatoryfactor,vIRF)基因K9,并将其导入真核细胞中进行表达。方法:根据GenBank登记的K9基因核苷酸序列设计一对PCR引物,其5′端分别引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。以原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增K9基因,经双酶切后克隆进真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pK9。为了便于蛋白检测,再设计第二对引物,上游引物不变,在下游引物5′端引入了Flag序列。以质粒pK9为模板再次PCR,扩增K9-Flag基因,并把K9-Flag序列克隆入pcDNA3.1(+)中,得到重组质粒pK9F。重组质粒经酶切鉴定,核酸序列测定和分析后瞬时转染NIH3T3细胞,用RT-PCR、Westernblot分别从核酸和蛋白水平检测K9基因的表达情况。结果:PCR分离、克隆的K9-Flag序列全长1380bp,核酸序列分析显示克隆的K9基因与GenBank中己经登记的K9基因序列100%同源,引入的Flag序列完全正确;RT-PCR和Westernblot都在K9预期位置检测到特异性条带。结论:HHV-8K9基因在NIH3T3细胞中获得了正确表达。

HuR基因的慢病毒干扰载体构建及其病毒包装

目的构建人HuR基因慢病毒干扰载体和基因敲低细胞株,为揭示C/EBPβ3’UTR RNA与HuR蛋白相互作用抑制肝癌细胞增殖的分子机制奠定基础。方法根据shRNA设计原则设计人HuR基因的shRNA序列,用化学合成法合成shDNA序列,以LV10(pGLVU6/RFP/Puro)为载体骨架,构建慢病毒干扰载体LV10-HuR,并与慢病毒包装辅助载体(pLP1、pLP2和pLP/VSVG)共转染HEK293T细胞,收集病毒液纯化后感染SMMC-7721细胞并用嘌呤霉素杀死未感染的肝癌细胞,荧光显微镜下挑取单克隆红色荧光细胞集落,扩大培养后通过Western blot验证肝癌细胞内源性HuR蛋白表达。结果经DNA测序鉴定,LV10-HuR正是所需的慢病毒干扰载体。通过共转染获得的重组慢病毒颗粒感染的肝癌细胞在荧光显微镜下显示红色荧光。嘌呤霉素筛选和单克隆细胞集落挑取获得显示红色荧光细胞株,western blot证明稳转细胞内源性HuR基因表达下降,证明LV10-HuR慢病毒干扰载体可以抑制肝癌细胞内源性HuR基因表达。结论成功构建慢病毒干扰载体LV10-HuR,包装出有活性的重组慢病毒颗粒,建立HuR基因敲低肝癌细胞株。

调控抗病毒干扰素产生的信号转导机制研究进展

干扰素（ Interferon，IFN）是有效抵抗病毒入侵的多功能细胞因子，在先天性免疫抗病毒感染过程中发挥重要作用，探讨病毒抑制干扰素产生的信号转导机制是目前研究的热点［1］。 IFN分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，Ⅰ型与Ⅱ型IFN都具有抗病毒作用，但Ⅰ型IFN 是机体对抗病毒感染的关键因素［2］。 I 型IFN可由多种细胞产生，II型IFN只能由NK细胞、激活T淋巴细胞、巨噬细胞和神经元细胞等特定细胞产生。Ⅰ型IFN既然为抗病毒先天性免疫的主要细胞因子，那么它是如何产生，

人Spsb1基因慢病毒干扰载体的构建及病毒包装

目的:构建人Spsb1基因的shRNA慢病毒干扰载体,为研究该基因在肝癌细胞生长、增殖、转移和浸润中的作用打下前期基础。方法:根据shRNA的设计原则设计一段shRNA和阴性对照shRNA,化学合成DNA双链中的两条单链,通过退火和配对后与慢病毒干扰载体LV-3(p GLVH1/GFP+Puro)连接,阳性克隆子LV3-Spsb1测序鉴定;将LV3-Spsb1和辅助质粒p CMV-delta8.91/p CMV-VSVG共转染HEK293T细胞,转染后24 h在荧光显微镜下观察细胞转染效率;用转染后收集到的病毒液感染肝癌细胞SMMC-7721,荧光显微镜下观察细胞荧光;用1 mg/L嘌呤霉素杀死未感染的细胞,Western blot检测细胞内源性Spsb1基因表达量。结果:测序鉴定证明获得的LV3-Spsb1质粒是所需要的目的慢病毒shRNA干扰载体;通过与辅助质粒共转染HEK293T细胞后,细胞在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光,提示细胞转染效率较高;病毒液感染SMMC-7721后,细胞内出现绿色荧光,证明共转染系统可以成功包装shRNA-Spsb1重组慢病毒颗粒;Western blot结果显示shRNA-Spsb1重组慢病毒能够抑制细胞内Spsb1基因表达,证明shRNA-Spsb1的确可以降低肝癌细胞内源性Spsb1基因表达,可用于后期的基因功能研究。结论:成功构建人Spsb1基因的慢病毒shRNA干扰载体LV3-Spsb1并包装出其慢病毒颗粒。

