基于病毒诱导的基因沉默(VIGS)方法的LsRGL1基因在生菜中的功能分析

为了确定LsRGL1基因对生菜抽薹的影响,以S39生菜品种为试验材料,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从S39生菜品种中克隆得到LsRGL1基因;采用病毒诱导基因沉默(VIGS)方法,利用烟草脆裂病毒(TRV)载体对目的基因进行沉默;采用表型观察、石蜡切片、实时荧光定量PCR(qPCR)方法、酶联免疫吸附法(ELISA)分别研究空白对照组(无TRV载体)、阴性对照组(按质量比1∶1同时注射TRV1空载体和TRV2空载体)和试验组(按质量比1∶1同时注射TRV1空载体和TRV2-LsRGL1重组载体)中植株表型、花芽分化、LsRGL1基因的相对表达量和内源激素质量分数的变化。结果表明:病毒侵染后,试验组植株的茎长相对于空白对照组和阴性对照组的茎长明显增大,且试验组各项表型数据均大于2个对照组的表型数据,而空白对照组与阴性对照组各项表型数据之间并未出现明显差异;石蜡切片结果表明试验组植株已经开始花芽分化,相较于对照组提前进入生殖生长时期;qPCR分析结果显示,试验组中LsRGL1基因的相对表达量相较于空白组和阴性对照组的显著下调,且下调幅度均超过50%。试验组中内源激素赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)、生长素(IAA)的含量显著高于对照组的含量,而茉莉酸(JA)含量显著下降。综上可知,沉默LsRGL1基因加快了生菜的抽薹。

病毒诱导的基因沉默

病毒诱导的基因沉默"(virus-induced gene silencing,VIGS)一词最早用于描述被病毒侵染的植物的恢复"现象,是一种植物抗病毒侵染的自然机制,现在已被开发成通过插入目的基因片段的重组病毒抑制植物内源基因表达的遗传技术,用于基因功能分析.VIGS由小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)驱动,siRNA单链与RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex,RISC)结合后,特异性地和与siRNA同源的靶标RNA结合,并降解RNA模板.已有源于15种不同类型病毒的VIGS载体得到开发和应用.在VIGS载体中插入的目的片段、重组VIGS病毒载体的植物导入方法、沉默处理时的寄主生育期、沉默处理后的植物培育条件等均显著影响VIGS的效率.作为一种新型的基因鉴定和功能研究技术工具,VIGS具有无需事先知道目的基因全长序列、获取表型迅速、无需构建转基因植株等诸多优点,已越来越广泛地被应用于植物基因功能研究.

病毒诱导的基因沉默及其在植物基因功能研究中的应用

RNA介导的基因沉默是近年来在生物体中发现的一种基于核酸水平高度保守的特异性降解机制 .病毒诱导的基因沉默 (virusinducedgenesilencing ,VIGS)是指携带植物功能基因cDNA的病毒在侵染植物体后 ,可诱导植物发生基因沉默而出现表型突变 ,进而可以研究该目的基因功能 .至今 ,已经建立了以RNA病毒、DNA病毒、卫星病毒和DNA卫星分子为载体的VIGS体系 ,这些病毒载体能在多种寄主植物 (包括拟南芥、番茄和大麦 )上有效抑制功能基因的表达 .VIGS已开始应用于N基因和Pto基因介导的抗性信号途径中关键基因的功能研究、抗病毒相关的寄主因子研究以及植物代谢和发育调控研究 .在当前植物基因组或EST序列大量测定的情况下 。

植物中病毒诱导基因沉默的研究进展

研究表明TGS往往与目的基因启动子的甲基化密切相关,RNA沉默则由目的基因的 mRNA特异性降解引起。植物体中诱导RNA沉默的外部因素有转基因和病毒。与传统的转基因 技术相比,病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing VIGS)是一种瞬时表达体系,能在较 短的时间里取得良好的效果,目前被广泛地用来研究植物基因的功能。就VIGS的研究进展做一 个比较全面的综述。阐述了DNA和RNA病毒诱导植物基因沉默的机理,同时讨论了利用病毒诱 导的基因沉默(VIGS)鉴定植物基因功能的优缺点和将来的发展趋势。

病毒诱导番茄的基因沉默

该实验通过RT-PCR获得了番茄八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase,PDS)基因的部分序列,双酶切PDS片段和烟草脆裂病毒载体(pTV00),构建重组载体pTV00-PDS,经农杆菌GV3101介导侵染番茄叶片并观察植株表型变化。结果显示,被侵染的番茄表现出明显的光漂白现象。半定量RT-PCR检测表明,PDS的mRNA被显著降解。该沉默体系的建立为下一步大规模验证番茄基因功能奠定了基础。

