基于核酸适体LYGV1c的酶联吸附法检测石斑鱼虹彩病毒感染

【目的】利用核酸适体LYGV1c构建可快速、准确识别石斑鱼虹彩病毒(Grouper iridovirus Guangxi strain,SGIV-Gx)感染的酶联吸附法(Aptamer LYGV1c-based enzyme-linked apta-sorbent assay,LYGV1c-ELASA),为提高水产疫病检测及防控效率提供理论支持。【方法】基于生物素标记的LYGV1c(Bio-LYGV1c)开发核酸适体酶联吸附法(LYGV1c-ELASA)检测SGIV-Gx,通过对Bio-LYGV1c特异性、灵敏性、稳定性等实验评估其检测性能。通过珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂)SGIV-Gx感染试验进行活体验证,同时用荧光定量PCR(qPCR)测定衣壳蛋白基因(MCP)的表达,与LYGV1c-ELASA进行比较,验证该酶联吸附法检测的可信度。【结果】LYGV1c-ELASA的方法可特异性地识别SGIV的感染,Bio-LYGV1c识别SGIV感染的最适工作浓度为500 nmol/L,最适孵育时间为20 min,最适结合温度为4~28℃,LYGV1c-ELASA最低检测限为5×103 mL-1。活体验证结果表明,随着注射的SGIV-Gx浓度的升高,LYGV1c-ELASA检测出的石斑鱼体内病毒450 nm处的光密度(OD450)的值升高;qPCR结果表明,SGIV-Gx的MCP的表达量升高,与LYGV1c-ELASA检测结果相一致。【结论】建立的LYGV1c-ELASA技术不仅可用于体外检测,同时也适用于活体检测。LYGV1c-ELASA技术可实现对石斑鱼养殖过程中石斑鱼虹彩病毒病的快速诊断、实时监控。

乙型脑炎病毒核酸检测试剂国家参考品的研制

目的建立乙型脑炎病毒核酸检测试剂国家参考品,确定其质量标准。方法通过对24份病原体培养物的复核、确证,全基因组测序及基因分型,组成乙型脑炎病毒核酸检测试剂国家参考品,经多家实验室的协助标定,确定参考品的质量标准,并对参考品进行均匀性及稳定性评估。结果乙型脑炎病毒核酸检测试剂国家参考品由10份阴性、14份阳性、1份最低检出限和1份精密度样品组成。质量标准为10份阴性参考品应均检出阴性;14份阳性参考品应至少检出13份阳性;精密度考品重复检测10次,要求均为乙型脑炎病毒阳性,且其检测值的CV应不大于5.0%;最低检出限参考品要求1∶102倍稀释及以上浓度时应为乙型脑炎病毒阳性。参考品的均匀性及稳定性均符合要求。结论该参考品可用作乙型脑炎病毒核酸检测试剂的质量控制及评价。

基于变性泡介导的加速链交换扩增技术在新型冠状病毒核酸检测中的性能分析

运用变性泡介导的加速链交换扩增技术,建立一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测的新方法。收集潍坊市第二人民医院检验科1492例疑似SARS-CoV-2样本,以荧光定量PCR结果为参考,计算ASEA-SARS-CoV-2核酸检测试剂盒检测新型冠状病毒样本结果的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)。结果表明:ASEA可在30min内完成核酸扩增,检测限为1000拷贝·mL^(-1)。敏感性为96.7%,特异性为99.9%。该方法可在30min内检测SARS-CoV-2,而之前报道的传统qPCR方法需要数小时。建立了一种基于变性泡介导的加速链交换扩增技术检测新型冠状病毒的新方法。

