小鹅瘟病毒纯化及其理化特性的研究

详细描述了小鹅瘟病毒(Goslin—plague virus,GPV)扬州株的浓缩和纯化过程,并论述了其理化特性。试验证明,GPV在氯化铯中主要病毒区带的浮密度为11.31～1.35g/ml,电镜下可见空壳和实心两种病毒粒子,大小20～22nm,沉降系数90.5S。用Sepharose 4B柱层析纯化的病毒,等电点为4.3。GPV有3种结构多肽,即Vp1、Vp2和Vp3,分子量分别为85 000,61 000,57 500道尔顿,其中Vp3为主要结构多肽,纯化的病毒粒子能使鹅胚致死。

猪传染性胃肠炎病毒纯化方法的选择与优化

利用超速离心、饱和硫酸铵、聚乙二醇-6000(PEG-6000)对猪传染性胃肠炎细胞毒进行纯化,收集纯化病毒测定蛋白含量,分别运用PCR方法和作为ELISA包被抗原方法对纯化的效果进行检测,并对最佳纯化方法进行优化。3种纯化方法获得的蛋白浓度分别为1.875、6.435、0.763 mg/mL。PCR检测结果显示PEG-6000纯化后在上清液中未检出病毒,其余2种上清中均检出病毒。3种纯化方法制备的包被抗原ELISA试验阴阳性比值(P/N)分别为2.21、1.27、2.25,最终选择PEG-6000作为纯化病毒的方法,其最佳优化参数为PEG-6000浓度8%、浓缩时间2 h、NaCl浓度1%。研究表明利用PEG-6000纯化TGEV是一种经济实用、操作简单、并有较高纯化效率的方法,纯化后的TGEV为后续建立特异、敏感、快速的ELISA检测方法奠定了良好基础。

一株大黄鱼虹彩病毒的分离鉴定及多克隆抗体的制备

2021年7月,浙江省象山某养殖场养殖的大黄鱼(Larimichthys crocea)出现类似大黄鱼虹彩病毒引起的疾病。采用鲤上皮瘤细胞培养和病毒主要衣壳蛋白测序分析的方法,从患病的大黄鱼中分离到一株病毒。该病毒接种到鲤上皮瘤细胞(EPC)后出现空斑、脱落的细胞病变症状。根据虹彩病毒MCP和ATPase基因保守序列设计特异性引物对病毒组织样本进行PCR扩增,得到分别为1 367 bp和740 bp的目的基因片段。将MCP基因扩增片段测序,经BLAST对比及系统发育树聚类分析,确定该分离的病毒属虹彩病毒科细胞肿大病毒属。通过蔗糖密度梯度离心纯化,用透射电镜观察该病毒粒子呈正六边形,直径为120~150 nm。用纯化病毒作为抗原免疫小鼠获得抗大黄鱼虹彩病毒的多克隆抗体,效价为1∶7 000;通过SDS-PAGE和Western blotting初步确定3个免疫蛋白。本研究为大黄鱼虹彩病毒纯化提供一种新方法,并初步分离出免疫蛋白,为该病毒相关分子生物学研究、蛋白研究以及疫苗制备等提供理论依据。

新分离呼肠病毒的空斑试验及病毒纯化

目的:建立新分离呼肠病毒(reovirus)的空斑技术,进行病毒纯化,为呼肠病毒生物学和分子生物学的研究奠定基础.方法: 4株新分离呼肠病毒的早代毒种经L929细胞连续传代,当产生细胞病变后进行空斑试验,加营养琼脂培养6 d后加中性红,24 h内挑取空斑,扩增一次后做PCR鉴定.取呼肠病毒PCR阳性病毒进行第2次克隆纯化.结果:4株新分离呼肠病毒经L929细胞连续传2～4代,均能观察到明显的细胞病变.用10-3和10-4接种L929单层细胞,第6～7天均能产生空斑,空斑呈圆形,直径为0.2～1.0 mm,并分别测定其空斑滴度(PFU/ml).两次纯化后进行PCR检测,呼肠病毒基因扩增阳性、脊髓灰质炎病毒基因扩增阴性.结论:4株呼肠病毒的空斑出斑规律,通过两次克隆,获得纯化的病毒.