植物基因功能鉴定新工具——病毒诱导基因沉默技术的研究进展

病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术是指带一段靶基因序列的VIGS重组病毒侵染植物、引起植物同源基因沉默与表型变异,进而通过表型变异进行基因功能分析的方法,是近年发展起来的从反向遗传学方向快速鉴定植物基因功能的技术,是转录后基因沉默机制的一种表现。①VIGS的分子机制,涉及基因沉默的起始、维持和信号放大、传播共3个阶段;②VIGS技术、载体与方法学的发展;③VIGS作为基因功能研究的优越性,如不必进行转基因、操作方法简便、获得结果快速等;④应用VIGS对植物抗病途径、代谢与发育调控中参与基因功能进行研究的概况。同时,展望了VIGS技术作为植物功能基因组学功能分析的高通量技术平台的美好前景。

辣椒病毒诱导基因沉默体系的构建

采用RT-PCR方法克隆辣椒八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因部分序列,并构建病毒诱导基因沉默(VIGS)载体pYL156-PDS,经农杆菌介导侵染辣椒叶片,采用表型观察、半定量RT-PCR方法评价构建的VIGS体系的沉默效果.结果表明,辣椒新生叶片呈现明显的光漂白现象,且叶片内源PDS基因表达量明显低于对照.研究证明,辣椒VIGS体系已被成功构建,为规模化验证辣椒基因功能提供了技术平台.

病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术及其在大豆基因功能研究和育种中的应用潜力

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是植物体抵抗病毒侵染的一种自然防御机制,近年来已发展成为一种基因功能研究的有效手段。与突变体筛选、转基因、基因敲除等技术相比,VIGS技术因具有周期短、成本低、可迅速观察表型等优点而被广泛应用于基因的功能鉴定。文章对VIGS技术的分子机理、病毒载体系统、稳定遗传VIGS植株的获得策略及其在大豆中的应用等内容进行了综述并对今后的发展趋势进行了讨论。

蔊菜病毒诱导基因沉默体系构建

构建蔊菜的病毒诱导基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)体系,旨在建立蔊菜的快速基因功能验证的方法。通过RT-PCR扩增出棉花、大豆、拟南芥的1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(Cloroplasto alterados,CLA)基因片段,并将其分别构建到烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的VIGS载体,通过农杆菌GV3101侵染蔊菜并观察蔊菜的表型变化。结果显示,3种不同的CLA基因所侵染的蔊菜均出现不同程度的白化现象,半定量RT-PCR检测显示CLA的mRNA被显著降解,表明成功构建了蔊菜的VIGS体系。

病毒诱导的基因沉默技术及其在植物中的研究进展

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是近年来发现的一种转录后基因沉默现象,是植物抵抗病毒侵染的一种自然机制。现已被开发为快速鉴定植物基因功能的一种反向遗传学新技术。与传统的植物转基因技术相比,VIGS无需构建转基因植株,而且具有操作简便、获得表型快速等优点,目前已广泛应用于与植物抗病、逆境胁迫、细胞信号转导以及生长发育等相关基因功能的研究。该文就VIGS技术的作用机理、主要操作规程、在植物基因功能研究方面的应用以及存在的问题进行综述。

病毒诱导的基因沉默及其在植物研究中的应用

病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)在植物的基因功能鉴定中是一个非常有用的工具,在植物中了得到广泛应用。与传统的研究植物基因阻断的方法相比,VIGS具有简便高效、周期性短、不需要对植物进行转化以及可以沉默基因家族等特点,而且在一定条件下其沉默效应还能够传递给后代。介绍了VIGS的原理与操作过程,综述了该技术的应用与研究成果,有助于推动其在植物尤其是农作物育种中的进一步应用与发展。

烟草坏死病毒A诱导的基因沉默及其条件优化

以烟草坏死病毒A中国分离物(Tobacco necrosis virus A Chinese isolate,TNV-AC)侵染性cDNA克隆为基础,通过基因替换、基因插入策略构建获得多种重组TNV-AC,比较了外源基因片段插入位置、插入形式及接种植物培养温度对TNV-AC诱导的基因沉默的影响.外源基因片段替换CP基因19～828 nt的重组TNV-AC丧失了在本生烟中的系统移动能力,也不能有效诱导相应基因发生明显的沉默,说明替换策略不适合于TNV-AC.向CP基因终止密码子UAG附近插入外源基因片段后,TNV-AC仍可进行复制,但最适的插入位点位于UAG之后,且容纳外源片段的长度约为120 nt.当外源片段以反向重复的形式插入UAG之后,诱导基因沉默的效率较高.接种植物的培养温度也会显著影响基因沉默的效率以及插入片段的稳定性,低温(18℃)条件下诱导NbPDS基因沉默的效率明显高于高温(24℃)条件,且沉默表型可持续110天以上.除了本生烟PDS基因,TNV-AC沉默载体还可诱导本生烟sulfur基因Su和镁离子螯合酶H亚基基因ChlH发生沉默,以上结果说明,TNV-AC具有开发为本生烟基因功能鉴定的新VIGS载体的潜力.

