丙型肝炎病毒非结构蛋白5B结合蛋白的酵母双杂交筛选研究

目前认为丙型肝炎病毒 (HCV)的非结构蛋白 5B(NS5B)是病毒复制酶 ,但是对其生物学特性还不十分清楚 ,我们应用酵母双杂交系统 3,构建NS5B诱饵质粒 ,转化酵母AH10 9,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合 ,于涂有X α gal营养缺陷型培养基(SD/ Trp Leu His Ade)上筛选生长。挑选蓝色克隆 ,筛选出 33个与NS5B特异性相互作用的克隆 ,其中有 31个已知功能基因及 2个未知功能基因。所克隆到的基因对以后研究NS5B的功能有一定的提示作用 ,并为研究这些能与NS5B相互作用的基因在肝细胞中的生理功能奠定了基础。

日本脑炎病毒非结构蛋白NS5对IFN-α介导的信号转导通路的抑制作用

目的探讨日本脑炎病毒抑制IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路过程中发挥关键作用的病毒特异蛋白,为阐明日本脑炎病毒抑制Ⅰ型IFN介导的JAK-STAT信号转导通路的作用机制奠定基础。方法分别构建日本脑炎病毒编码的7种非结构蛋白基因(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)的重组真核表达载体。采用间接免疫荧光法和Western blotting观察它们在细胞内的表达及定位情况。利用含萤火虫荧光素酶(Luc)报告基因的重组载体pISRE-Luc,观察表达病毒不同非结构蛋白的细胞内IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路的活化程度。构建融合表达红色荧光蛋白的STAT1重组真核表达载体pRed-STAT1,利用该重组载体在表达病毒非结构蛋白的细胞内观察融合蛋白Red-STAT1在IFN-α作用下的细胞内定位情况。同时,对表达病毒非结构蛋白的细胞内IFN-α介导的STAT1分子的磷酸化水平进行检测。结果日本脑炎病毒的7种非结构蛋白均可在哺乳动物细胞内正确表达,而且表达蛋白均位于细胞质中。在这7种非结构蛋白中,NS5可阻断STAT1分子的核转运及抑制STAT1分子的磷酸化水平,从而抑制IFN-α介导的细胞内JAK-STAT信号转导通路的活化。结论日本脑炎病毒的非结构蛋白NS5对Ⅰ型IFN系统的信号转导通路具有显著的抑制作用,可能是一种Ⅰ型IFN系统的拮抗蛋白。

应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A结合蛋白

目的 筛选丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS4A结合蛋白 ,为HCV致病机制的研究探索新的途径。方法 应用噬菌体展示技术 ,以HCV非结构蛋白NS4A作为固相筛选分子 ,对T7噬菌体人肝细胞cDNA文库进行 5轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选过程 ,经噬斑的PCR扩增后 ,构建克隆载体 ,最后对所筛选克隆进行DNA序列测定和同源性分析。结果 噬菌体经富集后 ,从随机挑选的 12个克隆中得到 2个阳性克隆 ,成功构建了克隆载体。序列测定后经过序列同源性分析 ,确定了与HCV非结构蛋白NS4A结合的是肝细胞蛋白 丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)激活蛋白激酶 5 (MAPKAPK5 )。结论 用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了HCV非结构蛋白NS4A的结合蛋白 ,为进一步研究HCV的致病机制奠定了良好的基础。

丙型肝炎病毒非结构蛋白4A反式激活基因NS4ATP1的克隆化研究

目的:筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4A(NS4A)反式激活新型靶基因。方法:以HCVNS4A蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。分析筛选得到的克隆,其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,通过序列同源性比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染pcDNA3.1(-)-NS4A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果:该新基因的编码序列全长为963个核苷酸(nt),编码产物由321个氨基酸残基(aa)组成,并测序证实,命名为NS4ATP1,在GenBank中注册,注册号为AY 740521。结论:分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HCV非结构蛋白反式激活作用的新型靶基因NS4ATP1,为进一步研究HCV非结构蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3对环加氧酶2表达的影响