琼脂糖蛋白质A反向免疫共沉淀法纯化蓝舌病毒HbC_3

用高效液相色谱(HPLC)、透射电镜检测琼脂糖蛋白质A反向免疫共沉淀法纯化蓝舌病毒湖北株(BTV HbC3)的效果,组织培养半数感染量(TCID50)比较其纯化前后的生物学活性.结果显示,纯化过程对病毒生物学活性无明显影响,透射电镜下,纯化病毒背景清晰, HPLC解析出纯化物仅单一病毒峰.本纯化体系用于提纯BTV HbC3 效果显著,操作简便,具备高通量高活性纯化病毒的潜能,为建立大量纯制高活性蓝舌病毒用于实验室靶向性抗癌研究和生产实践奠定技术平台.

柯萨奇病毒A16型快速纯化和中和性单克隆抗体制备与鉴定

目的建立柯萨奇病毒A16型快速纯化方法,制备中和性单抗,并对单抗进行分析。方法收获CA16培养上清液,超滤浓缩,氯化铯密度梯度离心纯化病毒颗粒,透射电镜鉴定纯化产物。福尔马林灭活CA16,免疫BALB/c小鼠,制备分泌抗CA16特异性单抗的杂交瘤细胞系,用ELISA和中和试验分别对单抗特性进行分析。结果初步建立CA16病毒氯化铯密度梯度纯化方法,电镜显示,病毒颗粒为二十面体立体对称球形结构,病毒直径在20-30nm间,大小均匀。获得2株分泌抗CA16单抗的杂交瘤细胞系,2株单抗均为IgG2a亚型,Anti/CA16/5效价为10^3,Anti/CA16/10效价为104。2株抗体的中和效价分别为1∶256和1∶1 024。结论初步建立氯化铯密度梯度纯化CA16的方法,筛选出2株具有中和活性的抗CA16单抗,为CA16病毒的基础研究提供重要的原材料。

蚀斑法分离纯化BHV-1和BPIV-3混合病毒

利用蚀斑试验方法对牛疱疹病毒1型(BHV-1)和牛副流感病毒3型(BPIV-3)的混合病毒进行分离纯化及鉴定,为BHV-1、BPIV-3感染的诊断提供科学依据。将不同稀释度的BHV-1和BPIV-3混合病毒接种至牛肾原代细胞,加营养琼脂培养,产生蚀斑后扩增并RT-PCR鉴定。将纯化后毒液分别进行二次蚀斑纯化及鉴定。结果 BHV-1和BPIV-3混合病毒第6~7 d可产生明显蚀斑。鉴定阳性的BHV-1和BPIV-3进行二次蚀斑,鉴定结果均为阳性,且分离的两种病毒TCID_(50)测定结果为10^(-8.5)/0.1 m L、10^(-6.5)/0.1 m L。首次通过蚀斑试验,成功分离并得到了两株毒力较高且纯化的BHV-1和BPIV-3病毒株。

Sephadex G-200柱层析与蔗糖梯度速率区带离心对Sindbis病毒纯化的比较

在病毒的浓缩提纯中,广泛采用各种物理和化学相结合的方法。把“分子筛”柱层析作为一重要步骤,国内外均有报告。由于方法简便,适于大量制备,我们在早先工作的基础上,对PEG6000沉淀结合SephadexG-200柱层析浓缩提纯病毒进行了研究。

肠道病毒71型的快速纯化及其鉴定

目的建立一种简单、快速有效的从细胞培养物中纯化肠道病毒71(EV71)的方法。方法 EV71病毒在恒河猴肾细胞(LLC-MK2)中增殖后,将获得的细胞培养物经反复冻融、聚乙二醇6000沉淀、超速离心、氯化铯垫层超速离心的方法纯化病毒。用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(Western blot)和透射电镜(TEM)的方法对纯化病毒进行鉴定,并测定其感染性的滴度及回收率。结果 SDS-PAGE显示出3个条带,相对分子质量分别为3.6×103、3×103和2.6×103与EV71的VP1、VP2和VP3相符合。Westernblot证实为EV71特异性条带。经磷钨酸负染后电镜观察,能看到典型病毒颗粒。采用终浓度为10%的聚乙二醇6000沉淀后的病毒的感染性回收率为82.0%,再经氯化铯垫层超速离心后浓缩病毒的感染性回性率为29.0%。结论聚乙二醇6000沉淀结合氯化铯垫层超速离心的方法比氯化铯密度梯度区带离心方法更简便,易于操作,并且比单独聚乙二醇6000沉淀有更高的纯度,是一种简便、有效的病毒纯化方法。

