新疆部分地区牛病毒性腹泻-黏膜病病毒的分离鉴定

【目的】了解新疆地区BVDV毒株的生物型和基因型。【方法】采集新疆石河子和伊犁地区疑似感染病毒性腹泻-黏膜病病毒牛的新鲜粪便174份,应用RT-PCR方法对其进行检测,将检测结果为阳性的样品接种于MDBK细胞上培养,电镜观察,测定毒价,使用RT-PCR方法对细胞培养物进行鉴定,并提取质粒进行测序,对结果分析。【结果】该毒株可使MDBK细胞发生病变,扩增出一条286 bp目的片段,经同源性和遗传进化分析,确定为BVDV-1型毒株。【结论】分离到一株BVDV-1型新疆毒株,可使MDBK细胞发生病变,病毒粒子直径约为20~40 nm,毒株TCID5010-4.5/0.1 m L。

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒E2基因在卡介苗中的优化表达

为构建牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)基因工程活载体疫苗,根据已知的BVDV Changehun184毒株E2基因序列,利用DN.AStar生物学软件对其进行分析,预测了可能存在的抗原表位,设计6对引物,分别扩增了包含预测抗原位点的6个片段,1—297 aa、1—345 aa、1—374 aa、45—297 aa、45—345 aa和45—374 aa,克隆至穿梭表达载体pMV361中,经酶切、PCR扩增和测序证实已正确插入到表达载体中,构建了6个原核表达质粒。阳性重组质粒通过电转化到卡介苗(BCG)感受态中,热诱导后,进行SDS-PAGE分析和免疫印迹检测。结果表明6个重组质粒在卡介苗中均有不同程度的表达,表达产物与理论推测的相对分子质量一致。Western blot结果显示其融合蛋白能被牛抗BVDV的阳性血清识别,具有相应的反应原性。本研究为进一步研究BVDV基因工程活载体疫苗奠定了基础。

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒E2基因重组卡介苗初步免疫研究

为评价表达牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(BVDV)E2基因重组卡介苗(rBCG)的初步免疫效果,本研究分别将rBCG-pMV261-E2和rBCG-pMV361-E2免疫实验用大耳白兔,通过间接ELISA方法和T淋巴细胞转化试验分别检测兔体内体液免疫和细胞免疫应答水平。结果显示在体液免疫方面,两组rBCG均从第7 d开始产生BVDV抗体,抗体水平逐渐上升,在42 d达到峰值,并且rBCG-pMV361-E2刺激所产生的抗体水平始终高于rBCG-pMV261-E2;而rBCG血清中的抗结核菌抗体水平与正常BCG无显著差异,与BVDV阳性对照组和阴性对照组之间则差异显著;在细胞免疫方面,与阴性对照组相比,两组rBCG与BVDV灭活苗相同,免疫实验兔后淋巴细胞对特异性刺激均有明显的增殖。表明两组rBCG免疫实验兔后均使其产生了体液免疫应答和细胞免疫应答,为进一步研制BVDV新型基因工程疫苗奠定基础。

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒双抗体夹心Dot-ELISA检测方法的建立

采用辛酸-硫酸铵法提取兔抗牛病毒性腹泻-黏膜病毒(BVDV)高免血清中的免疫球蛋白IgG,辣根过氧化物酶标记提纯后IgG,建立了检测BVDV抗原的双抗体夹心斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)法。结果显示,抗体最佳包被量为300μg/mL,酶标记抗体的最适浓度为1∶50倍稀释,以5%牛血清作为封闭液、封闭45min效果最佳,抗原最小检出量是1.34μg/mL。应用建立的检测方法对河北省内78份腹泻奶牛血样进行了检测,阳性检出率为57.69%;经卡方检验分析,建立的Dot-ELISA与琼脂扩散(AGP)法相比较,阳性检出率差异显著。试验证明,该方法具有简便快速、特异性强、重复性高的优点,适合于基层兽医的检测诊断。

