新型酵母表达系统-Pichia.pastoris高效分泌型表达病毒生长因子的研究

目的：实现痘苗病毒生长因子的高效分泌型表达。方法：构建pPIC9K/VGF表达载体，扩增引物分别为P1：TATACGTAGATAGTGGTAAGG，P2：TAGAATTCTTAAGTGTTTGGTTTT；采用Pichia.pastoris酵母表达系统。结果：经酶切鉴定，证明克隆的基因是正确的；经SDS-PAGE分析，证明转化基因组中确实整合有VGF基因，其分子量为9．6kD；得到了高效分泌型VGF高产菌株，目的蛋白占培养液上清蛋白总量的80％以上，产量为0.45g/L。结论：证实可以通过Pichia.pasoris系统制备可溶性痘菌病毒生长因子。为大规模工业生产打下基础。

痘苗病毒天坛株基因组病毒生长因子基因结构的研究

克隆了位于我国痘苗病毒天坛株基因组左端的病毒生长因子（ＶＧＦ）基因并对其编码多肽的结构特点进行了分析。结果表明，由天坛株ＶＧＦ基因所推导的氨基酸序列具有典型的上皮生长因子（ＥＧＦ）超家族成员的特征序列和结构特点，在核苷酸及氨基酸水平上天坛株ＶＧＦ与其他正痘病毒ＶＧＦ的同源性在８５％～９５％之间，氨基酸残基的缺失和插入等变异主要集中出现在多肽的信号肽和穿膜区，推测对功能的影响不大。此外，我们发现由天坛株基因组右末端的开放读码框架（ＯＲＦ）ＴＢ２２Ｌ推导的氨基酸序列与天坛株ＶＧＦ多肽第６７位至１４０位完全相同，提示ＯＲＦＴＢ２２Ｌ可能是天坛株基因组第二个ＶＧＦ基因的变异产物。

人类免疫缺陷病毒储存库检测方法的现状及应用前景

获得性免疫缺陷综合征是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的高死亡率传染病。即使经过抗逆转录病毒治疗,原病毒整合在宿主基因组形成病毒储存库仍可逃避宿主免疫监视及清除。现有的HIV储存库检测方法主要包括细胞体外培养诱导病毒生长试验和基于PCR技术直接检测原病毒基因组方法。了解并精准检测HIV储存库可为治疗HIV提供可靠的技术依据。本文通过对近年来HIV储存库的各种检测方法及其优缺点进行总结分析,以期能够选择出针对不同检测对象的HIV储存库的最优检测方法,并给出恰当建议,为艾滋病的进一步深入研究提供理论指导与技术支撑。

腺病毒载体介导肝细胞生长因子基因对血管内皮细胞的作用

目的:研究腺病毒载体介导肝细胞生长因子(HGF)基因感染血管内皮细胞后在正常供氧、缺氧及缺氧后复氧的情况下细胞的凋亡情况。方法:将分离、培养的内皮细胞分为3组,分别给予M199(对照组)、HGF(HGF组)和HGF基因腺病毒载体(Ad-HGF组),分别在正常供氧、缺氧及缺氧后复氧3种情况下观察细胞的凋亡情况。结果:Ad-HGF组及HGF组细胞凋亡数均低于对照组(P<0.01),Ad-HGF组与HGF组细胞凋亡数差异无显著性意义。结论:腺病毒载体介导HGF基因感染内皮细胞后能在缺氧情况下有效地阻止细胞凋亡。

人血管生长素衍生物的重组腺病毒制备

目的 :构建并鉴定血管生长素 (ANG)衍生物重组腺病毒 ,为心肌缺血区促血管生长因子基因转染研究作准备。方法 :ANG衍生物 D116 H - ANG重组粘粒与腺病毒 DNA末端肽复合物混合后以磷酸钙共沉淀法转染 2 93人胚肾细胞株细胞。结果 :酶切结果显示 ,重组粘粒中 ,D116 H - ANG插入方向正确 ,所获重组腺病毒带有 ANG衍生物基因。结论 :所获重组腺病毒为 E1 ,E3缺陷型 。