猫杯状病毒蚀斑纯化方法的建立

猫杯状病毒(FCV)是引起猫科动物呼吸道疾病的重要病原之一,常用患病猫的口鼻眼拭子进行病原学诊断或病毒分离,病原微生物的混合感染给病毒的分离纯化带来困难。为了快速获得纯化的FCV,本试验将临床检测FCV和猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)混合病料处理后进行蚀斑纯化及条件优化。结果显示:将细胞数约为7×10^(5)个/mL的F81细胞以每孔2 mL铺入6孔板中,待病毒吸附90 min后覆盖浓度为2%的第1层低熔点琼脂糖溶液,于37℃、5%CO_(2)培养箱倒置培养48 h,然后加入含0.01%中性红的第2层低熔点琼脂糖溶液,于37℃、5%CO_(2)培养箱培养,此条件所形成蚀斑的数量及大小均适合挑取。通过3次克隆纯化,挑取蚀斑进行了RT-PCR检测,成功从FCV和FHV-1的混合病毒中分离纯化到1株FCV。本试验首次建立的FCV蚀斑克隆方法,有助于FCV以及其他病毒的分离纯化,并为病毒的生物学特性试验提供科学依据。

纯化病毒复制中华绒螯蟹“颤抖病”的组织病理观察

采用石蜡切片及超薄切片技术，对人工感染纯化病毒后具典型颤抖症状的中华绒螯蟹进行病理学观察。结果显示：人工感染“颤抖病”病毒发病与自然发病的病理变化相似，病蟹的肝胰脏、鳃、心脏及腹神经节等组织器官发生了病变，其病理特征主要表现为细胞浊肿、变性、坏死，某些细胞的细胞核固缩、碎裂或崩解；超薄切片电镜下可见细胞内存在病毒样颗粒，线粒体内嵴受损严重。病变严重的区域，组织细胞坏死，结构崩解。提示肝胰脏、鳃、心脏及神经组织是病毒感染主要靶器官。

Monoliths整体色谱柱在病毒纯化及疫苗生产中的应用

Monoliths整体色谱柱是一种利用原位聚合形成完整连续固定相的新技术，被誉为是第四代层析填料^[1-2]。与传统的颗粒填充介质相比，不需要填装，制备简单，载量高，物质传输速度快。近年来，由于能够大量并快速地进行生物大分子的分离，Mono-liths整体色谱柱在病毒纯化及疫苗生产中得到了广泛应用^[3]。本文就Monoliths整体色谱柱的类型、特点及其在病毒纯化和疫苗生产中的应用作一简要介绍。

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒纯化液纯度对照品的建立

目的建立Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒纯化液纯度对照品。方法将Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒纯化液经超滤离心后制备的对照品,在4和-20℃条件下保存,并于保存0、3、6、9、12个月时,采用高效液相色谱法检测纯度。结果Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒纯化液对照品在4和-20℃条件下保存12个月内,目标峰均能被检出,峰型基本保持一致,峰面积百分比均为100%,保留时间RSD为0.69%;4℃时,峰高和峰面积分别降低11.4%和8.8%;-20℃时,峰高和峰面积分别降低44.3%和35.8%。结论由Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒纯化液超滤浓缩后制备的对照品,在4和-20℃条件下放置12个月均保持稳定,可作为Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗病毒纯化液纯度检测对照品使用。

养殖鲫鲤疱疹病毒2型的鉴定及病毒囊膜蛋白ORF131多抗的制备

为了解鲤疱疹病毒2型(cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)在南京地区养殖场鲫鱼中的发病情况,对南京某渔场疑似CyHV-2感染鱼,采集鳃、肾脏等组织进行解旋酶基因(hel)PCR扩增测序及遗传变异分析;通过蔗糖密度梯度离心从发病鲫鱼组织中提纯病毒粒子,电镜观察其形态;对CyHV-2的10种囊膜蛋白编码基因进行测序,并基于生物信息学分析选择理想的囊膜蛋白进行原核表达,免疫小鼠制备抗血清。结果显示:患鱼组织hel基因检测阳性,其序列与参考株ST-J1毒株hel基因序列(GenBank登录号:JQ85364)高度同源(99.67%),并位于同一进化分支;利用蔗糖密度梯度离心结合Western blot检测发现,病毒粒子存在于40%~46%蔗糖层,电镜观察显示直径在160 nm左右;10种囊膜蛋白中开放阅读框131(ORF131)囊膜蛋白具有一段连续B细胞表位且抗原性良好,将ORF131原核表达、免疫小鼠后制备的抗血清ELISA效价达1∶4000。本研究为南京地区CyHV-2感染的检测和防控提供了依据。