目的探讨丙型肝炎病毒基因组产物对环加氧酶2(COX-2)表达的影响。方法将带有COX-2基因启动子的报告质粒分别与10种表达丙型肝炎病毒基因组的单个基因的质粒共转染Huh7细胞,并测定荧光色素酶的活性,采用反转录PCR和Western blot检测COX-2的mRNA和蛋白表达的变化,酶联免疫吸附试验检测前列腺素E2含量的改变,探讨这些丙型肝炎基因组产物与COX-2基因启动子之间的相互作用。结果在所有10个基因组产物中,非结构蛋白NS3能够显著地激活COX-2基因启动子的活性,并在mRNA和蛋白水平上调COX-2的表达。而且这种激活作用呈剂量依赖性,前列腺素E2的分泌量随着NS3蛋白表达量的增加而增加。结论 NS3蛋白能功能性地激活COX-2的表达。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因4剪切体Ns5atp4a基因原核表达载体的构建和表达

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因4剪切体(NS5ATP4A)的原核表达载体并进行表达。方法用PCR扩增NS5ATP4A基因,克隆入pET32a(+)质粒,构建pET32a(+)-NS5ATP4A表达重组体,转化DH5α和BL21菌,经IPTG诱导。SDS-PAGE分析,Western Blot验证蛋白带。结果成功构建大肠杆菌原核表达载体。经IPTG诱导,得到了目的蛋白分子量为35kD,用Western Blot证实其具有良好的抗原性。结论构建原核表达载体pET32a(+)-NS5ATP4A,为抗原的制备及临床检测奠定了基础。

鼠肝炎冠状病毒非结构蛋白1内保守序列LLRKxGxKG的功能研究

目的研究鼠肝炎冠状病毒(MHV)非结构蛋白1(NSP1)内的保守氨基酸序列LLRKxGxKG的功能。方法扩增并构建MHVNSP1正常基因及LLRKxGxKG序列缺失突变的NSP1基因,分别将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,获得真核表达质粒。用所构建的真核表达质粒转染L929细胞,经新城疫病毒(NDV)刺激诱导后,采用ELISA法检测IFN-β的表达水平,观察NSP1正常或突变蛋白对IFN-β表达的影响。通过与含CAT和Luc报告基因的重组质粒进行共转染,观察NSP1正常或突变蛋白对IFN-β启动子活性和干扰素刺激应答元件(ISRE)活性的影响。通过与三种报告基因(pRLuc-CMV、pGL3-basic、pGL3-control)共转染,观察NSP1正常或突变蛋白对共转染基因表达的影响。结果MHVNSP1对真核细胞产生干扰素有一定的影响,并可显著抑制IFN-β启动子或ISRE应答元件的活性,且该抑制作用不受LLRKxGxKG序列缺失的影响。同时,MHVNSP1还可强烈抑制多种共转染报告基因的表达。该抑制作用在LLRKxGxKG序列缺失后显著降低。结论MHVNSP1对Ⅰ型干扰素信号通路有特异的抑制作用。LLRKxGxKG序列是MHVNSP1的一个重要功能域,在抑制共转染基因表达过程中发挥着重要作用。