丙型病毒性肝炎抗体检测与HCV高敏核酸检测对病毒性丙型肝炎的筛查价值研究

目的通过对本院2019年1月至2022年9月需进行手术、输血或其他侵入性医疗服务的住院患者的HCV血清学抗体及高敏HCV RNA筛查结果进行回顾性分析,探讨丙型病毒性肝炎抗体检测与HCV高敏核酸检测对病毒性丙型肝炎的筛查检测价值。方法对本院相关住院患者进行Elecsys Anti-HCV II或(和)高敏HCV RNA检测,统计分析其检测结果。结果HCV血清学抗体检测22443人次,阳性率为0.68%,阳性COI中位数为38.4(1.0~165)。高敏HCV RNA检测34628人次,阳性率0.30%,阳性病毒载量中位数为1.00×10^(6)IU/mL(3.50×10^(1)~4.00×10^(7)IU/mL)。两种方法学均显示45~59岁人群阳性率显著高于其他人群(P<0.001)。两种检测有重合的样本共17785人次,HCV抗体血清学阳性率为0.70%。高敏HCV RNA阳性率0.22%,如以高敏HCV RNA为丙型肝炎现症感染的标准,HCV抗体血清学检测HCV现症感染的灵敏度为100.00%(95%CI 89.09%~100.00%),特异性为99.52%(95%CI 99.41%~99.61%),现症感染阳性预测期PPV为32.00%(95%CI 23.82%~40.18%),阴性预期值为100.00%。HCV抗体血清学检测COI值与高敏HCV RNA检测的病毒载量无线性相关性,COI<10和COI>100的HCV RNA阳性率低。结论HCV抗体检测和高敏HCV RNA均为有效的丙型肝炎筛查手段,需进一步加强对重点人群的丙型肝炎感染管理。

酶联免疫吸附法与核酸检测技术在血站血液标本乙肝病毒筛查中的应用

目的探究酶联免疫吸附法(ELISA)与核酸检测(NAT)技术在血站血液标准乙肝病毒(HBV)筛查中的应用。方法选取2022年1月—2022年12月血站采集的血液标本12282份作为研究对象,所有标本均接受ELISA、NAT检测,以电化学免疫发光法(ECLIA)检测结果作为金标准,对两种检测方法的检测结果做一致性分析,并比较两种检测方法的窗口期、准确度、灵敏度、特异度2、阳性率、漏诊率差异,比较不同HBV感染状态患者HBV-DNA阳性率差异。结果ELISA检测HBV的窗口期高于NAT(P<0.05),准确度、灵敏度低于NAT,漏诊率高于NAT(均P<0.05);ELISA、NAT检测HBV的特异度、阳性检出率比较,无明显差异(均P>0.05);大三阳的HBV-DNA阳性率均高于小二阳、小三阳(均P<0.05);小二阳、小三阳两者的HBV-DNA阳性率比较,无差异(P>0.05)。结论ELISA与NAT均可良好应用于HBV检测,且NAT具备更高的准确度、灵敏度和更低的漏诊率,可良好反映HBV的传染性,是ELISA的有效补充。

核酸等温扩增技术在病毒检测中的应用

病毒是引发人类疾病的主要病原体之一.传统的聚合酶链式反应(PCR)技术虽然被广泛应用于病毒分子诊断,但其对温度的要求较为严格,限制了其在现场诊断中的应用.为了满足现场快速诊断的需求,核酸等温扩增技术得到快速发展,其无需热循环,可以在恒定温度下实现核酸扩增,可适应不同的应用场景.本文综合评述了等温扩增技术在病毒检测领域的最新进展,从病毒样本采集、核酸提取、等温扩增检测等几个方面分别进行阐述,探讨了酶辅助等温扩增技术、无酶等温扩增技术以及与多体系串联的级联扩增技术的原理、关键参数及其病毒检测应用,并对比了市场上相关试剂盒的特点.此外,讨论了当前核酸等温扩增技术在病原体检测应用中面临的一些难题,如提取效率、稳定性和成本等,提出了未来的发展方向,为进一步改善现场诊断效率提供了新的思路.