慢病毒干扰CD147表达对Aβ_(42)诱导SH-SY5Y细胞凋亡中p-AKT和p-mTOR表达的影响

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子CD147可降解细胞外淀粉样蛋白Aβ42,参与Aβ42的代谢从而保护细胞活力。本研究利用慢病毒干扰SH-SY5Y细胞中CD147的表达并筛选稳定表达株,Aβ42作用24h后观察p-AKT和p-mTOR的蛋白表达变化。结果发现,与对照组相比,干扰组中CD147蛋白表达降低约60%,p-AKT和p-mTOR表达均降低。

附睾血管内皮生长因子基因慢病毒干扰载体的构建

目的:以血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA为靶点,设计、构建VEGF的RNA干扰慢病毒载体,并对其在大鼠附睾的沉默效果进行验证。方法:构建3种附睾VEGF-shRNA慢病毒表达载体VEGF-shRNA-1、VEGF-shRNA-2、VEGF-shRNA-3,提取3种阳性克隆质粒测序,转染HEK293-T细胞后产生慢病毒质粒。大鼠随机分为空白对照组、NC-shRNA阴性感染组、VEGF-shRNA-1感染组、VEGF-shRNA-2感染组、VEGF-shRNA-3感染组,将病毒液分别注射到各组大鼠双侧附睾;实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹检测各组大鼠附睾VEGF的mRNA及蛋白沉默效果。结果:测序结果证明3种慢病毒载体被包装成功。感染大鼠附睾后,VEGF感染组mRNA及蛋白表达量均较阴性感染组和空白对照组明显降低,其中以VEGF-shRNA-3感染组干扰效果更为有效。结论:成功设计了VEGF基因的RNA干扰靶点和制备了VEGF基因的慢病毒载体,VEGF-shRNA-3能有效抑制附睾VEGF的表达。

计算机病毒干扰——一类新型的电子战

计算机病毒概念的应用已建立起一类侵袭电子战处理机的新型电子战。

牛病毒性腹泻病毒干扰猪瘟病毒的试验研究

应用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)对8组32只健康家兔人工接种,进行干扰猪瘟兔化弱毒病毒试验,其结果10^(-2.0)组2/4家兔呈定型热反应,其单数免疫量(IMD_(50))为10^(2.0)1.0 ml;用 BVDV 对7组29头健康猪人工接种,进行干扰猪瘟病毒(HCV)试验,其结果10^(-2.0)组2/4猪发病死亡,其IMD_(50)为10^(2.0)1.0ml;用5.0mlBVDV 原液接种4头健康猪,接种后猪无任何不良反应.根据本项试验结果,综合国内外研究报道,认为 BVDV 对 HCV 具有一定程度的免疫作用,在特定时期具有应用价值.

雄激素受体基因慢病毒干扰载体的构建及在肝癌细胞中的表达

目的:构建敲减人雄激素受体(AR)基因的慢病毒质粒,转染Hep3B细胞使其表达目的蛋白并探索其对PTEN、p-AKT蛋白表达的影响。方法:设计合成3对针对AR基因特异性敲减的寡核苷酸片段,分别连接于重组慢病毒载体pLKO.1,构建3条AR干扰载体。利用验证正确的3个慢病毒载体转染293T细胞得到慢病毒上清液。采用RT-PCR和Western blot在5株肝癌细胞中挑选AR高表达的细胞系进行AR慢病毒上清液感染。RT-PCR和Western blot检测3条AR干扰质粒在Hep3B细胞内的表达及其对PTEN、p-AKT蛋白表达的作用。结果:测序鉴定证实3条AR慢病毒干扰载体构建成功,干扰Hep3B细胞后,RT-PCR和Western blot结果显示其中1条AR干扰后的mRNA和蛋白表达明显降低,细胞内PTEN蛋白表达升高,p-AKT表达降低。结论:成功构建3条AR干扰载体,其中1条干扰效率较高,能在Hep3B细胞中干扰AR的表达,感染细胞后上调抑癌基因PTEN的蛋白表达对p-AKT有抑制作用,提示AR和PTEN/AKT信号通路可能具有相关性。