构建柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C与质粒PQE-4．0的重组质粒

背景:研究表明柯萨奇B4病毒感染与1型糖尿病发病有关,但目前尚未明确其关系的确切机制。目的:构建柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C与质粒PQE-4.0的重组质粒,转入大肠杆菌中表达,并对表达产物进行功能鉴定。设计、时间及地点:随机对照实验,于2007-03/08在吉林大学免疫学教研室完成。材料:CVB4、HeLa细胞病毒均为吉林大学病原生物教研室保存;菌株E.coli DH5α与M15为东北师范大学遗传所保存;质粒PUCm-T载体、PQE4.0载体由东北师范大学曾宪录教授惠赠。方法:提取柯萨奇B4病毒总RNA,经反转录-聚合酶链反应扩增非结构蛋白P2C基因,与PUCm-T载体连接,将PUCm-T-P2C质粒进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切,回收目的片断并定向克隆到PQE4.0表达载体中酶切鉴定。将PQE4.0-P2C阳性重组质粒转化大肠杆菌M15,在IPTG诱导下表达。主要观察指标:①以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C的表达。②采用淋巴细胞转化实验和酶联免疫吸附实验检测大肠杆菌M15细胞重组蛋白粗提物。结果:①反转录-聚合酶链反应扩增得到的987bp的cDNA片段,克隆入PUCm-T载体,酶切释放出长度约2773bp和987bp的两条片段,其中一条与非结构蛋白P2C的聚合酶链反应扩增产物片段大小基本一致,序列分析与Genbank报道的序列一致。目的片段克隆入PQE4.0载体,酶切释放出长度约3400bp和987bp的两条片段,其中一条与非结构蛋白P2C的聚合酶链反应扩增产物片段大小基本一致,获得PQE4.0-P2C重组表达质粒。②十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示未诱导组无明显蛋白带,而诱导组在31000位置均出现较明显的蛋白带,且随着诱导时间延长蛋白表达量也随之增加。③淋巴细胞转化实验与酶联接免疫吸附试验测定结果表明,表达产物具有良好的抗原性与特异性。结论:柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C在大肠杆菌中高效表达,且表达产物具有一定的免疫活性。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5B反式激活基因的克隆化研究

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5B(HCV NS5B)转染细胞差异表达cDNA消减文库,克隆HCV NS5B蛋白反式激活相关基因.方法:以HCV NS5B表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5B转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,进行抑制性消减杂交(SSH)分析.随机挑取克隆进行测序及同源性分析.结果:文库扩增后得到35个阳性克隆,经菌落PCR分析显示其中26个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段.测序及同源性分析,显示16种已知基因编码蛋白和1种未知功能基因序列,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因,可能是NS5B反式激活靶基因.结论:成功构建了HCV NS5B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为进一步阐明HCV NS5B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据.

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的研究进展

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的非甲-非乙型肝炎,是慢性肝病的主要原因之一。HCV编码至少10种成熟蛋白,而非结构蛋白5A(NS5A)是其重要蛋白之一。磷酸化的NS5A与病毒的复制密切相关,参与病毒的产生和释放,并且能够通过病毒和宿主细胞的相互作用,干扰细胞内重要信号通路,影响细胞周期和免疫系统,最终促使HCV相关慢性肝病的发生与发展。本文就NS5A的生物学功能及其作用机制的研究进展作一综述。

细小病毒H-1非结构蛋白NS1基因对人胃癌细胞的抑制作用研究

背景:前期研究表明细小病毒H-1(H-1 PV)对胃癌细胞生长具有一定抑制作用,非结构蛋白NS1可能是其细胞毒作用的效应蛋白。胃癌细胞CD44+群体中可能含有肿瘤干细胞。目的:探讨H-1 PV非结构蛋白NS1基因对不同分化程度的人胃癌细胞的影响。方法:以双酶切和质粒测序鉴定真核表达质粒pcDNA3.1-NS1,采用脂质体法将重组质粒转染高分化胃癌MKN28细胞、中分化胃癌SGC7901细胞和低分化胃癌MKN45细胞,并设置空质粒转染对照。G418筛选稳定转染的细胞克隆,以RT-PCR法检测NS1基因表达,裸鼠体内成瘤实验检测NS1基因对不同分化程度胃癌细胞的作用,流式细胞术分析CD44表达。结果:重组质粒pcDNA3.1-NS1转染的三种胃癌细胞均稳定表达NS1基因。以106/300μl浓度的肿瘤细胞皮下接种裸鼠3周后,MKN28细胞空质粒转染组和重组质粒pcDNA3.1-NS1转染组均观察到肿瘤生长;SGC7901、MKN45细胞空质粒转染组形成瘤体,而重组质粒pcDNA3.1-NS1转染组未见瘤体。转染重组质粒pcDNA3.1-NS1后,MKN28细胞不表达CD44,SGC7901和MKN45细胞CD44表达明显降低。结论:H-1 PV非结构蛋白NS1基因表达对中低分化的胃癌细胞有较好的抗肿瘤活性,可能与其降低胃癌干细胞表型CD44的表达有关。