婴幼儿呼吸道感染中尿液巨细胞病毒核酸检测的临床意义

研究婴幼儿呼吸道感染中尿液巨细胞病毒核酸检测的意义。方法 选取的研究时间是2023年02月~2024年02月,研究对象为79例呼吸道感染患儿和79名健康体检婴幼儿,分别纳入观察和对照组别中,所有研究对象均进行巨细胞病毒核酸检测,分析监测结果。结果 (1)巨细胞病毒核酸检测结果显示,有27例阳,阳性率为34.18%,比对照组的阳性检出率22.78%更高,差异有统计学意义(P<0.05);(2)巨细胞病毒核酸检测阳性患儿按照相关治疗标准对症治疗,均好转出院。结论 巨细胞病毒核酸检测在儿童呼吸道感染早期检测中,有较高的临床应用价值,可以提高阳性检出率,能够促使巨细胞病毒核酸检测阳性患儿尽早得到科学的治疗,对疾病预后改善有重要的意义。

核酸检测技术在无偿献血者乙型肝炎病毒筛查中的应用

研究核酸检测技术的实施价值,分析该措施在无偿献血者乙型肝炎病毒筛查中的效果,进而为后续筛查工作提供科学依据。方法 本次研究样本选取为梧州市中心血站检验科无偿献血者乙型肝炎病毒筛查者,样本数量为15300例,选取时间为2023年01月-2023年03月,分别进行核酸检测(NAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA),数据均纳入SPSS26.0系统,分析上述措施在疾病筛查中的价值。结果 15300例无偿献血者乙型肝炎病毒筛查者中,NAT阳性16例,ELISA阳性为2例;结果显示NAT阳性检出率高于ELISA(P<0.05)。结论 NAT的阳性检出率较高,可以实现疾病的早期诊断及治疗,对保障输血安全、预防控制输血传染病的传播起到非常重要的作用。

新型冠状病毒核酸检测假阳性及假阴性影响因素分析

新型冠状病毒(简称新冠病毒)核酸检测在确诊新冠病毒感染和疫情防控中起重要作用。该文结合工作实践,从检测前、中、后质量控制3个方面分析标本质量、规章制度、人员培训、设备性能、试剂耗材、实验操作及结果判读等多种因素造成假阳性和假阴性结果的原因及应对策略,为探寻提升新冠病毒核酸检测的准确性、多角度优化新冠病毒核酸检测工作提供参考依据。

不同核酸提取方法对HBV-DNA检测性能验证情况分析

目的评估2种乙型肝炎病毒(HBV)-DNA提取方法及2家检测试剂的性能,有助于选择优化提取试剂和检测试剂。方法2023年4月采用达安全自动核酸提取仪提取法(磁珠法)和手工提取法(一步法),并用达安和圣湘2种HBV-DNA试剂检测,对其进行精密度、正确度、线性范围、检出限及抗干扰能力等性能进行验证和评价。结果达安全自动核酸提取仪提取达安试剂检测、手工提取达安试剂检测和手工提取圣湘试剂检测在精密度、正确度、线性范围、检出限方面验证结果均达标;达安全自动核酸提取仪提取圣湘试剂检测在低值检测中变异系数大于5%,最低检测限验证不合格;抗干扰能力方面,全自动核酸提取仪提取的2.0 g/dL血红蛋白浓度的样本用达安和圣湘试剂检测结果均不受影响。手工提取甘油三酯浓度达3000 mg/dL的样本用达安和圣湘试剂检测的结果均不受影响。结论不同厂家的提取和检测试剂避免混用,达安和圣湘试剂对HBV-DNA定量检测的结果均符合要求。

