病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术及其在大豆基因功能研究和育种中的应用潜力

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是植物体抵抗病毒侵染的一种自然防御机制,近年来已发展成为一种基因功能研究的有效手段。与突变体筛选、转基因、基因敲除等技术相比,VIGS技术因具有周期短、成本低、可迅速观察表型等优点而被广泛应用于基因的功能鉴定。文章对VIGS技术的分子机理、病毒载体系统、稳定遗传VIGS植株的获得策略及其在大豆中的应用等内容进行了综述并对今后的发展趋势进行了讨论。

番茄SlERF-H6基因VIGS沉默载体构建

番茄(Solanum lycopersicum)具有较高的营养价值,深受消费者的喜爱,目前番茄已经成为广泛种植的经济作物之一。乙烯响应因子(ethylene response factor,ERF)是一类植物特有的转录因子。ERF在植物形态发生、逆境响应、成熟衰老、激素信号转导和代谢物调节等多种生理过程中起重要的调节作用。文章以番茄的SlERF-H6(LOC101259323)基因为研究对象,通过对SlERF-H6的基因序列进行分析,获得该基因的特异性区域沉默序列。利用同源重组技术成功构建了番茄SlERF-H6病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)载体。为进一步探究番茄SlERF-H6基因在果实成熟中的作用提供参考。

VIGS诱导GS同工酶基因沉默对烤烟氮代谢的影响

【背景和目的】谷氨酰胺合成酶(GS)是烤烟氮代谢的关键酶,为探究沉默GS同工酶基因对烤烟氮代谢的影响。【方法】采用病毒诱导基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术构建GS同工酶基因(NtGS1、NtGS2)瞬时沉默表达载体,测定了烤烟品种中烟100叶片经VIGS处理10 d,20 d和30 d的NtGS1-1、NtGS1-2、NtGS2相对基因表达量和谷氨酰胺合成酶(GS)、硝酸还原酶(NR)活性以及叶片可溶性蛋白、总氮、烟碱含量和烟株生物量。【结果】沉默NtGS1基因的处理对NtGS1-1沉默效率最高为50.4%,对NtGS1-2沉默效率最高为56%,沉默NtGS1和NtGS2基因的处理对NtGS2沉默效率最高为54.9%;沉默NtGS1和NtGS2的烟株叶片重、GS、NR活性、可溶性蛋白、总氮、烟碱含量都显著低于对照。【结论】本研究建立的VIGS体系有效下调了GS同工酶基因的表达,同时沉默NtGS1和NtGS2(TRV::GS1::GS2)可抑制叶片氮素同化利用,降低氮代谢关键酶活性与含氮化合物含量。

苏麦3号小麦穗部病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系的建立及验证

为了探讨利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系在小麦穗部进行基因沉默的可行性,用大麦条纹花叶病毒诱导苏麦3号小麦穗部PDS基因的转录后沉默,再接种禾谷镰刀菌进行抗性鉴定。结果表明,与接种空载BSMV∶00的对照相比,接种BSMV∶PDS的小麦穗中PDS基因表达量下调了77%(P<0.05)。接种BSMV∶00的小麦穗受到赤霉病菌侵染后,穗部平均病小穗数和DON毒素含量分别为2.75个和4.55μg/g,与接种无菌水对照无显著差异(P>0.05)。说明在苏麦3号穗部VIGS系统中,通过接种病毒能使靶标基因沉默;接种赤霉病菌后,苏麦3号病小穗数和DON毒素含量不受接种病毒的影响,对赤霉病菌的抗性保持不变,建立的VIGS体系可以应用于小麦赤霉病抗性候选基因的功能分析。