腺病毒载体介导肝细胞生长因子基因对血管平滑肌细胞的作用

目的:研究腺病毒载体介导肝细胞生长因子(HGF)基因感染血管平滑肌细胞后在缺氧和正常供氧时的细胞凋亡和迁移情况。方法:以肝细胞中抽提的总RNA为模板,反转录cDNA,采用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)获得HGF基因,并引入酶切位点,转染大肠杆菌,筛选阳性菌落,经酶切及测序,转染腺病毒,经三轮扩増,制备高效表达HGF基因腺病毒载体(Ad-HGF),再感染人血管平滑肌细胞(VSMC)为观察组(Ad-HGF组);未感染为阴性对照组(DMEM组);以含人工合成HGF为阳性对照组(HGF组),分别在正常供氧和缺氧情况下观察细胞的凋亡和迁移情况。结果:与DMEM组及HGF组比较,Ad-HGF组在缺氧和正常供氧时VSMC的迁移率及凋亡细胞数差异均无显著性意义。结论:HGF基因感染VSMC后,在缺氧情况下并不促进VSMC的迁移,亦不抑制其凋亡。

腺病毒介导转化生长因子β1对786-0肾癌细胞迁移与侵袭的影响

目的探讨腺病毒介导的转化生长因子β-1(TGF-β1)对肾癌细胞迁移与侵袭的影响。方法将肾癌细胞系786-0细胞培养后分实验组及对照组,实验组以腺病毒为载体将TGF-β1转染,采用细胞划痕实验检测TGF-β1对其迁移的影响;采用Transwell小室实验检测TGF-β1对其侵袭的影响。结果 48 h后实验组的划痕宽度明显变窄,且明显小于对照组(P<0.05);48 h后实验组的穿透细胞数明显多于对照组(P<0.05)。结论 TGF-β1能够促进肾癌细胞的迁移与侵袭。

腺病毒载体介导肝细胞生长因子基因对冠状动脉再狭窄的预防作用

目的应用重组腺病毒载体介导的肝细胞生长因子(HGF)基因转染血管内皮细胞(VEC)及血管平滑肌细胞(VSMC),探讨HGF基因对其凋亡的诱导作用。方法以肝细胞中抽提的总RNA为模板,反转录cDNA,采用RT-PCR技术获得HGF基因,并引入酶切位点,转染大肠埃希菌,筛选阳性菌落,经酶切及测序证实后,转染腺病毒,制造病毒包涵体,经3轮扩増,制备高效表达HGF基因腺病毒载体(Ad-HGF)。以此感染VEC及VSMC,设为Ad-HGF组;再以人工合成HGF培养VEC及VSMC为阳性对照组(HGF组);以未感染Ad-HGF的细胞为阴性对照(对照组)。并采用流式细胞仪检测缺氧情况下各组细胞的凋亡率。结果VEC的Ad-HGF、HGF组细胞凋亡率均低于对照组,差异均有极显著性意义(均P<0.01),但VSMC的3组细胞凋亡率差异无显著性意义(P>0.05)。结论腺病毒载体介导HGF基因感染VEC后能在缺氧情况下有效地阻止VEC发生凋亡,但不能有效抑制VSMC凋亡,提示对冠状动脉再狭窄有预防作用。

基因治疗脊髓损伤中Ad(腺病毒)-NGF(神经生长因子)的应用研究

目的:应用Ad-NGF转染成纤维细胞治疗脊髓半切模型大鼠探讨在基因治疗脊髓损伤中腺病毒作为载体介导的NGF对脊髓损伤的治疗价值。方法:主要材料为Ad-NGF,293细胞,成纤维细胞,大鼠等。成纤维细胞与Ad-NGF悬液混合培养,将细胞注射至脊髓半横切损伤模型大鼠局部。结果:NGF因子在体外实验组可检测到。Ad-NGF转染组单位面积上神经轴突数量比对照组多。结论:NGF因子在体外实验组得到表达,体内修饰组有NGF表达。证实Ad-NGF转染成纤维细胞通过促进脊髓损伤大鼠神经轴突的生长促进损伤神经功能的恢复。

