抗丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体的制备及免疫组织化学研究

目的 制备丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体并进行免疫组织化学研究。方法 以大肠杆菌表达的重组丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白为固相抗原 ,利用抗原 抗体亲和性结合的原理 ,从半合成的人源可变区噬菌体抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验 (ELISA)和DNA序列分析 ,获得HCV核心蛋白的人源单链抗体 ;用该抗体对 772 1转染全长HCVcDNA后筛选的阳性克隆细胞中的HCV核心蛋白抗原进行免疫组化鉴定。结果 ELISA结果表明 ,制备的HCV核心蛋白人源单链抗体能与HCV核心蛋白抗原特异性结合 ;免疫组化结果表明 ,该抗体能够特异性识别HCV核心蛋白抗原 ,与正常肝细胞无交叉反应。结论 此法制备单链抗体方法简便 ,周期短 ,可为HCV核心蛋白病原的检测提供新的检测手段。

鸡对马立克氏病病毒免疫应答的转录组和蛋白质组研究

近年来兴起的病毒基因组或部分目的基因以及蛋白表达分析技术,为人们更好地认识宿主对马立克氏病病毒(MDV)的免疫应答机制提供了有利帮助。本文主要综述了从转录组学和蛋白质组学开展的有关MDV致病机理、宿主对MDV反应、MD遗传抗性或易感性以及疫苗诱导的免疫反应等方面的最新研究进展,并讨论了应用miRNA以及RNAi技术对基因、蛋白和信号通路在MDV与宿主相互作用中发挥重要作用的效应单位进行功能分析。

丙型肝炎病毒核心区的分子免疫学进展

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心区是对ＨＣＶ进行基因和血清分型的靶基因区。核心区存在ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ，这可能是ＨＣＶ逃避宿主的免疫应答而选择性突变的结果。在ＨＣＶ致病机理中，细胞免疫反应的损伤机理可能比病毒的直接作用更重要。核心区也是从基因水平上治疗ＨＣＶ感染和进行疫苗研究的重要区域。

利用蛋白质组学技术筛选与BIV基质蛋白MA相互作用蛋白

牛免疫缺陷病毒BIV的基质蛋白MA是由gag基因编码病毒结构蛋白之一,参与病毒运输包装等多种过程.通过蛋白质组学方法,寻找与MA有相互作用的宿主蛋白.通过原核表达MA-CBP融合蛋白,将其结合在几丁质上,并与细胞裂解物混合,纯化特异结合的细胞蛋白.利用双向电泳以及MALDI-TOF质谱分析,筛选到8个与MA具有相互作用的候选蛋白,功能涉及运输、氧化还原、热激反应等.进而克隆所鉴定蛋白之一的PRDX4,利用体外结合实验进一步证实其与BIV MA蛋白存在相互作用.初步建立利用蛋白质组学技术研究病毒与宿主相互作用实验方法,所得结果为了解慢病毒结构蛋白在病毒生活周期中功能提供了线索,有助于探索过氧化物酶家族蛋白在病毒感染过程中的作用及其分子机制.

再生蛋白质组学研究进展的力作——介绍《动物组织器官再生的比较蛋白组学研究》

由郑州大学出版社出版发行的《动物组织器官再生的比较蛋白质组学研究》一书是国家新闻出版广电总局“十三五”规划重点项目,获得国家出版基金资助。全书以大鼠肝再生以及分布于我国的蝾螈(Orientalis)断肢再生、三角涡虫(Japonica)头尾再生为研究对象,检测和分析了再生相关蛋白在动物组织器官中再生的生理、生化作用,包括细胞生长、细胞发育、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞的物质运输、细胞迁移、糖类代谢、脂类代谢、氨基酸代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、有机酸代谢、维生素、辅助因子代谢、激素代谢、一氧化碳代谢、生物氧化及活性氧代谢,论述了细胞内环境的稳定、对刺激的反应、免疫反应、凝血反应、炎症反应、自噬反应等,以及调节这些生理生化活动的信号通路活性。

有关鱼类病毒病的免疫学诊断技术综述

鱼类病毒病的研究始于1957年。Wolf等（1960）在美国首次分离出斑点叉尾鮰的传染性胰腺坏死病病毒（IPNV），相继报道的有，病毒性出血败血症病毒（VNSV，Jensen,1963)淋巴囊炎病毒（LDV，Wolf等1966）,河鲶病毒（CCV，Fijam,1968)鳗鲡口头部乳头瘤病毒（ESPV，Ptifzner,1969），

