HLA-肽复合物研究HBV/C区变异对HLA-A2限制性表位的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒 (HBV)C区热点变异S87G和 (或 )I97L对细胞毒T细胞表位形成的影响。方法 以我国C基因型HBVDNA参照序列为标准 (EMBL :Y1885 5 1885 8) ,在计算机预测I97L和 (或 )S87G变异对HLA A 0 2 0 1限制性表位影响的基础上 ,利用基因工程制备的HLA A 0 2 0 1轻链、重链多肽在体外只能与相应表位短肽形成稳定复合物的特点 ,对预测到的可疑表位肽段进行验证。结果 I97L时 ,肽段HBcAg 96 10 5 (KLRQLLWFHI)的DC50比正常 (KIRQLLWFHI)时大 5倍以上 ;S87G无影响 ;I97L、S87G没有协同作用。人工合成该短肽在体外不能与HLA A 0 2 0 1轻、重链多肽形成稳定复合物。结论 HBV/C基因I97L和 (或 )S87G变异时 ,没有新的HLA A 0 2 0 1限制表位产生。

预先形成的重链二硫键有助于HLA-A2-抗原肽复合物体外折叠

目的: 提高可溶性HLA -A2 肽复合物体外折叠效率。方法: 在变性非还原条件下提取原核表达的HLA重链(HC)。通过离子交换及硫酸铵沉淀初步纯化后, 在β2微球蛋白(β2m)及特异性抗原肽 (Try369-377 )存在的情况下, 于pH6. 6的折叠缓冲体系中稀释复性。利用Westernblot及ELISA检测折叠产物。结果: 折叠复合物中主要含有HLA-A2 抗原肽复合物和β2m, 较少含有HC聚合体; 折叠效率较传统方法提高 2. 5倍。结论: 通过与传统方法作比较, 证实此法折叠效率比传统方法高, 为进一步HLA 肽四聚体及人工抗原提呈细胞的制备可提供足够可溶性的HLA -A2 肽单体。

三种白癜风抗原肽HLA-A*0201四聚体的构建和临床初步应用

目的：体外构建三种白癜风抗原肽HLA-A ＊ 0201复合物四聚体,并用其检测白癜风患者外周血中抗原特异性细胞毒性CD8＋T细胞（CTL）.方法：取原核表达HLA0201＊-BSP和β2M蛋白,分别同MelanA 26-35、gp100 209-217、tyrosinase 1-9三种白癜风抗原肽进行体外复性折叠,形成可溶性抗原肽HLA-A＊0201复合物,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化得复合物单体,再与藻红蛋白标记的链霉亲合素按4：1比例耦合成四聚体,并采用斑点印迹法对上述构建的四聚体进行鉴定.运用流式细胞术检测分析该四聚体结合白癜风患者外周血中特异性CTL的能力.结果：斑点印迹检测显示三种具有天然构象的生物素化的白癜风抗原肽HLA-A＊0201四聚体复合物构建成功;流式细胞术检测结果显示所制备的四聚体可与白癜风患者血液中抗原特异性CTL结合.结论：成功制备了三种具有完整构象的生物素化白癜风抗原肽HLA-A＊ 0201四聚体,此四聚体均可检测白癜风抗原特异性CTL.

用计算机程序预测可与HLA－A2分子结合的HCV抗原肽

本文设计了一个具有查找ＨＬＡ分子结合多肽功能的“Ｆｉｎｄｉｎｇｅｐｉｔｏｐｅ”程序，并针对ＨＬＡ－Ａ２分子特异的多肽结合基序（ｐｅｐｔｉｄｅｂｉｎｄｉｎｇｍｏｔｉｆ）建立了一个计算机评分系统。对ＨＣＶ１型丙型肝炎病毒株中的ＨＣＶ－１和ＨＣＶ－Ｈ两条氨基酸序列分析后发现，报道的ＨＩ－Ａ－Ａ２分子结合的ＨＣＶ抗原均包含于查找的结果中，且绝大多数（１１／１２）评分≥１４４分。提示该程序可作为一种较为灵敏的能预测与ＨＬＡ－Ａ２分子结合的ＨＣＶ抗原的方法。

病毒肽/HLA-A2与单链抗体融合蛋白介导病毒特异性CTL杀伤肿瘤细胞

目的 研究人工构建的病毒肽/HLA-A2复合物与抗转铁蛋白受体（CD71）单链抗体融合蛋白（HBC-A2/scFv）介导病毒特异性CTL杀伤肿瘤细胞的作用.方法 将HBC-A2/scFv融合蛋白结合到高表达CD71的肿瘤细胞表面,利用加载HBC抗原肽的 T2细胞在体外诱导产生抗原特异性CTL,用乳酸脱氢酶释放法检测CTL对肿瘤细胞的特异性杀伤作用.结果 HBC-A2/scFv融合蛋白可结合于CD71阳性的肿瘤细胞K562、HepG2及U937表面,结合率分别为：37.30%±8.25%、27.20%±3.88%和21.80%±6.49%.体外诱导产生的CTL/HBC能杀伤结合有HBC-A2/scFv的K562、HepG2及U937细胞,杀伤率明显高于未结合HBC-A2/scFv的对照组（K562：42.08%±1.14%vs 8.07%±1.39% HepG2：49.72%±1.59%vs12.46%±1.26% U937：39.72%±3.26%vs 7.13%±1.48%）.结论 HBC-A2/scFv融合蛋白能介导病毒特异性CTL杀伤肿瘤细胞,为肿瘤细胞免疫治疗提供了新的思路和实验依据.