直接作用抗病毒药物的抗丙型肝炎病毒作用及对患者血清血管内皮生长因子水平的影响

目的评估直接作用抗病毒药物(DAAs)治疗慢性基因1b型HCV感染患者的疗效和安全性,并分析其对患者血清VEGF水平的影响,评估DAAs治疗诱导肿瘤复发的风险因素。方法选取2012年12月至2016年1月至本院接受治疗的58例基因1b型慢性HCV患者,根据治疗方式的不同,将所有患者分为索菲布韦(SOF)+达卡他韦(DCV)组和SOF+雷迪帕韦(LDV)组。两组患者均接受DAAs无干扰素方案,药物为患者自购,疗程均为24周,随访24周。使用荧光定量PCR法检测定量HCV RNA,比较两组DAAs无干扰素方案的抗病毒作用,并统计两组患者治疗期间不良反应发生率。分别在治疗前、治疗后4周、结束治疗当天、持续病毒学应答(SVR)4和SVR12,采集研究组患者血清,使用Randox仪器精确分析治疗前后患者血清血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平变化。结果 SOF+DCV组SVR24率为96.7%,SOF+LDV组SVR24率96.4%,且无患者出现严重不良反应。治疗开始后4周时,两组患者血清VEGF水平较治疗前明显增加(P<0.05),且一直维持至治疗结束时;治疗结束后4周时降低至治疗前水平,而后较治疗前再次升高(P<0.05)。结论两组DAAs无干扰素方案治疗基因1b型慢性HCV感染均取得良好疗效,安全性较高。DAAs给药诱导患者血清VEGF水平显著增加,可能是DAAs治疗风险因素之一。

重组腺病毒-肝细胞生长因子基因治疗延缓自发性高血压大鼠心室重构及对炎症的影响

目的该试验旨在探讨重组腺病毒-肝细胞生长因子(Ad-HGF)基因局部心肌注射对自发性高血压大鼠(SHR)左心室重构及炎症的影响。方法实验共分5组,其中自发性高血压大鼠做为心肌纤维化模型,被随机分成4组,每组6只,(1)阳性对照组(P组);(2)空白腺病毒组(A组null-Ad5,0.1 ml);(3)低剂量组(L组1×109Pfu.ml-1Ad5-HGF,0.1 ml);(4)高剂量组(H组5×109 Pfu.ml-1 Ad5-HGF,0.1 ml);另6只WKY(wista-kyoto)鼠作为正常对照组(N组);A、L,H组SHR开胸,左心室壁5点分别注射0.1 ml null-Ad5、1×109Pfu.ml-1Ad5-HGF 5×109Pfu.ml-1Ad5-HGF,基因转染后继续饲养,4周后处死。测量自发性高血压大鼠左心室质量指数,测定大鼠左室收缩压、舒张末压、压力变化最大上升和下降速率;免疫组化观察CD34(新生血管密度);ELISA法测量血浆IL-1,CRP,TNF-α;Western blot法测定HGF,NF-κB p50亚基。结果 (1)左心室重量指数:与WKY鼠对比,SHR鼠左心室质量指数明显增加,而重组腺病毒-肝细胞生长因子治疗后SHR鼠左心室质量指数明显减少。(2)血流动力学检测:与SHR模型鼠对比,重组腺病毒-肝细胞生长因子治疗组大鼠左室收缩压、压力变化最大上升和下降速率均明显升高,舒张末压明显降低。(3)心肌间质血管密度:与SHR模型鼠对比,重组腺病毒-肝细胞生长因子治疗组大鼠心肌间质血管密度明显增加。(4)炎症因子及NF-κB p50蛋白:重组腺病毒-肝细胞生长因子治疗组与SHR模型鼠相比,血清白介素-1、CRP、肿瘤坏死因子-α明显降低,心肌组织NF-κB p50蛋白表达显著降低。结论重组腺病毒-肝细胞生长因子改善了自发性高血压大鼠的心功能。抑制炎症因子表达并促进间质血管可能是重组腺病毒-肝细胞生长因子改善心室重构的重要机制之一。