HCV非结构蛋白质5A基因全长和高免疫源区的表达及免疫活性检测

目的探讨HCV非结构蛋白质5A(NS5A)基因全长和高免疫源区的表达并比较其检测灵敏度。方法以含HCV全基因组的质粒pBRtm/HCV-3011(1型)为模板,采用PCR方法扩增出NS5A全长基因(以下用NS5AL代替)和高免疫源区基因(以下用NS5AS代替),与pET-32a载体相连接构建重组表达载体pETNS5AL和pET-NS5AS,分别转化E.coliRosetta(DE3)pLysS和BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,蛋白质印迹法检测其表达,镍螯合(Ni2+-NTA)琼脂糖亲和层析柱纯化重组NS5AL和NS5AS蛋白,最后通过ELISA法检测重组蛋白的免疫活性并对其检测灵敏度进行比较。结果SDS-PAGE鉴定与蛋白质印迹验证结果表明,重组NS5AL和NS5AS蛋白均得到很好地表达;纯化的重组NS5AL和NS5AS蛋白浓度分别为0.146和0.426mg/ml,纯度均>96%;ELISA检测结果表明,重组NS5AL和NS5AS蛋白均具有较好的免疫活性,且重组NS5AL蛋白的检测灵敏度明显高于NS5AS。结论成功地表达出重组NS5AL和NS5AS蛋白,均具有较高的免疫活性。

HCV核心蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫学特性的初步评价

通过逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从丙肝患者的血清中分离出编码完整ＨＣＶ核心蛋白（Ｃ区）的ｃＤＮＡ片段，并将其克隆到杆状病毒转移质粒中。重组转移质粒ＤＮＡ与线性的杆状病毒ＤＮＡ共转染Ｓｆ９昆虫细胞，经蚀斑筛选获得了带编码全部核心蛋白基因的重组杆状病毒。重组病毒感染细胞后表达ＨＣＶ核心蛋白，其分子量的为２０ｋＤ。免疫印染和酶联免疫实验表明，此重组蛋白能被人ＨＣＶ阳性血清所识别。动物实验表明此重组蛋白能诱导小鼠产生特异性抗体。

蛋白质组学在HIV感染及治疗中研究进展

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)的感染具有一定的特异性,巨噬细胞和其他宿主细胞对病毒感染的反应,调节蛋白的表达水平,蛋白的翻译和修饰,以及蛋白的细胞内定位和分泌都与之相关。因此,研究识别HIV调节的宿主蛋白是非常重要的。蛋白质组学因其高通量和高灵敏度而成为一种很好的技术。蛋白质组学的研究作为一种新的方法和思路指导研究者探寻蛋白质表达和HIV之间的相关性,中医药在治疗HIV方面已经取得良好的疗效,运用蛋白质组学的研究有助于揭示中医学的科学本质。

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因

应用抑制性消减杂技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCV核心蛋白反式激活相关基因。以HCV核心表达质粒 pcDNA3 1( ) core转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1( )为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,从中提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成 2组 ,分别与 2种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行 2次消减杂交及 2次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果显示 ,成功构建人HCV核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到 2 33个白色克隆 ,进行菌落PCR分析 ,其中 2 13个均得到 10 0～ 10 0 0bp插入片段。挑取 6 3个插入片段测序分析 ,其中 6个cDNA片段为未知序列 ,通过生物信息学分析获得其全长序列 ,已被GenBank收录。提示 6个新的cDNA全长序列 ,可能是HCV核心蛋白反式激活靶基因。

丙型肝炎病毒核心蛋白对细胞凋亡的影响

目的考察丙型肝炎病毒核心蛋白对细胞凋亡的影响,以期从另一个角度研究丙型肝炎病毒可能的致癌机理.方法应用流式细胞仪检测 HepG2-C 细胞和 HepG2-CMV 细胞对氨甲喋呤(MTX 10mg/L)和去血清的耐受.并进一步检测凋亡相关基因及产物的表达.结果应用流式细胞仪检测 HepG2-C 细胞和 HepG2-CMV 细胞对氨甲喋呤(MTX 10mg/L)的耐受,结果 HepG2-C 细胞24小时和48小时的凋亡率分别为5.1%和9.6%,而 HepG2-CMV 细胞为6.8%和16%.而去血清2,4,6天的 HepG2-C 细胞凋亡率分别为6.6%,9.4%,11.5%,而 HepG2-CMV 细胞分别为11.4%、13.5%、16.1%.表明表达丙肝病毒核心蛋白的细胞 HepG2-C 较转染空载体的细胞 HepG2-CMV 耐受凋亡.在进一步分子机理的探讨中发现 HepG2-C 细胞 P53,C-myc,Bcl-2表达增加,而 Fas 表达减低,转录水平也发生同样的变化.结论丙肝病毒核心蛋白可能通过调节基因转录与表达,抑制某些因素引起的细胞凋亡.