教学用纯化水疱性口炎病毒抗原制备兔多克隆抗体结果分析

目的用纯化水疱性口炎病毒抗原制备兔抗VSV多克隆抗体,经免疫学方法检测并分析其结果。方法纯化VSV抗原免疫家兔后收集免疫血清,采用双向琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)和中和试验测定效价。结果兔抗VSV多克隆抗体双向琼脂扩散试验最高效价为1∶32,ELISA法最高效价为1∶320,中和试验最高效价为1∶256。结论纯化VSV抗原制备的兔抗VSV多克隆抗体特异性好、敏感性高,可为课堂教学、VSV科研及流行病学调查提供可靠依据和技术保障。

PBL结合虚拟仿真实验教学助推研究型人才培养——以水生动物病毒分离纯化虚拟仿真实验的建设和应用为例

为了解决本科实验室缺乏超速离心机和透射电镜等大型设备的问题,开发了水生动物病毒的分离纯化及形态观察虚拟仿真实验,应用于水产微生物实验教学,是实体实验教学的有益补充,拓展水产微生物学实验教学内容的广度和深度。教学方法上以学生为中心,问题为抓手,教师为引导,采用PBL法辅助虚拟仿真实验的教学模式,不仅让学生掌握了研究病毒的重要方法,还激发了学生学习兴趣,培养了学生主动学习、积极思考并独立分析解决问题和创新的能力,提升了学生的综合科研素养,有助于水产专业研究型人才培养。

利用植物组织培养纯化病毒

植物病毒的实验室研究需要大量纯化的病毒材料源.Agriculture Canada的P.L.Monette和D.James似乎已发现了这一来源.他们从接种了植物病原体葡萄病毒A.的烟草Nicotiana benthamiana小植株建立了离体节培养物.与无病毒培养物相比,有病毒存在时对组织培养生长率无明显影响.当增殖组织培养物达20g时,比较了此培养物病毒含量与感染病毒的温室保存植物叶片所含病毒量.结果表明,从组织培养物获得的病毒量几乎比温室保存植株所含量高4倍.

NCI征求生产纯化病毒蛋白的承包人

美国癌研所(NCI)正在寻求用昆虫细胞生产病毒蛋白的承包人.一种是人免疫缺陷病毒纯化蛋白,采用3种不同的病毒株,要求产量为225～450mg;另一种是调节蛋白,要求3～15mg;再有一种是猴免疫缺陷病毒(SIV)纯化糖蛋白,需要75～150mg.合同要求承包人具备充分的,避免生物污染的设备.此合同希望被小型企业承包。

中国对虾(Penaeus chinensis)的白点综合征病毒(WSSV)的提纯和核酸提取

作者从发生白点综合征的中国对虾中，提取了一株白点综合征病毒，用电镜对纯化的病毒进行了形态学观察，并对病毒纯化过程中蛋白酶抑制剂的使用及离心速度的选择进行了探讨。经蔗糖密度梯度离心，分取各带负染后电镜观察，病毒条带位于４０％～５０％蔗糖梯度之间，其完整毒粒长２２５～２７０ｎｍ，直径７５～８８ｎｍ，有的完整毒粒带有很长的尾，病毒衣壳长２５０～３２０ｎｍ，直径６０～８０ｎｍ。在匀浆使用的缓冲液中加入蛋白酶抑制剂ＰＭＳＦ，可得到完整的带包膜的病毒颗粒，比不使用ＰＭＳＦ的提纯效果要好。经３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，５０００ｒ／ｍｉｎ离心２５ｍｉｎ，去除大部分的组织碎片，经１００００ｒ／ｍｉｎ离心１ｈ，可使大部分病毒沉淀。并采用传统的方法对病毒核酸进行了提取，其基因组经初步分析为ｄｓＤＮＡ。