乙型肝炎相关肝癌患者乙型肝炎病毒不同抗原肽特异性CD3＋CD8＋人白细胞抗原-A2＋细胞表达

目的探讨乙型肝炎相关肝细胞癌（HCC）患者外周血单个核细胞（PBMc）中HBV不同抗原肽特异性CD3＋CD8＋人白细胞抗原（HLA）-A2＋细胞的表达。方法从4例HLA-A2阳性乙型肝炎相关HCC患者外周血中分离PBMC，分别与HBV抗原肽sAg（FLLTRILTI、GLSPTVWLSV、WLSLLVPFV），HBVcore（FLPSDFFPSV）和HBVpol（FLLSLGIHL）及抗一CD3一pacific blue、抗-CD8-异硫氰酸荧光素共育，流式细胞仪分析HBV／HLA—A2-CD3-CD8阳性细胞，克隆培养，筛选出克隆培养的抗HBVT淋巴细胞；再与含有HBV的肝癌细胞株HepG2（HLA-A2^＋）共育，ELISA法检测其分泌IFN-γ水平。结果4例患者体内受GLSPTVWLSV肽诱导的特异性抗HBVT淋巴细胞占所有CD8^＋细胞的1．44％±0．04％，高于FLLTRILTI肽的0．68％±0．08％、FLPSDFFPSV肽的1．06％±0．09％、FLLSLGIHL肽的0．56％±0．04％和WLSLLVPFV肽的0．46％±0．08％（t=0．001，P〈0．05）。将GLSPTVWLSV／HLAA2获得的HBV／HLA-A2 Pentamer-CD3-CD8阳性细胞克隆，获得2株抗HBVCD8T淋巴细胞，与负荷GLSPTVWLSV肽段的HepG2（HLA-A2＋）细胞共育，CD8T淋巴细胞分泌较高水平的IFN-γ。结论乙型肝炎相关HCC患者外周血中存在针对不同HBV抗原肽的特异性抗HBVCD8T淋巴细胞，其表达量与抗原肽段有关。

BirA酶基因表达载体的构建、原核表达及表达产物的活性鉴定

目的:构建生物素-蛋白连接酶(BirA酶)基因的表达载体,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中表达具有生物学活性的BirA酶。方法:用PCR法扩增BirA酶基因。将PCR产物克隆入pGEX-4T-2中构建BirA酶-GST融合蛋白基因的重组表达载体pGEX-BirA。经测序验证后,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,表达产物采用谷胱苷肽-琼脂糖层析柱进行纯化。以带有生物素酶底物肽(BirAsubstratepeptide,BSP)的HLA-A2-肽复合物为底物,用ELISA和Westernblot鉴定表达产物的生物素化活性。结果:构建了pGEX-BirA原核表达质粒,并在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达Mr为61300的BirA酶-GST融合蛋白,表达产物经谷胱苷肽-琼脂糖层析柱纯化后,得到N端带有GST标签的BirA酶蛋白。ELISA和Westernblot的结果显示,表达产物能使HLA-A2-肽复合物生物素化。结论:成功地制备了具有生物学活性的Bi-rA酶,为研究蛋白质分子的相互作用提供了有效的制剂。

免疫学

猪FasL基因在猪软骨细胞上的表达和鉴定；重组蓖麻毒紊A链的融合表达、纯化及活性研究；凋亡抑制蛋白survivin在活化T细胞中的表达及其意义；人CD59基因的突变和表达及其活性研究；预先形成的重链二硫键有助于HLA-A2-抗原肽复合物体外折叠；人源噬菌体抗体库的构建及抗人NH-LBP抗体的筛选与鉴定；抗禽流感病毒轻链抗体库的构建；CTL识别的HLA-A2限制性人卵巢癌相关抗原OVA66表位的鉴定；含多抗原表位的嵌合SARS-CoV基因疫苗的构建和免疫原性研究；TM-TNF-α介导的反向信号协同增强sTNF-α，对U937细胞的激活作用；NK92细胞的胞吐效应与SNAP-23蛋白转位相关；CXCL16抗体可阻断BCG和LPS诱导的小鼠免疫性肝损伤；GM-CSF对抗原化抗体基因免疫TH细胞应答的调节作用；趋化性细胞因子受体在Tc1和Tc2亚群的差异表达；在单个细胞水平上分析抗原特异性Th1／Th2细胞因子产生的关联性；人OX40-Fc分子的构建、真核表达及活性研究；人免疫缺陷病毒Ⅱ型核心蛋白DNA疫苗的实验免疫研究；PD-L1 mAb的制备、鉴定及其特性的研究；噬菌体呈现的多聚多肽3A8诱导Jurkat细胞的凋亡效应；T细胞受体Dβ-Jβ sjTRECs连接区多样性；α-Dystroglycan在胸腺T细胞的表达及其对胸腺发育的作用；Bcl-2家族蛋白参与调节CD3ε和5-氟尿嘧啶介导的T淋巴细胞凋亡；人白细胞介素21在真核细胞中表达及其体外促T细胞增殖作用；小干扰RNA特异性抑制淋巴细胞共刺激分子CD28基因表达的研究；猪-猕猴延迟性异种移植排斥反应的发生机制；天花粉蛋白在不同小鼠品系中区分性下调树突状细胞IL-12分泌和CD80表达；复合HA-2氨基多肽可增强chitosan-DNA疫苗的免疫保护效果；CD4^＋CD25^＋调节性T细胞抑制小鼠自身免疫性甲状腺炎的发生；人β2-微球蛋白在pET-22b（＋）表达载体中的克隆、表达与纯化；B7-1／B7-H1相对比例变化对Hsp70-肽复合物抗肿瘤免疫效应的影响。