利用DNA免疫技术制备抗登革2型病毒NS2B蛋白多克隆抗体

目的构建登革2型病毒(dengue virus serotype2,DV2)非结构蛋白NS2B的真核表达质粒pCAGGS-P7/NS2B,进行DNA免疫,制备小鼠抗NS2B特异性多克隆抗体。方法PCR扩增DV2-NS2B基因片段,构建真核表达载体pCAGGS-P7/NS2B,采用脂质体介导的方法转染Vero细胞,检测目标蛋白的表达。用该表达质粒免疫BALB/c小鼠,制备抗NS2B抗血清。结果成功构建真核表达重组质粒pCAGGS-P7/NS2B,该重组质粒具有良好的免疫原性,免疫小鼠后所获的抗血清,抗体效价达1∶3200,Western blot和间接免疫荧光证实抗血清能特异性地识别DV2-NS2B蛋白。结论通过DNA免疫所制备小鼠抗DV2-NS2B抗血清能特异性地识别DV2-NS2B蛋白。

乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1蛋白基因在原核细胞中的高效表达及其表达产物的抗原性分析

目的将乙型脑炎病毒NS1蛋白基因克隆至pET28-a(+)表达载体,构建原核表达载体pET-NS1,并使该基因在E.coli中高效表达,为进一步研制乙脑早期诊断试剂奠定基础。方法根据GenBank中提供的乙型脑炎病毒SA14-14-2株全基因序列设计引物,通过反转录及巢式PCR方法扩增目的片段,测序后连接pET28-a(+)载体,构建重组表达载体pET-NS1,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导获得高效表达。结果扩增出了1300bp的基因片段,与预期大小一致,测序后经Blast验证与已发表乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1蛋白基因序列同源性为100%,成功克隆至表达载体pET28-a(+)并获得高效表达,表达产物分子量约为45kD,Western blot分析表明该表达产物具有良好抗原性。结论该表达产物的稳定高效表达及其抗原特异性为乙脑的诊断试剂开发提供了依据。

丙型肝炎病毒非结构区NS5A研究进展

0引言 目前全球各国丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染率为0.5%～4%,平均为3%左右[1-12],其中20%左右是急性肝炎,70%～80%转变成慢性肝炎,而慢性丙型肝炎一般经过20 a～30 a发展为肝硬变或肝细胞癌(HCC),HCV相关性终末期肝病已成为欧美一些国家进行肝移植的主要适应证[12-28],危害极大.HCV是正单股RNA病毒,包括5′非编码区(5′non-coderegion,5′-NCR),一个长约9400bp的单一开放阅读框(openreading frame,ORF)和3′非编码区(3′non-encode region,3′-NCR),5′-NCR其间有内源性核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)其中OFR包括结构区(structural region)和非结构区(nonstructural region),在结构区中有C,E1,E2,P7区,在非结构区中有NS2,NS3,NS4A,NS5A和NS5B区等[24,29-33].近年来,有关HCV NS5A区的结构与功能倍受关注,现就HCV NS5A作一综述.

丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白2在大肠埃希菌中表达及生物信息学分析

目的:构建丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白2(NS5ATP2)原核表达载体并诱导其在大肠埃希菌中表达。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以从HepG2细胞提取的mRNA为模板,扩增NS5ATP2目的基因片段,T-A克隆连接到pGEM-T载体,测序正确后将目的片段插入原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导NS5ATP2融合蛋白的表达,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot免疫印迹分析和证实融合蛋白的表达;以生物信息学方法对蛋白结构和功能进行预测。结果:利用RT-PCR扩增获得NS5ATP2基因片段,IPTG诱导BL21宿主菌成功表达了NS5ATP2,经SDS-PAGE和Western blot分析得到证实;生物信息学预测结果显示此蛋白富含螺旋结构,为非跨膜蛋白,无信号肽。结论:利用大肠埃希菌BL21(DE3)能够成功表达NS5ATP2蛋白,为今后研究NS5ATP2蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了的基础。

登革1型病毒NS1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的重组表达登革1型病毒NS1蛋白并制备多克隆抗体。方法通过RT-PCR扩增编码登革1型病毒NS1蛋白的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)后经酶切测序鉴定,获得重组质粒pET-NS1。进一步使用IPTG诱导表达,经免疫印迹鉴定后,采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中纯化回收融合蛋白,并通过透析对目的蛋白进行复性;纯化复性后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光法测定抗体效价。结果成功构建了高效表达登革1型病毒NS1蛋白的原核表达载体,表达的重组NS1蛋白占菌体蛋白总量的50%以上,以包涵体形式存在;免疫印迹表明表达的重组NS1蛋白能够为登革病毒兔抗血清识别,纯化后纯度可达95%以上;免疫小鼠后获得了效价>1∶1000的抗登革病毒NS1蛋白的鼠多克隆抗体。结论原核表达的重组NS1蛋白具有良好的免疫原性,诱导产生的多克隆抗体能够有效识别天然NS1蛋白,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体的生物学功能奠定了基础。

HCV非结构蛋白5A对HIV长末端重复序列影响的初步探讨

目的本研究拟探讨HCV非结构蛋白5A(NS5A)对HIV长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)影响,从而为HCV对HIV的影响提供实验依据。方法将构建的LTR启动子驱动的荧光素酶(Luc)报告基因表达质粒(pGL3-LTR-Luc)和含HCV NS5A基因的表达质粒pCNS5A共转染肝癌细胞株(Huh7细胞),采用免疫细胞化学技术、Western Blot及逆转录聚合酶链反应检测HCV NS5A蛋白及mRNA的表达;本实验分三组,将质粒pGL3-LTR-Luc(空白组)、质粒pRc/CMV+pGL3-LTR-Luc(对照组)、质粒pCNS5A+pGL3-LTR-Luc(实验组)分别转染Huh7细胞,48 h后收集细胞,采用Luc活性检测LTR的活性,以观察HCV NS5A对LTR的调控影响。所得荧光活性值以均数±标准差表示,采用Levene's方差齐性检验,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较行LSD-t检验。结果转染pcNS5A质粒的Huh7细胞质经RT-PCR及Western Blot检测,HCV NS5A mRNA及蛋白在细胞中获得表达。方差分析结果提示LTR荧光活性在三组间有明显的差异(F=7.876,P=0.002),进一步比较各组间的差异,结果提示共转染质粒pcNS5A+pGL3-LTR-Luc组的Huh7细胞中Luc相对活性(22 476±4471)明显高于单转染pGL3-LTR-Luc组(15 887±3039,P=0.002)及共转染质粒pRc/CMV+pGL3-LTR-Luc组(16 321±4162,P=0.008),差异有统计学意义。结论表达HCV NS5A的质粒pCNS5A成功转染至Huh7细胞;HCV NS5A蛋白能激活HIV LTR,提示HCV NS5A可能为HCV促进HIV复制的分子机制之一。