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒斑点酶联免疫吸附检测法的建立

采用辛酸-硫酸铵法提取兔抗BVDV高免血清中的免疫球蛋白IgG,在混合硝酸纤维素膜上进行间接酶联免疫吸附试验,建立了检测BVDV抗原的斑点酶联免疫吸附检测法。结果显示,抗体最佳包被量为400μg/mL,酶标记羊抗兔IgG的最佳工作浓度是1:500倍稀释,抗原最小检出量是5.36μg/mL。应用建立的检测方法对78份腹泻奶牛血样进行了检测,阳性检出率为58.97;经卡方(χ2)检验分析,建立的间接Dot-ELISA与AGP法相比较,阳性检出率差异显著。证实该方法敏感性高、简便快速,适合于基层兽医的检测诊断。

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒E_2基因重组卡介苗的构建

本试验将成功克隆的牛病毒性腹泻-黏膜病病毒Changchun184株E2基因与大肠杆菌-分枝杆菌整合表达载体pMV361连接,构建重组整合质粒pMV361-E2。并确定了电转化的最佳条件:2.0 kV/cm、25μF、1 000Ω,成功获得了E2基因重组卡介苗。在45℃下热诱导E2基因在重组卡介苗中的表达,通过SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测,结果显示,在44 kD处出现目的条带,符合E2基因表达蛋白的大小,表明牛病毒性腹泻-黏膜病病毒E2基因在卡介苗中成功表达。

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒Changchun184株E_2基因在卡介苗中的表达

在成功克隆牛病毒性腹泻-黏膜病病毒Changchun184株E2基因的基础上,将E2基因与表达载体pMV261连接,构建了重组穿梭质粒pMV261-E2,后电转化到卡介苗中,获得了具有卡那霉素抗性的重组卡介苗,并对重组卡介苗进行菌落PCR鉴定。在45℃下热诱导E2基因在重组卡介苗中的表达,并对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Wesern blotting分析。结果证明,牛病毒性腹泻-黏膜病病毒Changchun184株E2基因在卡介苗中成功的表达。

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒分离鉴定及生物学特性研究

为分离鉴定新疆地区牛病毒性腹泻—黏膜病病毒（BVDV）流行毒株,掌握该毒株的生物学特性,本试验在新疆北疆部分地区采集牛病毒性腹泻—黏膜病（BVD/MD）疑似病例的粪便,通过RT-PCR检测、细胞分离培养、间接免疫荧光抗体检测、免疫电镜观察及血清中和试验5种方法对毒株进行分离和鉴定。对毒株的TCID50测定后,再对毒株分别进行乙醚敏感性试验、氯仿敏感性试验、胰蛋白酶敏感性试验、酸碱度敏感性试验、温度敏感性试验及核酸分型试验等理化特性检测。经RT-PCR诊断,病料在286bp处出现了目的片段。将RT-PCR诊断为阳性的粪便,接种于密度约为80%的单层MDBK细胞出现了细胞病变,盲传5代至出现典型的细胞病变。将F5代细胞培养物采用间接免疫荧光抗体检测,结果产生了与C24V标准毒株相同的特异性黄绿色荧光。免疫电镜观察到了大量呈球形的BVDV粒子,大小20-40nm。血清中和试验中抗体阳性血清处理组细胞均未出现细胞病变,病毒完全被抗体阳性血清中和。综合以上方法确定分离株为BVDV毒株。对分离株进行毒价和理化特性测定,该毒株TCID50为10-4.5/0.1mL,对乙醚和氯仿敏感,对胰蛋白酶敏感,耐碱不耐酸,对温度敏感,经54℃1h完全被灭活,属于RNA病毒。本试验成功分离到一株新疆BVDV流行毒株,掌握了该毒株的生物学特性,为今后该病的诊断和防控奠定了基础。