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的表达载体构建及在酵母中的表达

目的 :为探讨丙型肝炎病毒 (HCV)核心 (core)蛋白的功能 ,在真核生物酵母细胞中表达HCV核心蛋白基因。方法 :用多聚酶链反应 (PCR)的方法在HCV全长质粒 pBRTM HCV为膜板扩增HCV核心蛋白基因 ,克隆到pGEM T载体中 ,双酶切后回收连接到酵母表达质粒 pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质 ,进行十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和Western免疫印迹分析。结果 :成功构建HCV核心蛋白基因酵母表达载体 ,Western免疫印迹显示了HCV核心蛋白在酵母细胞中表达。表达产物在胞内存在 ,分子量 2 2 0 0 0ku左右。结论 :HCV核心蛋白在酵母中表达成功。

丙型肝炎病毒核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在哺乳动物细胞中的相互作用

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在哺乳动物细胞中的相互作用。方法分别扩增HCV核心蛋白core及其结合蛋白HCBP6的cDNA片段,克隆入pGEM-T载体。测序正确后应用双杂交技术把目的片段分别插入哺乳动物细胞双杂交系统的表达质粒pBIND和pACT中构建重组载体。将构建的pBIND-core和pACT-HCBP6重组载体和报告质粒pG5luc共转染HepG2细胞,并设背景对照组(pBIND+pACT)、阳性对照组(pBIND-Myod+pACT-Id)、2个阴性对照组(pBIND-core+pACT、pBIND+pACT-HCBP6)和空白对照组。采用Dual-荧光检测系统和TurnerBiosystemsVeritas微孔板化学发光检测仪检测荧虫素酶活性。结果成功构建重组载体pBIND-core和pACT-HCBP6,共转染HepG2细胞之后,其荧虫素酶活性与海肾素酶活性的比值与各对照组相比有统计学差异(P≤0·05)。结论HCV核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在肝癌细胞系中确有一定的相互作用,为进一步阐明HCV核心蛋白在细胞凋亡及细胞恶变中的作用机制提供了新的思路。

重组腺病毒介导的HBV核心蛋白和hEDN融合蛋白基因在小鼠肝脏的表达

目的 :使HBc hEDN基因重组腺病毒载体 (AdHBc hEDN)及其对照载体AdhEDN在小鼠肝脏获得表达 .方法 :将体外扩增获得的高滴度AdHBc hEDN和AdhEDN经尾静脉注射感染小鼠 ,并用免疫组化的方法检测AdHBc hEDN和Ad hEDN在小鼠肝脏中的表达 .结果 :重组腺病毒AdHBc hEDN和AdhEDN在小鼠肝脏均获得了阳性表达 .结论 :HBc

丙型肝炎病毒1b基因型核心蛋白对HepG2细胞Bax与Bcl-2基因表达的影响

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)1b基因型核心蛋白(C)对HepG2细胞B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)与Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达的影响,以探索1b型HCV C蛋白与HepG2细胞凋亡的关系。方法利用RT-PCR扩增出HCV-1b-C基因,经双酶切后连接pcDNA3.1(-),成功构建真核表达载体pcDNA3.1(-)/HCV-1b-C。利用脂质体转染HepG2细胞,RT-PCR及Western Blot检测其mRNA及蛋白的表达,RT-PCR及Western Blot检测转染成功后HCV-1b-C对HepG2细胞Bax与Bcl-2表达的影响,并设转染空质粒组及未处理组作对照。结果成功构建真核表达载体pcDNA3.1(-)/HCV-1b-C;瞬时转染HepG2细胞,成功表达HCV C mRNA及蛋白;转染C基因组的Bax的mRNA及蛋白相对表达量减少,与转染空质粒组及未处理组比较差异均有统计学意义(P<0.01);转染C基因组的Bcl-2的mRNA及蛋白相对表达量增多,与转染空质粒组及未处理组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 1b基因型HCV C蛋白转染HepG2细胞会导致Bax表达减少及Bcl-2表达增多,降低Bax/Bcl-2比值,可能是抑制HepG2细胞凋亡的机制之一。

基于乙型肝炎病毒核心蛋白的颗粒性肽展示载体的构建

为提高HBVpreS1aa21 47的免疫原性,将1～6拷贝的preS1(21 47)片段以串联方式插入HBcAg的aa78和aa82之间,在大肠杆菌中进行表达和纯化.携带1～3拷贝的重组抗原CI、CII和CIII的表达产量约占菌体总蛋白的20%,而携带4～6拷贝的重组抗原则未见明显表达.电镜检测显示重组抗原CI、CII和CIII可以形成形态与HBcAg类似的类病毒颗粒,颗粒直径在30～34nm之间.ELISA分析显示这3种VLP抗原具有很强的preS1抗原的免疫反应性,而对HBc单克隆抗体则基本失去反应性.提示外源多肽pre(21 47)可被有效地递呈至类HBc颗粒的表面,且外源多肽的插入使HBc主要的免疫优势表位遭到了破坏.这些证据表明利用HBcAg的专一性呈递能力来构建多价抗原可作为免疫原设计时的一种策略.