鸭生长迟缓病毒抗体检测方法的建立

近年来,从鸭群中分离到一种造成鸭生长迟缓的新病毒,命名为鸭生长迟缓病毒(Duck growth retardation virus)。本研究以鸭生长迟缓病毒Anhui2株为抗原免疫小鼠,筛选获得2株能够稳定分泌抗该病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1-5和3-6G),在此基础上,利用特异性单抗1-5和鸭生长迟缓病毒Anhui2毒株抗原建立了检测该病毒抗体的阻断ELISA方法,并确定了抗原和抗体的最适条件。对316份阴性血清检测结果进行统计学分析,确定建立的阻断ELISA方法的判定标准:当阻断率PI≥26.0%时判为抗体阳性,PI≤17.9%时判定抗体阴性,17.9%<PI<26.0%时判为可疑,需重复检测1次,如果仍低于26.0%,则判为抗体阴性。该方法具有良好的特异性和敏感性,可用于鸭生长迟缓病毒病流行病学调查和疾病诊断。

肝细胞生长因子重组腺病毒对高血压高血脂大鼠学习记忆能力及海马凋亡蛋白表达的影响

目的探讨肝细胞生长因子重组腺病毒(Ad-HGF)对高血脂高血压大鼠学习记忆能力及海马CA1区bcl-2和bax蛋白表达的影响。方法 30只雄性Sprague Dawley大鼠随机分为对照组、模型组和Ad-HGF组,每组10只。模型组和Ad-HGF组大鼠在无菌条件下行双侧肾动脉狭窄术,造成实验性肾性高血压,术后1周给予高脂饲料喂养16周;对照组大鼠仅分离双侧肾动脉,术后给予普通饲料喂养16周。造模后,Ad-HGF组大鼠经小脑延髓池一次性注入Ad-HGF 10μL;对照组和模型组大鼠分别经小脑延髓池一次性注入生理盐水10μL。给药后10 d,采用Morris水迷宫实验评估各组大鼠的学习记忆能力;免疫组织化学法检测大鼠海马CA1区中bcl-2和bax蛋白表达。结果模型组大鼠逃避潜伏期长于对照组,穿越平台次数和在目标象限停留时间少于对照组(P<0.05);Ad-HGF组大鼠逃避潜伏期短于模型组,穿越平台次数和在目标象限停留时间多于模型组(P<0.05)。与对照组比较,模型组大鼠海马CA1区bcl-2和bax蛋白阳性细胞数均增多,bcl-2/bax比值降低(P<0.05);与模型组比较,Ad-HGF组大鼠海马CA1区bcl-2蛋白阳性细胞数升高,bax蛋白阳性细胞数降低,bcl-2/bax比值升高(P<0.05)。结论外源性Ad-HGF能显著改善高血压高血脂大鼠的学习记忆能力,发挥对大脑的神经保护作用,其机制可能与抑制海马区神经细胞凋亡相关。

人肝细胞生长因子基因腺病毒重组体的构建及转染血管平滑肌细胞的表达

为探讨构建能表达肝细胞生长因子基因的腺病毒重组体的方法,以及这种腺病毒重组体能否在血管平滑肌细胞表达。将含有肝细胞生长因子基因片段的质粒用限制内切酶酶切,以琼脂糖凝胶电泳回收得到目的基因片段;将它用DNA连接酶插入至腺病毒穿梭质粒中,并用限制内切酶鉴别插入方向,得到插入方向正确的重组腺病毒穿梭质粒。用限制内切酶酶切重组腺病毒穿梭质粒和表达载体,使它们线性化;以电转化方法使它们共转化至BJ5183细胞中进行同源重组,构成肝细胞生长因子基因腺病毒重组体。以脂质体为转染介质,将肝细胞生长因子基因腺病毒重组体转染到人胚肾细胞中进行包装,使病毒复性具有感染能力。用包装后的肝细胞生长因子基因腺病毒重组体感染体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞;经逆转录-聚合酶链反应和蛋白印迹检测发现肝细胞生长因子呈现过表达。此外,酶切及测序发现重组腺病毒穿梭质粒和肝细胞生长因子基因腺病毒重组体是正确的;绿色荧光蛋白标记对重组体在人胚肾细胞中的包装及包装后感染大鼠主动脉平滑肌细胞进行了荧光示踪。结果提示。肝细胞生长因子基因腺病毒重组体构建成功,为血管疾病转基因治疗奠定了基础,具有一定临床价值。