新型冠状病毒核酸检测结果可比性及试剂选择策略探究

目的:通过分析13个SARS-CoV-2核酸检测体系临床阳性样本病毒载量与Ct值相关性及偏倚,探讨不同检测体系的结果可比性、检出限及试剂选择策略。方法:选择13个SARS-CoV-2核酸检测体系,以中国计量科学研究院标准物质倍比稀释作为标准曲线与已经过数字PCR方法赋值的临床阳性样本同时检测,采用SPSS22.0统计分析,Graph-PadPrism7.0及Medcale15.0软件绘图,统计分析临床阳性样本Ct值与病毒载量相关性、与赋值浓度的偏倚及13个检测体系的实际检出限。结果:13种检测体系中均显示病毒载量与Ct值之间相关性强,ORF1ab、N、E基因的线性回归系数分别为0.8400~0.9921、0.8674~0.9668、0.8717~0.9768;配套体系同种扩增试剂磁珠提取法优于核酸释放剂免提取法;非配套体系同种试剂不同检测体系线性回归相关系数存在较大差异。用标准曲线计算临床阳性样本ORF1ab、N、E基因结果存在差异;临床阳性样本中N基因的检出浓度高于ORF1ab的检出浓度;与数字PCR结果赋值存在较大偏倚,无法通过偏倚<7.5%,通过率≥80%的标准。利用标准曲线计算13种检测体系ORF1ab、N、E基因的检出限,与各试剂宣称的检出限之间存在差异,各体系的检测结果可比性差。结论:SARS-CoV-2核酸检测试剂检测基因的线性相关性配套体系优于非配套体系,实验室应尽可能选用配套检测体系,否则应摸索最优的检测体系。临床阳性样本的结果与赋值结果存在较大偏倚,各试剂检出限宣称值与真实值之间存在较大差异,试剂间可比性差。在暂无法实现SARS-CoV-2检测的标准化的情况下,建议实验室通过标准物质绘制标准曲线确定检测体系实际检出限的方式判断试剂真实检出限,指导初复检试剂的确定。

一种新型冠状病毒核酸检测试剂在4个检测体系中的检出限分析

目的验证一种新型冠状病毒核酸检测试剂在4个不同检测体系中的检出限,以提升新型冠状病毒核酸检测质量。方法选择1个试剂配套体系和3个非配套体系,使用中国计量科学研究院新型冠状病毒全序列假病毒核糖核酸标准物质验证检出限性能,并对未通过验证的体系进行分析,以查找原因。结果该试剂在4个检测体系中检出限验证均通过,其中非配套体系1检出能力最强,其次为配套体系和非配套体系2。缩短细胞裂解、核酸释放与磁珠结合时间、减少核酸洗涤次数会影响试剂检出限。结论该试剂检出限性能可满足检测需求。相关部门应出台相应仪器的生产标准和校准标准;实验室应关注加样量、非配套体系的优化和仪器设备的维护、保养、校准。

荧光聚合酶链反应法用于新型冠状病毒核酸检测扩增产物污染治理的相关应用

目的探讨荧光聚合酶链反应(PCR)法用于新型冠状病毒(新冠病毒)核酸检测时扩增产物污染治理的相关应用。方法建立新冠病毒基因检测扩增产物污染模型、物面污染模型以及空间(气溶胶)污染模型,比较不同化学试剂及物理紫外线照射治理方式对物面污染和空间污染的清除效果。结果75%乙醇消毒剂组、核酸清除剂组和不同浓度有效氯制剂组的循环阈值(CT值)均明显高于对照组,其中核酸清除剂组的CT值最高,玻璃、塑料、金属材质的CT值分别为34.74±2.63、34.68±3.25、35.71±3.07。500、1000、1500、2000、2500 mg/L有效氯制剂组对不同材质的CT值均高于75%乙醇消毒剂组,且有效氯的浓度越高,CT值越大,差异均有统计学意义。不同时长紫外线照射各组的CT值均明显高于对照组;其中以紫外线照射120 min组的CT值最高,玻璃、塑料、金属材质的CT值分别为35.51±2.70、35.49±2.63、35.55±2.58,且紫外线照射时长越长,CT值越大,差异均有统计学意义。治理后的通风+紫外线照射120 min+75%乙醇消毒剂+核酸清除剂+2500 mg/L有效氯制剂组的CT值为36.98±3.47,明显高于治理前及其他各组,差异均有统计学意义。结论荧光PCR法用于新冠核酸检测时扩增产物污染的治理方式较多,对物面污染的治理方式可选择核酸清除剂及2500 mg/L有效氯制剂,以及紫外线照射120 min,对空间污染环境的治理方式可选择通风+紫外线照射120 min+75%乙醇消毒剂+核酸清除剂+2500 mg/L有效氯制剂联合应用,值得重视。