病毒诱导的基因沉默的发展及在植物生物逆境上的应用

病毒诱导的基因沉默(Virus-indcued gene silencing,VIGS)技术是指带一段包基因序列的重组病毒侵染植物,引起植物同源基因沉默与表型变异,进而通过表型变异进行基因功能分析的方法,是近年发展起来的植物基因功能研究的新技术。为了进一步探讨VIGS应用策略,笔者归纳了VIGS的分子机理、VIGS的载体开发和VIGS技术在植物生物逆境方面的研究应用3个方面近些年的研究进展,得出了VIGS在植物生物逆境方面的问题及应用价值。

苏麦3号小麦穗部病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系的建立及验证

为了探讨利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系在小麦穗部进行基因沉默的可行性,用大麦条纹花叶病毒诱导苏麦3号小麦穗部PDS基因的转录后沉默,再接种禾谷镰刀菌进行抗性鉴定。结果表明,与接种空载BSMV∶00的对照相比,接种BSMV∶PDS的小麦穗中PDS基因表达量下调了77%(P<0.05)。接种BSMV∶00的小麦穗受到赤霉病菌侵染后,穗部平均病小穗数和DON毒素含量分别为2.75个和4.55μg/g,与接种无菌水对照无显著差异(P>0.05)。说明在苏麦3号穗部VIGS系统中,通过接种病毒能使靶标基因沉默;接种赤霉病菌后,苏麦3号病小穗数和DON毒素含量不受接种病毒的影响,对赤霉病菌的抗性保持不变,建立的VIGS体系可以应用于小麦赤霉病抗性候选基因的功能分析。

病毒诱导的基因沉默

病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)是近年发现的一种转录后基因沉默的现象,是快速鉴定植物基因功能的一种反向遗传学新技术,近年来成为植物基因功能研究的有力工具.文章从病毒诱导基因沉默的发现、作用机制、优势、病毒抑制子及其在植物基因功能研究和植物抗病毒的应用等方面进行了综述.

植物病毒诱导的基因沉默在基因功能研究中的应用

传统的植物遗传转化方法周期长、工作量大、过程繁琐,不利于基因功能的快速高通量鉴定．近年来随着基因沉默机制研究的深入和不断发展,利用病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)进行植物功能基因组研究作为一种快速、高通量的反向遗传学工具已被广泛应用在烟草、马铃薯、番茄等植物中, 在大规模的植物基因组功能鉴定中展示了广阔的应用前景．综述了 VIGS 的作用机制、植物病毒栽体、转化方法以及在植物基因功能研究等方面的应用及前景．

病毒诱导基因沉默技术引入普通生物学实验教学实践

普通生物学实验具有实践性强和操作性强等特点,在大学生物类专业人才培养中占有显著地位。为了能在实验教学中充分锻炼和培养学生的实验操作技能、创新能力和意识,提高教学质量,将当前生物学研究前沿技术--病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)技术引入普通生物学实验教学中。通过实验教学,明显提高了学生的兴趣,培养了学生独立工作能力和创新思维能力,使学生初步具备一定的科研能力和创新能力。

病毒诱导基因沉默的研究进展

对病毒诱导的基因沉默(VIGS)的发现、载体的开发、作用机理和优势的研究,以及VIGS在植物基因功能鉴定上的应用和展望进行了综述.

烟草脆裂病毒诱导的基因沉默在植物基因功能研究中的应用

烟草脆裂病毒(tobaccorattlevirus,TRV)是一类应用比较广泛而且效率和持久性较好的病毒载体,能够介导基因沉默同时不会带来病毒诱导的症状。改造后的病毒能够促进非病毒序列的插入以及对植物的后续感染,也可以鉴定宿主植物生长点的基因,因此TRV在植物基因功能鉴定中具有广泛的应用。该文介绍TRV沉默载体的构建、诱导基因沉默原理、在植物基因功能研究中的应用以及优缺点。

重组的马铃薯X病毒载体诱导烟草rbcS基因沉默

用重组马铃薯病毒X (potatovirusX ,PVX)载体侵染烟草植株 (Nicotianabenthamiana) ,该载体带有与RubisCO小亚基 (ribulosebisphosphatecarboxylasesmallsubunit ,rbcS)基因同源的 5 0 0个核苷酸的cDNA片段。 2～ 3周后 ,烟草植株出现退绿的rbcS基因沉默的明显症状。利用烟草叶片总RNA ,进行Northern杂交检测内源rbcS的表达和病毒复制的情况表明 ,受病毒侵染的植株内源rbcS基因的表达受到了明显的抑制 ,而病毒的复制并没有受到影响 ,重组的病毒载体上与内源基因同源的核苷酸序列诱导了内源rbcS基因的沉默。