靶向性抗肿瘤融合蛋白-表皮生长因子-腺病毒早期转录区4第4编码蛋白在细胞内的转运及对胞外信号调节激酶磷酸化的影响

目的探讨经表皮生长因子受体介导进入肿瘤细胞的融合蛋白表皮生长因子-腺病毒早期转录区4第4编码蛋白(EGF-E4orf4)在细胞内的转运及对胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化的影响。方法采用间接免疫荧光结合激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在MDA-MB-231和BGC823细胞中的转运和代谢特点,Western blot检测融合蛋白引起的细胞内ERK磷酸化水平的改变。结果融合蛋白可在细胞内累积,向细胞核周围聚集,并与细胞早期内体和晚期溶酶体共定位;融合蛋白能快速触发细胞内ERK发生磷酸化,磷酸化水平在10 min时最强,之后逐渐回落至刺激前水平,活化ERK的能力较表皮生长因子弱。结论融合蛋白EGF-E4orf4在细胞内经内体-溶酶体途径发生缓慢降解;在MDA-MB-231和BGC823细胞中,融合蛋白的作用特点存在明显差异,可能是导致融合蛋白对二者抑瘤率不同的原因之一。

人肝细胞生长因子重组腺病毒枕大池注入对动脉粥样硬化大鼠脑组织IL-6、TNF-α表达的影响

目的观察人肝细胞生长因子重组腺病毒(Ad-HGF)枕大池注入对动脉粥样硬化大鼠脑组织IL-6、TNF-α表达的影响。方法 60只15月龄SD雄性大鼠,随机抽取50只采用肾动脉狭窄术及高脂饲料喂养法制作动脉粥样硬化模型,造模成功大鼠20只;将造模成功大鼠随机分为动脉粥样硬化组、Ad-HGF组,各10只;另10只大鼠为对照组。对照组、动脉粥样硬化组大鼠通过枕大池注入生理盐水(10μL),Ad-HGF组大鼠通过枕大池注入Ad-HGF(10μL,滴度5×109pfu/100μL);之后第10天处死大鼠,用免疫组织化学法检测大鼠脑组织中的IL-6及TNF-α,用image-proplus软件对IL-6及TNF-α在大鼠脑组织中的表达进行半定量分析,同时采用酶联免疫吸附法检测大鼠脑组织中的IL-6及TNF-α。结果免疫组织化学法检测显示,对照组、动脉粥样硬化组、Ad-HGF组大鼠脑组织中的IL-6相对表达量分别为0.216 0±0.068 1、0.331 0±0.043 3、0.174 9±0.010 7,TNF-α相对表达量分别为0.078 6±0.011 2、0.255 1±0.045 8、0.054 4±0.016 6;与对照组相比,动脉粥样硬化组IL-6、TNF-α的表达增加(P均<0.05);与动脉粥样硬化组相比,Ad-HGF组IL-6、TNF-α的表达减少(P均<0.05)。酶联免疫吸附法检测显示,对照组、动脉粥样硬化组、Ad-HGF组大鼠脑组织中的IL-6表达量分别为(50.415±6.690)、(108.302±5.695)、(66.062±9.550)pg/m L,TNF-α表达量分别为(83.836±9.442)、(209.425±15.520)、(85.996±8.445)pg/m L;与对照组相比,动脉粥样硬化组IL-6、TNF-α的表达增加(P均<0.05);与动脉粥样硬化组相比,Ad-HGF组IL-6、TNF-α的表达减少(P均<0.05)。结论动脉粥样硬化大鼠脑组织IL-6、TNF-α的表达增加,Ad-HGF可以减少动脉粥样硬化大鼠脑组织IL-6、TNF-α的表达,即抑制动脉粥样硬化大鼠脑组织炎性反应。