问号钩端螺旋体属特异性外膜蛋白LipL41抗原表位预测及免疫学鉴定

目的:预测及筛选问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性外膜蛋白LipL41有效T和B细胞(T/B)联合表位,了解不同基因型LipL41s差异T/B联合表位的免疫反应性差别。方法:采用生物信息学方法预测LipL41/1和LipL41/2分子中T/B联合表位。采用PCR扩增候选T/B联合表位片段,采用噬菌体展示及SDS-PAGE等技术获得含不同T/B联合表位的重组P。分别以rLipL41/1和rLipL41/2抗血清、黄疸出血群赖型赖株全菌抗血清和钩体患者血清为一抗,采用Western Blot检测各抗血清与各重组P免疫杂交反应性。结果:根据预测结果选择了LipL41s中8个共有或差异T/B联合表位。经PCR扩增获得了上述T/B联合表位片段。各T/B联合表位片段均准确插入噬菌体P蛋白N端并有效表达。各抗血清均能识别上述8个T/B联合表位,但其WesternBlot杂交信号强度存在差异,其中共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233与不同抗血清的信号较强且稳定。结论:所选择的8个T/B联合表位均为LipL41的有效抗原表位。共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233可作为钩体MAP疫苗的首选抗原表位。差异T/B联合表位LipL41s-89和LipL41s-299与不同抗血清有免疫交叉现象。

丙型肝炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定研究

目的构建含丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心(core,C)蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体,为C蛋白与宿主蛋白相互作用机制研究奠定基础。方法聚合酶链反应(PCR)法扩增HCV 1b基因型C蛋白基因,经EcoR I和Pst I双酶切后插入到诱饵载体pGBKT7中,构建含HCV C蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-Core,经酶切分析及核酸测序分析加以鉴定。醋酸锂法将pGBKT7-Core转化入酵母菌株Y2HGold,蛋白印迹法检测C蛋白的表达,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母细胞的毒性作用及对报告基因的激活作用。结果重组质粒pGBKT7-Core中的C蛋白基因为576 bp,经核酸测序分析与NCBI中注册的HCV 1b基因型C蛋白基因序列一致;转化酵母菌后检测到C蛋白的表达;HCV C蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性,且对报告基因无激活作用。结论含HCV C蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体构建成功,表达稳定。

丙型肝炎病毒核心蛋白在鼠肝中表达的诱癌作用

目的 :研究丙型肝炎病毒核心蛋白 (HCVcore)在鼠肝中的表达和可能潜在的直接致癌作用 .方法 :以病毒重组技术制备含HCVCore区cDNA的重组腺伴随病毒载体 .重组腺伴随病毒感染大鼠肝脏 ,感染 2 ,9mo后分别以Southernblot印迹杂交法和Dotblot杂交法检测鼠肝HCVCore区基因的整合、mRNA形成情况及病毒滴度 .HE染色观察诱癌实验结果 .结果 :收获重组病毒滴度为 2 .4 1× 10 14 颗粒数 (分子数 ) /L .分别感染 2 ,9mo后检测大鼠肝脏Southernblot印迹杂交结果和HCVcoremRNA均为阳性 ,HCVcore基因为非定点整合 .感染后 9mo实验组大鼠部分细胞有恶性倾向 .结论 :HCVcore在大鼠肝中持续表达 ,初步观察到其致瘤变作用 .

丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达

目的 在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体。方法 采用噬菌体表面展示技术 ,将丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白单克隆抗体固相包被于Nunc板。从人源噬菌体单链可变区抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,获得结合活性较强的人源HCV核心蛋白抗独特型 (抗 Id)scFv阳性克隆。从阳性克隆中提取质粒 ,经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后 ,亚克隆到pCANTAB5E载体 ,转化大肠杆菌XL1 Blue ,应用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导表达可溶性的HCV核心蛋白抗独特型单链可变区抗体。酶联免疫吸附法 (ELISA)证实表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv具有与HCV核心蛋白单克隆抗体反应的特异性。对转化的大肠杆菌XL1 Blue上清中表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv进行硫酸铵沉淀 ,并进行SDS PAGE电泳。结果 筛选得到的HCV核心蛋白抗 IdscFv片段基因由 774bp组成。SDS PAGE电泳表明 ,大肠杆菌XL1 Blue中表达的可溶性HCV核心蛋白抗 IdscFv分子量约 2 8kD。结论 HCV核心蛋白抗 IdscFv与HCV核心蛋白抗 IdscFv单克隆抗体具有较强的结合活性和特异性。HCV核心蛋白抗 IdscFv的筛选和表达成功 ,为今后HCV核心蛋白抗 IdscFv的研究和应用奠定了基础。