基于RT-RAPID和CRISPR-Cas12a的诺如病毒GⅡ.6亚型核酸检测方法的建立

为建立一种特异性强、灵敏度高且简单方便的诺如病毒GⅡ.6核酸快速检测方法,下载诺如病毒GⅡ.6基因组序列,用Mega7.0对基因组进行比对分析获得高度保守序列;基于保守序列设计诺如病毒GⅡ.6的反转录重组酶和聚合酶等温检测(RT-RAPID)技术扩增引物、荧光探针、crRNA和报告分子;优化RT-RAPID的反应引物、反应温度和反应时间及Cas12a检测用的crRNA,并分析RT-RAPID-Cas12a方法的特异性和灵敏度。基于RT-RAPID荧光法和RT-RAPID-Cas12a荧光法的诺如病毒GⅡ.6亚型核酸快速检测方法能在1 h内完成检测并得出结果,灵敏度分别为10 copies/μL和0.5 copies/μL,且两个方法均与诺如病毒GⅡ.17型、鼻病毒、偏肺病毒和博卡病毒无交叉反应。2个检测方法与RT-qPCR阳性样本一致率均为90%,阴性样本一致率均为100%。论文建立的基于RT-RAPID和Cas12a的诺如病毒GⅡ.6核酸快速检测方法均可高效快速地检测出诺如病毒GⅡ.6,具有灵敏度高、特异性强、操作便捷且快速等特点。

浅谈龙岩市某县区域新冠病毒核酸检测能力提升演练督导工作

近期国内新冠肺炎疫情防控形势严峻复杂,奥密克戎变异株存在传播速度快、传染性强、传播隐匿等特点。为提高科学精准防控水平,有效利用宝贵的核酸检测资源,目标明确、有的放矢地开展检测,提高疫情“早发现”能力,落实“外防输入,内防反弹”的防控策略,区域新冠病毒核酸检测能力的提升至关重要。

核酸污染及其引起呼吸道病毒核酸检测假阳性的鉴定与防范

呼吸道病毒引起的感染性疾病是一类严重威胁人类健康和生命的重大疾病。利用口咽拭子或鼻咽拭子进行呼吸道病原体鉴定,对于病毒性呼吸道感染疾病的临床诊疗和疾病防控均具有重要意义。基于PCR的病毒核酸检测具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点,现已普遍作为病毒病原体鉴定的常用手段。然而由于PCR超高的灵敏度,病毒核酸检测容易因试剂、耗材和环境受到病毒核酸污染而出现假阳性结果,从而影响病原体鉴定的准确性。从事呼吸道病毒研究或检测的科研、医疗工作者由于频繁使用、接触含有病毒核酸序列的表达质粒或阳性对照质粒,其口咽和鼻咽面临核酸污染的高风险,进而在取样口咽拭子或鼻咽拭子进行呼吸道病毒核酸检测时容易出现假阳性。本文以新型冠状病毒为例,分析了核酸污染引起核酸检测假阳性的可能发生情况,并探讨了核酸污染引起核酸检测假阳性的鉴定方法以及预防、消除核酸污染的处理方法,以期减少该类事件的发生,并助力病毒性呼吸道感染的精准诊疗。