基于VIGS技术的烤烟烟碱调控及对烟碱含量的影响

在对烤烟原料要求烟碱含量低的中烟工业企业中,烟碱含量过高的烟叶难以在原料配方中适配,导致工业可用性较低。为了降低烟叶中烟碱的含量,通过病毒诱导基因沉默技术(virus induced gene silencing,VIGS)构建烟碱合成过程中4个关键基因(NtA622、NtPMT、NtBBL、NtMYB305a)的靶向沉默体系,探究瞬时沉默对基因相对表达量及烟碱含量的影响,并对不同载体的沉默效率与烟碱降低率进行贡献度分析。结果表明,通过目标序列靶片段成功构建了基于VIGS技术的沉默载体;T2处理沉默NtPMT基因后,最大沉默效率为55.23%,T3处理沉默NtBBL基因后,沉默效率为50.78%,两者差异不显著;各处理沉默相应基因后,不仅表现出对应基因表达量的下调,同时对本研究中其他基因的表达量也有影响;烟碱降低最多的是T3处理,降低率达到39.34%,同时T3处理沉默NtBBL基因的沉默效率对烟碱降低的贡献度最大,为0.775。本研究建立的VIGS技术体系有效沉默目的基因的表达,沉默NtBBL基因的T3处理沉默效率较高,烟碱含量较低,为调控烟碱含量提供了一种新思路与方法。

病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)在园林植物中的研究与应用

基因沉默在基因功能验证中应用愈加广泛,而病毒诱导的基因沉默技术作为其主要的方法之一,对于基因验证具有重要作用。从VIGS的发展、原理、分类、效率及应用等方面梳理病毒诱导的基因沉默技术在园林植物中的研究与应用,以期为园林植物的基因组研究夯实基础。

中国番茄黄化曲叶病毒利用根吸收法诱导基因沉默(VIGS)的初步研究

以含硫黄素酶Su基因的中国番茄黄化曲叶病毒卫星DNA作为载体,通过冻融法将其转化到农杆菌中,利用根部吸收法进行农杆菌侵染,对农杆菌介导的病毒诱导基因沉默体系进行了优化,探讨对病毒诱导基因沉默效率的影响。结果显示以OD600值为1.5的含质粒pBinPLUS-2mβ-Su,pBinPLUS-1.7A的农杆菌菌液1∶1混合进行根部吸收法侵染22-25 d的番茄幼苗,目的基因Su沉默导致番茄幼苗出现光漂白现象,半定量RT-PCR检测目的基因Su mRNA被显著降解,该体系的建立有利于对植物基因进行高通量功能分析。

菜心VIGS沉默植株构建的教学实验

普通分子生物学实验具有实践性和操作性强等特点,病毒诱导基因沉默技术(VIGS)是操作简单、实践性和操作性强的前沿生物学技术。本研究在菜心VIGS沉默植株构建的教学实验中,以种子真空侵染方法为基础,通过优化侵染浓度、侵染时间和共培养时间,得到了操作简单,侵染效率和植株成活率高,白化表型明显的侵染体系。通过实验教学可知,菌液OD600为0.80,侵染时间5 min,培养15 h的侵染效率最高,BcPDS基因的表达受到抑制,侵染优化后的菜心VIGS体系稳定且高效。该教学实验的构建使学生的学习兴趣得到了明显提高,培养了学生创新思维能力和独立工作能力,锻炼了学生的动手能力,并具备一定的创新和科研能力。

菊芋HtMYB2基因VIGS体系构建与功能验证

颜色作为一种重要的农艺性状,影响作物的价值。紫皮菊芋与白皮菊芋相比,具有较好的外观颜色、营养价值和商品价值。本研究旨在探究菊芋块茎表皮颜色形成的潜在机制。通过前期转录组测序技术对紫皮和白皮菊芋块茎表皮分析,筛选得到与花青素合成代谢相关转录因子HtMYB2。本研究以紫皮菊芋品种为材料,利用VIGS技术将HtMYB2进行基因沉默,对其功能进行验证。结果表明侵染后的菊芋块茎表皮颜色变浅,花青素含量显著下降为15.34 mg/g;同时RT-PCR结果显示HtMYB2基因表达量为2.06,与对照组相比显著降低,沉默效率为73.96%,推测HtMYB2基因的沉默使菊芋块茎中花青素基因的表达受阻,花青素合成功能减弱,导致花青素含量降低,表明HtMYB2基因在花青素合成途径中起正调控作用。本研究为菊芋块茎表皮花青素的生物合成机理提供理论依据,并进一步揭示了该基因在调控块茎颜色和花青素合成途径中的重要性。

