HBV病毒样核心颗粒应用研究进展

病毒样颗粒(virus like particles,VLPs)是一种模拟病毒的颗粒形态特点,将外源基因片断产物呈递到病毒颗粒表面而形成的嵌合颗粒。它有与病毒颗粒相同的外部形态,甚至还有某些病毒受体的天然配体,同时还可将其他病原的特异性抗原等呈递在自己的表面,因而在病原体的疫苗研究和基因治疗研究中发挥着重要的作用。目前研究得较多的病毒样颗粒有HIV gag颗粒、HBc颗粒、HBs颗粒、酵母Ty颗粒等等,其中HBc VLP较受人注目。 HBc有自动组装的特性,其形成的核心颗粒有显著刺激B细胞、T辅助细胞及细胞毒T细胞产生免疫反应的能力,而且HBc颗粒在人体内没有细胞毒性作用,再加上HBc容许插入外源片段并可保持或增强外源蛋白的免疫活性,基因表达的杂合蛋白在多种表达体系中都具备颗粒形成能力,且形成的颗粒易于纯化制备。以HBc为载体的疫苗生产研究、基因治疗方法研究在国外日益受到重视。现将有关这方面的研究进展简述如下。

重组病毒蛋白纳米颗粒治疗肺腺癌作用

目的研究基于乙型肝炎病毒核心蛋白的嵌合病毒蛋白纳米颗粒对肺腺癌动物模型的免疫治疗作用,为肺腺癌的纳米治疗技术提供依据。方法将人上皮细胞生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)B细胞抗原决定簇插入乙肝核心蛋白(hepatitis B core protein,HBc)的主要免疫显性区域(Major Immunodominant region,MIR),利用大肠杆菌进行表达纯化后,得到重组蛋白纳米颗粒HBc-HER2。将此重组蛋白纳米颗粒免疫小鼠肺腺癌皮下瘤模型,通过检测其血清中HER-2抗体水平及抗体型别,评价此纳米颗粒免疫原性。通过小鼠皮下瘤大小变化评价肿瘤治疗效果。结果得到了纯度较高的HBc-HER2重组蛋白,且电镜观察显示其形成了HBc-HER2纳米颗粒,动物实验表明免疫原性强,能够诱导机体产生高滴度的针对HER-2的抗体,并有良好的肿瘤治疗作用。结论基因重组的HBc-HER2在小鼠肺腺癌皮下瘤模型中有明显的抑制肿瘤作用,为肺腺癌的纳米治疗技术提供了依据。

促吞噬肽功能化的HBc VLPs纳米载体的制备

促吞噬肽(Tuftsin)是机体脾组织产生的生理活性肽,具有强大的免疫调节和免疫治疗潜力。乙型肝炎病毒核心蛋白病毒样颗粒(hepatitis B virus core protein virus-like particles, HBc VLPs)是由HBc自组装形成的空心纳米颗粒,其不仅能应用于药物的递送,还能应用于外源蛋白质的显示。因此,Tuftsin功能化HBc VLPs载体的研究在免疫治疗、分子递送等方面具有重要意义。本研究选用PET43.1-a质粒作为Tuftsin-HBc VLP的表达载体,以大肠杆菌BL21 (DE3)为工程菌进行诱导表达,通过盐析、分子筛层析和离子交换层析技术纯化生产Tuftsin-HBc VLP。利用Western印迹和ELISA分别对Tuftsin-HBc VLP上HBc和Tuftsin进行定性分析。结果显示,Tuftsin-HBc VLP可与抗HBc抗体和抗Tuftsin抗体发生特异性结合。透射电镜观察结果显示,Tuftsin-HBc VLP呈大小均一的球形结构,粒度分析仪测得Tuftsin-HBc VLP的直径约为30 nm。CCK8法显示,Tuftsin-HBc VLP在0~480μg/mL范围内,细胞增殖未见显著变化。上述结果表明,本研究成功制备了可以在原核系统中高效表达且安全有效的Tuftsin-HBc VLP生物纳米递送载体。

HBc-VLP的分子动力学模拟和结合自由能计算

乙型肝炎核心病毒样颗粒HBc-VLPs(Hepatitis B Core Antigen Virus-like Particles)因稳定性好且易于改造,被作为疫苗载体广泛使用,但影响VLPs稳定性的控制机制尚不清楚。采用分子动力学模拟研究了HBc-VLP中蛋白亚基二聚体、五聚体及六聚体复合物的稳定性,计算了体系中蛋白亚基的介电常数,避免了以往研究中直接使用经验参数的做法;通过分子力学-泊松玻尔兹曼溶剂可及表面积(MM-PBSA)方法计算亚基分子间的结合自由能,表明范德华作用能和非极性溶剂化作用能有利于促进相邻蛋白亚基间的亲和作用;根据计算结果可推测HBc-VLPs中六聚体比五聚体的稳定性更强,而两个六聚体之间或五聚体同六聚体之间形成的二聚体有助于进一步形成结构更加稳定的HBc-VLPs。该结论有助于生物工程中对HBc-VLPs的蛋白质改造,从而提高HBc-VLPs为载体的候选疫苗的稳定性。