VEGF165基因重组腺相关病毒构建及转染猪骨髓间充质干细胞的研究

目的构建携带人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)的重组腺相关病毒载体,在体外转染猪骨髓间充质干细胞并观察其表达。方法细胞AAV包装质粒pAAV-IRES-ZsGreen及含hVEGF的质粒经EcoRⅠ+BamHⅠ双酶切、连接,构建pAAV-hVEGF165-IRES-ZsGreen载体,采用磷酸钙法转染293AAV细胞系,获得rAAV2-hVEGF165及对照重组腺相关病毒,rea1-time PCR法测定病毒效价。Western blot检测重组rAAV2-hVEGF165在猪骨髓间充质干细胞的表达,MTS法检测VEGF蛋白活性。结果成功构建rAAV2-hVEGF165重组腺相关病毒载体,rAAV2-hVEGF165经双酶切和测序鉴定正确,rea1-time PCR法测定病毒效价为5×1012vg/ml。转染rAAV2-hVEGF165的猪骨髓干细胞能够有效表达VEGF蛋白,并能促进血管内皮细胞的增殖。结论成功构建rAAV2-hVEGF165重组腺相关病毒载体,并能在猪骨髓间充质干细胞中有效转染和表达,为进一步探索rAAV2-hVEGF165对治疗缺血性心肌疾病的研究提供实验基础。

肝细胞生长因子对自发性高血压大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的探讨局部心肌注射重组腺病毒-肝细胞生长因子(Ad-HGF)对自发性高血压大鼠(SHR)心肌细胞凋亡的影响。方法 30只SHR为心肌纤维化模型,随机抽取6只作为阳性对照组,其余24只再随机平分为腺病毒组、Ad-HGF组。腺病毒组、Ad-HGF组SHR开胸,左心室壁5点分别注射0.1 ml null-Ad5和5×109Pfu/ml Ad5-HGF,术后两组分别存活8只和10只,于4周时处死其中6只。处死前测量左心室内压,ELISA法测定心肌HGF浓度,放射免疫法检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)浓度,免疫组化法及图像分析系统分析心肌Bcl-2和Bax水平,心肌细胞凋亡指数检测采用TUNEL,Western blot法测定HGF、AT1R、Bcl-2和Bax的蛋白表达。结果与阳性对照组相比,Ad-HGF组左室内压表现为左心室舒张末压(LVEDP)下降(P<0.05)、左心室压力最大下降速度(-dp/dtmax)下降(P<0.05),左心室压力最大上升速度(+dp/dtmax)上升(P<0.05)。心肌HGF、抗细胞凋亡蛋白Bcl-2显著升高(P<0.05);AngⅡ、AT1R与促细胞凋亡基因Bax水平,心肌细胞凋亡指数明显降低(P<0.05)。结论 Ad-HGF可以降低SHR左心室心肌细胞凋亡指数,其作用机制可能与HGF抑制AngⅡ、AT1R、Bax,上调Bcl-2,提高Bcl-2/Bax比例,同时降低心室壁压力有关。

A/PR8/34(H1N1)NA基因包装信号对H5N1流感疫苗株NIBRG-14产量的影响

NIBRG-14是采用"6+2"策略制备的一株H5N1灭活疫苗株,其表面抗原HA和NA基因来自于A/Vietnam/1194/2004(H5N1,VN1194),内部基因来自于A/Puerto Rico/8/34(H1N1,PR8),已有研究表明该疫苗株在鸡胚中的产量不佳.本研究发现,在PR8背景下,VN1194NA基因被包装入重组病毒中的效率仅为正常包装量的38%～68%,因此有一部分重组病毒为不含有NAvRNA的缺陷型病毒粒子.本研究通过在VN1194NA基因完整编码区(CDS)的5′和3′两端嵌合PR8NA基因包装信号序列(vRNA3′末端41bp,5′末端67bp)的方法,使重组病毒中NAvRNA的包装效率得到完全恢复,并且病毒在鸡胚的生长滴度提高了10倍,血凝素HA含量提高了约2·7倍,从而为H5N1流感疫苗株的研制提供了新的思考方向.

工业微生物学网络教学实践与体会

工业微生物学是生物工程专业本科和研究生教学的主干课程。我们制作的基于计算机网络的《工业微生物学》多媒体网络教学课件,是对该课程的重要补充和拓宽,对课程的教学起到了较好的辅助和促进作用。