计算机病毒干扰—一种新型的电子战

应用计算机病毒概念创造了一种破坏电子战处理机的电子战。过去几年的许多事件已清楚地表明,计算机病毒不仅是可行的,而且能迅速引起计算机系统及其网络的灾难性破坏。由于当前军用电子系统的发展趋势增加了这些系统遭受计算机病毒攻击的脆弱性,所以,创造了一种新形式的电子战——通过电路使计算机病毒微码侵入受害的电子系统。这一概念可称作计算机病毒干扰(CVCM)。军用电子系统包括各种各样的传感器、控制系统、通信设备和电子战设备。传感器包括:雷达、红外系统、光电系统和激光器。它们起着许多关键性的作用,包括监视系统的工作和目标的出现情况。控制系统包括:自动驾驶系统、稳定系统和地形跟随引导系统。通信系统提供参与人员之间分配战斗任务和交换数据所需要的联络。电子战系统则利用电磁频谱提供威胁告警、平台自卫及对威胁系统进行干扰。

鸡MAPK8生物信息学分析及慢病毒干扰载体效率检测

研究旨在对鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)向鸡精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSC)分化过程中显著差异基因——丝裂原活化蛋白激酶8(Mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8)进行生物信息学分析,验证MAPK8慢病毒干扰载体活性及干扰效率,为后期验证MAPK8在ESC向SSC分化过程中的调控方式以及功能研究奠定基础。试验采用RNA-seq和qRT-PCR分析和检测鸡ESC、PGC和SSC的差异表达基因;利用生物信息学在线预测软件对其进行理化性质及结构特征分析;比较鸡MAPK8基因序列与其它物种的同源性并进行组织表达谱检测;验证MAPK8慢病毒干扰载体的活性与干扰效率。结果显示:MAPK8在SSC上特异高表达;生物信息学分析显示鸡MAPK8是一种亲水性的无信号脂溶性蛋白,存在2个N-糖基化位点、13个O-糖基化位点和45个磷酸化位点,与其它物种高度同源(序列一致性达到80%),保守性较高;表达谱分析发现其在性腺中高表达;MAPK8慢病毒干扰载体能够稳定表达EGFP荧光蛋白且shRNA-1干扰效率最佳。该结果为深入探究MAPK8在鸡ESC向SSC分化过程中的功能奠定了基础。

警惕9”新病毒干扰你的 PC

世纪之末,病毒制造者们也不甘寂寞。昨天人们还在忙着绞杀BO黑客程序,堵塞网络安全的漏洞,今日新的威胁又以疯狂之势卷土重来。最近出现的两个计算机病毒,正肆虐的吞噬着PC机健全的肌体,且流毒传播广泛,对计算机安全危害极大,这不能不引起计算机用户的高度警觉。下面就这些新病毒的特点及防杀措施谈几点建议,供广大计算机用户参考。破坏性极强的宏病毒DELTREE_C

呼吸道病毒流行特点及影响因素

呼吸道病毒常引起疾病流行或大流行,严重威胁人类健康、公共卫生和社会发展。呼吸道病毒由于变异较快,缺少有效的疫苗和抗病毒药物,防控难度大。在药物和疫苗研发滞后的情况下,非药物干预措施是预防病毒感染和传播的重要方式。深入了解呼吸道病毒传播和流行特点及其影响因素,是合理制定有效防控措施的前提和基础。本文对呼吸道病毒流行的3个显著特点,即空气气溶胶传播、季节性和病毒干扰现象的最新进展进行综述,对未来研究和合理防控措施的制定做了展望。