人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒国家监督抽检质量分析

目的:评价国内不同使用环节的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)的质量现状。方法:依据企业产品技术要求,对准确性、特异性、检测限、精密度4个项目进行检验。同时,以国家参考品和细胞质控品为样品,进行探索性研究。结果:本次国家监督抽检共抽检15批次产品,其中13批次的准确性、特异性、检测限和精密度检测结果均符合要求,2批次结果因质量控制不符合要求判定为不合格,抽检合格率为87%。探索性研究结果显示,以国家参考品为样品进行评价,6批次试剂盒未能满足检测限要求;以9种不同型别的高、低浓度细胞质控品为样品进行评价,各试剂检测高浓度样品符合率较高,检测低浓度样品符合率较低。结论:企业需进一步规范和完善产品技术要求,改进和完善企业参考品和产品的设计,建议采用国家参考品优化检测限标准。

甲流病毒核酸检测在临床中的应用价值研究

研究甲流病毒病原学检测在临床中的应用价值,并探讨其临床意义。方法:收集医院门急诊呼吸道感染患者140例,其中明确为甲流诊断的患者80例,比较患者的一般情况,影像学差异以及实验室检验指标的不同。结果:甲流患者和普通流感患者的易感性差不多,在人群分布上没有特别的差异,影像学上的表现也较类似,在实验室检查中发现甲流患者在白细胞计数、超敏C反应蛋白、血小板计数水平均有差异。在对咽拭子进行病原学检测发现,金标法存在假阴性的情况,核酸检测的结果要优于金标法。结论:甲流病毒病原学检测在临床中有重要的应用价值,在怀疑甲流感染时,如果金标法检测为阴性时建议检测病毒核酸来确诊。

微流控芯片环介导等温扩增技术检测3种猪圆环病毒

为建立快速区分3种猪圆环病毒(PCV2、PCV3和PCV4)的现场检测方法,采用微流控芯片环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),收集3种猪圆环病毒临床阳性样本进行核酸提取,与市场上3种猪圆环病毒荧光探针法检测试剂盒进行灵敏度、特异性和重复性同步比对。结果显示:微流控芯片LAMP法在3种猪圆环病毒联检测试中具有非常高的灵敏度,可以在30 min内,实现不低于荧光定量PCR法的敏感性;与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒临床阳性样本均无交叉反应,特异性好;测试3种猪圆环病毒重复性Ct值变异系数(CV)均在2%以下,稳定性好。结果表明:3种猪圆环病毒微流控芯片快速联检技术特异性好、灵敏度高、重复性强,检测速度快,环境要求低,可以满足现场检测的要求,适用于养猪场等场所的猪圆环病毒现场快速检测。本方法的建立为猪相关病原体的现场快速核酸检测提供了有力工具。

核酸共提取试剂盒应用于柑橘危险性病害检测的效率评价

柑橘易受到不同遗传类型病原的复合感染,传统病原检测方法需单一核酸提取,使得检测步骤繁琐,影响检测效率。以普通单一核酸提取试剂盒为对照,采用核酸共提取试剂盒,通过分析核酸完整性和浓度以及病原检测效率,以期探讨核酸共提取试剂盒应用于柑橘危险性病害检测的可行性,从而简化柑橘病原检测方法的核酸提取步骤。结果表明,相比普通RNA提取试剂盒,核酸共提取试剂盒提取RNA的完整性、纯度、浓度以及柑橘衰退病毒病原检测效率均无显著差异,可达到相同检测效果。相比普通DNA提取试剂盒,核酸共提取试剂盒提取DNA的完整性、纯度均无显著性差异,但其浓度显著降低,使得柑橘黄龙病和柑橘溃疡病病原检测效率也显著降低;通过增加PCR反应的起始模板量,核酸共提取试剂盒检测柑橘黄龙病和柑橘溃疡病病原的效率与普通DNA试剂盒无显著差异,可达到相同检测效果。综上所述,核酸共提取试剂盒可应用于柑橘危险性病害检测,将有助于提高病原复合感染样品的检测效率。