柯萨奇病毒A组2型VP1和VP3蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的制备柯萨奇病毒A组2型(Coxsackievirus A2,CV-A2)兔抗病毒蛋白质1(viral protein 1,VP1)和病毒蛋白质3(viral protein 3,VP3)多克隆抗体,为CV-A2相关研究制备定性、定量试剂。方法用逆转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)分别扩增CV-A2 VP1、VP3基因片段(612、420个碱基),并将其克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,获得pGEX-6P-1-VP1-ΔN43、pGEX-6P-1-VP3-ΔN8。将其转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达N端带有谷胱甘肽S移换酶(glutathione S-transferase,GST)标签的重组蛋白,并对其进行纯化。将纯化的GST-CV-A2-VP1-ΔN43、GST-CV-A2-VP3-ΔN8融合蛋白经背部皮下免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗血清,并通过ELISA、Western blot和间接免疫荧光法(indirect immunofluorescent assay,IFA)进行鉴定。结果重组表达载体构建成功,目的蛋白是以不可溶的包涵体存在。ELISA结果显示,CV-A2-VP1-ΔN43所制备的免疫血清最大稀释倍数为106时,免疫血清的A450 nm值为免疫前血清的2.0倍;CV-A2-VP3-ΔN8制备的免疫血清最大稀释倍数为107时,免疫血清的A450值为免疫前血清的6.0倍。Western blot结果显示,所制备的多克隆抗体可特异性识别CV-A2-VP1、VP3。IFA结果显示,抗GST-VP1-ΔN43、GST-VP3-ΔN8多克隆抗体可特异性识别CV-A2 VP1、VP3蛋白。结论成功制备了特异性识别原核表达的CV-A2重组蛋白及天然CV-A2病毒颗粒中的VP1、VP3蛋白的多克隆抗体。该抗体的成功制备为结构蛋白VP1、VP3的功能研究及病毒定性定量分析奠定了基础。