基于VIGS技术干扰病毒RNA防控烟草黄瓜花叶病毒病

黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)引起的花叶病是烟草上的重要病害。本试验通过病毒诱导基因沉默技术(virus induced gene silencing,VIGS)构建靶向沉默CMV-1a、CMV-2a、CMV-MP和CMV-CP的VIGS载体,测定基因沉默后CMV相对表达量、CMV病毒浓度和TRV相对表达量,并对VIGS载体对CMV的防治效果进行评价。结果表明,试验建立的VIGS载体能够有效导入烟株;沉默CMV-2a的处理CMV相对表达量最低,基因沉默效率最高,为46.25%;接种病毒30 d后CMV-2a处理的病毒浓度最低,仅为对照的72.8%,TRV载体的相对表达量显著高于其他处理;沉默CMV-2a的处理发病时间推迟,病情指数最低,防治效果最好。本研究建立的CMV-2a VIGS体系能够有效沉默外源侵入的CMV基因表达,抑制CMV在烟株内的传播,为防治烟草黄瓜花叶病毒病提供了新的思路与方法。

营养剥夺诱导髓核细胞Bcl-2/腺病毒干扰蛋白3表达及线粒体转位的实验研究

目的通过营养剥夺模拟体内髓核细胞退变微环境,检测Bcl-2/腺病毒干扰蛋白3(Bcl-2/adenovirusE1B 19-kDa-interacting protein 3,BNIP3)表达及线粒体转位情况,为进一步探索髓核细胞退变死亡机制提供实验依据。方法成年清洁级SD大鼠2只,雌雄不限,体重150～200 g。体外分离获取鼠尾椎问盘髓核细胞,将传代后细胞分别置入正常环境(对照组:L-DMEM培养基、10%FBS、21%O_2)和营养剥夺环境(实验组:DMEM无糖无血清培养基、1%O_2)培养24、48、72 h后,实时荧光定量PCR、细胞免疫荧光染色及Western blot检测BNIP3基因及蛋白表达,流式细胞仪检测凋亡率及线粒体膜电位。结果实时荧光定量PCR、细胞免疫荧光染色及Western blot检测显示对照组细胞低表达BNIP3;实验组随培养时间延长,BNIP3表达呈上升趋势,且BNIP3与线粒体相结合;除培养后24 h实验组BNIP3基因表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各时间点实验组BNIP3基因及蛋白表达与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测显示,对照组细胞凋亡率较低,且细胞保持较高的线粒体膜电位;而实验组随培养时间延长细胞凋亡率增加、线粒体膜电位降低,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论营养剥夺可能通过诱导BNIP3表达增加并结合线粒体导致线粒体功能障碍,最终导致髓核细胞死亡。

秦川牛Gli2基因重组干扰腺病毒的构建

【目的】构建秦川牛醇溶蛋白2(Gli2)基因的重组干扰腺病毒,为研究Hh信号通路在秦川牛脂肪形成过程中的功能奠定基础。【方法】构建3条短发卡RNA(shRNA):shRNA-LY1、shRNA-LY2、shRNA-LY3,利用双荧光素酶报告系统检测其干扰效率。再用干扰效率较高的shRNA-LY3构建腺病毒干扰载体pAD/PL-DEST/CMV-GFP/U6-LY3,转染HEK 293A细胞进行腺病毒的包装并扩繁以提高病毒滴度。利用LaSRT法测定腺病毒的滴度,并将得到的病毒以不同剂量侵染秦川牛脂肪细胞,确定其最佳感染复数(MOI)。【结果】筛选得到shRNA-LY3干扰效率最高,达到85%;成功构建了秦川牛Gli2基因腺病毒干扰载体pAD/PL-DEST/CMV-GFP/U6-LY3,包装后获得了重组干扰腺病毒Ad-shRNA-LY3;LaSRT法测得其滴度为1×10~9 PFU/mL。腺病毒对秦川牛脂肪细胞的最佳MOI为50。【结论】成功构建了秦川牛Gli2基因腺病毒干扰载体,包装后获得了高滴度的重组干扰腺病毒Ad-shRNA-LY3,其对秦川牛脂肪细胞的最佳MOI为50。

疫苗毒种支原体检测中去除本病毒干扰方法的探索

目的探索疫苗毒种支原体检测中去除本病毒干扰的方法。方法分别采用非敏感细胞直接接种法、特异性抗血清中和法及离心加中和法处理21株疫苗毒种样品后,评价去除本病毒干扰的效果。结果21株疫苗毒种中,13株可通过非敏感细胞法去除本病毒干扰;6株可通过特异性抗血清中和法去除干扰;2株可通过离心加中和法去除干扰。应用上述3种方法检测161批疫苗毒种,均能有效去除本病毒干扰。结论非敏感细胞直接接种法、特异性抗血清中和法及离心加中和法可针对不同毒种去除本病毒的干扰,适用于疫苗毒种的支原体检测。