规模牛场牛病毒性腹泻-黏膜病流行病学调查

[目的]掌握病毒性腹泻-黏膜病(BVD-MD)在规模牛场3个品系牛间的感染状况,了解不同品系间BVDV感染是否存在差异。[方法]选择新疆师市范围内的19个规模牛场,分别饲喂中国荷斯坦奶牛(以下简称荷牛),弗莱维赫乳肉兼用牛×荷斯坦奶牛杂交代乳肉兼用牛(以下简称弗荷牛),挪威红牛×荷斯坦奶牛杂交代乳肉兼用牛(以下简称挪荷牛);共计采集血清样品7 965份,分别使用牛病毒性腹泻(BVD)实时荧光RT-PCR检测和牛病毒性腹泻ELISA方法检测抗原和抗体阳性率。[结果]实时荧光RT-PCR阳性总检出率为1.72%,荷牛阳性检出率为1.73%,弗荷牛阳性检出率为1.35%,挪荷牛阳性检出率为2.05%;场群阳性检出率为68.42%;3个品系的犊牛、青年牛、后备牛、成母牛均检测到BVDV,3个品系牛之间抗原阳性率差异不显著;牛病毒性腹泻ELISA方法检测阳性总检出率为36.69%,荷牛阳性检出率为37.11%,弗荷牛阳性检出率为36.74%,挪荷牛阳性检出率为34.02%,场群抗体阳性率为100%,3个品系牛之间抗体阳性率差异不显著。[结论]师市规模牛场3个品系牛均存在BVDV感染,且不同品系间BVDV感染率差异不显著。

牛病毒性腹泻-黏膜病的诊断防治

牛病毒性腹泻-黏膜病是一种常见的传染病,对畜禽经济和养殖业产生了不小的影响。随着畜牧业现代化的进展,随之而来的是对牛病毒性腹泻等疾病的更高关注和防治要求。本文将介绍牛病毒性腹泻-粘膜病的诊断、防治措施,以期能够为广大畜牧业生产者提供参考和帮助。

牛病毒性腹泻病毒E^(rns)-ELISA抗体检测试剂盒的制备

为建立快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的血清学方法,本试验以BVDV NADL毒株结构蛋白E^(rns)作为包被抗原,优化反应条件并组装BVDV酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测试剂盒,通过重复性试验、灵敏性试验、符合率试验和保存期试验验证该试剂盒的准确性、灵敏性和稳定性。结果显示,抗原包被浓度为4μg/mL,1%酪蛋白溶液37℃封闭45 min,被检血清以1∶400稀释孵育30 min,兔抗牛HRP标记二抗以1∶20000稀释孵育30 min,TMB底物反应5 min时,ELISA的反应背景下降,区分度最好。优化后方法的批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均在10%以内,表明该试剂盒具有较好的稳定性;灵敏性试验结果显示,当阳性血清稀释度达到1∶6400时仍可以检测为阳性,说明该试剂盒灵敏度较高;该试剂盒与美国爱德士生物科技公司(IDEXX)BVDV总抗体检测试剂盒共同检测466份临床血清样品,两者总符合率为89.1%;保存期试验结果显示,第4个月时该试剂盒仍能检测到阳性血清,说明稳定性较好。综上表明,本试验利用E^(rns)蛋白建立的BVDV间接ELISA抗体检测试剂盒灵敏度高且重复性好,可为BVDV抗体检测和流行性调查提供新的方法。

牛病毒性腹泻-黏膜病的流行现状与防控策略

牛病毒性腹泻-黏膜病是生产养殖中比较常见的一种传染病,该病对养牛业、养羊业、养猪业等均可造成严重影响。易感动物包括犊牛、绵羊、山羊、猪和鹿等其他野生动物,患病动物常表现为精神不振、食欲不佳、腹泻、黏膜糜烂、体质量下降、繁殖性能降低等特征,同时造成动物免疫力低下,容易引发其他病原体的继发感染,加大养殖场疾病防控难度,带来巨大经济损失。目前在养牛业中,采取的防控方法是筛查并淘汰持续感染牛、群体进行疫苗免疫和持续进行疾病监测,达到降低牛群牛病毒性腹泻-黏膜病的发病率,并逐步做到疾病净化,促进养牛业乃至养殖业的安全和健康发展。

肉牛病毒性腹泻-黏膜病的发生与综合防控

病毒性腹泻-黏膜病是肉牛较为高发的一种疾病,该病主要以免疫抑制、免疫耐受、母牛繁殖障碍、黏膜溃疡、腹泻、发热为临床表现,不仅具有较高的致死率,且会对肉牛吸收利用饲料以及机体产肉增重产生直接影响。基于此,本文首先分析了肉牛病毒性腹泻-黏膜病的流行病学、临床症状、剖检变化、诊断方法,然后着重探讨了肉牛病毒性腹泻-黏膜病的治疗方法及防控策略,以期为广大肉牛养殖人员提供参考。

牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对4~6月龄犊牛的安全性研究

本试验旨在评估牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗对4~6月龄犊牛的安全性。12头4~6月龄犊牛随机分成3组,每组4头,各组分别肌肉注射牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗、牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失弱毒疫苗或疫苗稀释液,2 mL/头。试验结果表明,免疫后所有试验用牛无牛病毒性腹泻病毒引起的发热和临床症状,也不引起白细胞水平的下降;仅1头牛在免疫牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因缺失疫苗后第7 d检测到病毒血症和鼻腔排毒,在其他时间点均为阴性。所有犊牛均无大体病理学和组织病理学变化。综上所述,牛病毒性腹泻病毒1型KE-9基因缺失弱毒疫苗和牛病毒性腹泻病毒2型NY-93基因弱毒疫苗对4~6月龄的犊牛安全性良好。

牛病毒性腹泻黏膜病诊断与防治

牛病毒性腹泻黏膜病是由病毒性腹泻病毒引发的一种急性热性传染性疾病,临床上患病牛主要表现为发热腹泻、黏膜出现病变。该类疾病对妊娠阶段和犊牛阶段的牛造成的危害较为严重,母牛妊娠阶段受到病毒感染之后,会不明原因的出现流产或产下的胎儿畸形,犊牛表现出严重的腹泻,导致成活率显著下降,给养殖场造成较为严重的经济损失。再加上该类疾病属于免疫抑制性疾病,并且存在隐性感染的现象,一旦发生很难净化处理,会导致该类疾病在养殖场中周期性的传播蔓延,所以就需要掌握牛病毒性腹泻黏膜病的发生流行特点和诊断方法,并构建综合性的防治方案,确保早发现早处理。本文探讨了牛病毒性腹泻黏膜病的诊断与防治,希望对广大同行有所帮助。

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,在昆虫细胞中表达了BVDV E2蛋白,Western blot证实目的蛋白可与BVDV阳性血清发生特异性反应。ELISA优化结果显示,E2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清稀释度为1∶400,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min,最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD 450≥0.423。与血清中和试验法进行比较,总符合率为97.8%,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与牛常见病毒阳性血清均无交叉反应。说明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性和重复性良好,可用于大批量样本的临床检测和流行病学研究。

牛病毒性腹泻性黏膜病防控技术

牛病毒性腹泻性黏膜病(Bovine Viral Diarrhea-Mucosal Disease,BVD-MD)是一种由牛病毒性腹泻病毒引起的传染病。牛病毒性腹泻性黏膜病的病原体是一种BVDV病毒,主要通过接触传播。该病毒可以引起牛只的急性和慢性感染,导致牛只出现繁殖障碍、免疫功能抑制和生长发育迟缓等问题,给养殖业带来巨大的经济损失。目前,BVD-MD已经成为全球范围内牛养殖业的主要疾病之一。

牛病毒性腹泻病毒TaqMan探针荧光RT-PCR方法的建立和临床应用

为建立一种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的快速检测方法,本研究根据国内BVDV流行毒株5'-UTR序列保守区域设计1对特异性引物和TaqMan探针,并优化了反应条件,最终建立了一种检测BVDV基因1型(BVDV-1)的TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法,并开展7省份BVDV-1型检测和流行情况分析。结果显示:所建立方法能够特异性检测出BVDV-1,与基因2型BVDV、猪瘟病毒、边界病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒等病原无交叉反应;灵敏度高,最低检测下限为4.3 copies/μL;批内和批间变异系数均小于2%,重复性良好。7省份规模化牛养殖场BVDV-1型平均阳性率为17.40%(161/925),序列分析表明我国主要流行的为BVDV-1a,BVDV-1c亚型。本研究成功建立了一种良好的诊断BVDV的方法,监测地区优势流行毒株为BVDV-1a与1c亚型,为临床中BVDV早期诊断和流行病学调查监测提供了技术和数据支持。