HCV非结构蛋白质5A基因全长和高免疫源区的表达及免疫活性检测

目的探讨HCV非结构蛋白质5A(NS5A)基因全长和高免疫源区的表达并比较其检测灵敏度。方法以含HCV全基因组的质粒pBRtm/HCV-3011(1型)为模板,采用PCR方法扩增出NS5A全长基因(以下用NS5AL代替)和高免疫源区基因(以下用NS5AS代替),与pET-32a载体相连接构建重组表达载体pETNS5AL和pET-NS5AS,分别转化E.coliRosetta(DE3)pLysS和BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,蛋白质印迹法检测其表达,镍螯合(Ni2+-NTA)琼脂糖亲和层析柱纯化重组NS5AL和NS5AS蛋白,最后通过ELISA法检测重组蛋白的免疫活性并对其检测灵敏度进行比较。结果SDS-PAGE鉴定与蛋白质印迹验证结果表明,重组NS5AL和NS5AS蛋白均得到很好地表达;纯化的重组NS5AL和NS5AS蛋白浓度分别为0.146和0.426mg/ml,纯度均>96%;ELISA检测结果表明,重组NS5AL和NS5AS蛋白均具有较好的免疫活性,且重组NS5AL蛋白的检测灵敏度明显高于NS5AS。结论成功地表达出重组NS5AL和NS5AS蛋白,均具有较高的免疫活性。

SARS-CoV与SARS-CoV-2结构蛋白辅助T细胞表位的预测及比较

目的通过预测分析严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)与SARS-CoV-2结构蛋白中潜在的辅助性T细胞(Th细胞)表位,为新型冠状病毒疫苗的开发设计寻找合适的靶点。方法在美国国家生物技术信息中心的GenBank数据库中检索SARS-CoV与SARS-CoV-2病毒的参考序列,利用序列对比软件MEGA7和GeneDoc对2种病毒的刺突蛋白(S蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)、膜蛋白(M蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)的氨基酸序列进行比较分析。利用SYFPEITHI、IEDB和NetMHCIIpan在线生物信息学工具预测筛选SARS-CoV和SARS-CoV-2可能的Th细胞表位,并在此基础上寻找2种病毒同源的潜在表位。最后利用ProtScale对含同源表位的蛋白质进行疏水性分析比较。结果2种病毒S蛋白同源性为75%,其他蛋白同源性分别为E蛋白94%、M蛋白90%及N蛋白90%。在线软件预测到SARS-CoV-2有22个潜在的Th细胞表位,SARS-CoV有25个潜在的Th细胞表位。进一步对比获得2对完全同源表位和6对高度同源表位,位于3对蛋白中,且ProtScale对比分析2种病毒相应蛋白的疏水性差异微小。结论对比分析得到8对完全同源或高度同源表位,且含差异氨基酸的对应肽段疏水性差异较小,同源性较高的Th细胞表位可考虑作为SARS-CoV-2疫苗设计的候选表位。

广东省SARS冠状病毒分离株S基因全序列分析

目的 测定并分析广东省传染性非典型肺炎病人标本中分离到的严重急性呼吸综合征 (SARS)冠状病毒的S基因全序列。方法 选取 3株来自中山市、广州市、江门市传染性非典型肺炎病人的SARS冠状病毒分离株 ,设计 8对相互嵌套的S基因特异引物扩增病毒的S基因 ,直接进行PCR产物测序 ,将所测的序列与从GenBank上获得的世界各地 10株SARS冠状病毒分离株的S基因序列用DNASTAR软件包进行基因变异分析。结果 3株毒株经PCR扩增后 ,均可获得大小分别为5 13、5 89、5 2 7、5 0 9、6 2 1、5 0 1、5 78、6 78bp的基因片段 ,测序并拼接可获得一长 376 8个碱基S基因全基因序列 ,编码 12 5 6个氨基酸 ;基因序列比对结果显示 ,与世界各地 10株毒株比较 ,核苷酸和氨基酸的最大同源性在 99 7%～10 0 0 %和 99 2 %～ 99 9%之间 ,其变异主要发生在S蛋白的S1片段。结论 SARS冠状病毒的S蛋白是比较保守的 ,但S1片段上某些位点的变异可能是病毒的毒力不同的主要原因。