病毒诱导基因沉默(VIGS)在禾本科植物中的研究进展

病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)是近几年新发展起来的一种反向遗传学技术。它是通过将含有目的基因的重组病毒载体导入到宿主植物中,抑制植物内源基因表达,使其表现出目标基因功能丧失或表达水平下降的表型,属于转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。与传统的技术相比,VIGS技术具有操作简便、无需构建转基因植株、能快速获得沉默表型等明显优点,现已被广泛应用于植物功能基因组学的研究。本文对VIGS的作用机制、操作过程、影响沉默效率的因素、应用领域各个方面进行阐述,其中会对禾本科植物中的可用载体、研究进展、前景展望进行重点介绍。

广藿香PcGA2ox1基因克隆、VIGS载体构建和表达分析

赤霉素2-氧化酶(gibberellin 2-oxidases,GA2ox)是赤霉素(GAs)代谢途径关键酶,调节活性GAs降解,在植物株型调控中发挥重要作用。为探寻GA2ox基因在广藿香中的功能,本研究对广藿香PcGA2ox1基因进行克隆,得到561 bp的CDS序列。生物信息学分析结果表明,PcGA2ox1蛋白编码186个氨基酸,为亲水性蛋白,分子量为20.98 kDa,等电点为5.81,不含信号肽,无跨膜结构域,具有GA2ox超基因家族的保守结构域,主要定位在细胞核。系统发育分析结果显示,PcGA2ox1基因与丹参GA2ox7的亲缘关系最为密切。qRT-PCR结果显示,PcGA2ox1基因在广藿香中的表达具有组织特异性,叶中表达量最高,根中表达量最低。用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术侵染广藿香的结果显示,侵染两周后,PcGA2ox1基因表达量比阴性对照下降83%,比空白对照下降71%,沉默效果明显。本研究结果可为深入了解PcGA2ox1结构、功能和作用机理奠定基础,并为广藿香优良品种选育提供参考。

TRV病毒诱导大豆基因沉默体系优化及应用

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术已广泛用于植物基因功能研究,以烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)为载体的沉默体系介导大豆基因沉默效率有待明确,采用无缝克隆技术构建TRV-VIGS沉默体系,探索不同接种方法对大豆靶基因在不同组织间的沉默效率,为大豆基因功能研究提供依据。以八氢番茄红素去饱和酶(phytoene desaturase,GmPDS)及泛素连接酶(GmATL3)基因为靶基因,将含有pTRV1和重组载体菌液采用注射、灌根(agroinoculation)、注射与灌根相结合3种方法分别接种大豆中黄13,接种28 d观察沉默表型现象,并使用RT-qPCR技术检测根部与叶部基因相对表达量,明确不同方法沉默效果。注射接种的大豆叶边缘及叶内出现黄化褪绿,灌根接种与注射加灌根接种的叶片表面出现褪绿斑点及褶皱褪绿表型。RT-qPCR结果表明,3种接种方法对沉默GmPDS效果接近100%;注射接种对GmATL3的沉默效率在叶部为80%-95%,根部为40%-60%;灌根与注射加灌根接种,根部沉默效率为70%-90%,叶部沉默效率为15%-50%。不同接种方法产生不同程度沉默表型,且对不同内源基因沉默效率不同。接种方法对不同组织沉默效率存在差异,注射方法对叶片沉默效率最高,注射加灌根结合的方法对根部沉默效率最高。

油棕病毒诱导的基因沉默体系的建立及优化

为开展油棕油脂代谢调控相关基因鉴定研究,以油棕八氢番茄红素脱氢酶基因(phytoene desaturase gene,PDS)作为报告基因,探索以病毒载体TRV为载体在油棕胚状体上应用病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)的可能性,并对油棕胚状体VIGS体系的相关参数进行优化。结果显示:以EHA105为菌种、侵染菌液OD_(600)=0.5、侵染时间5 min、乙酰丁香酮(AS)质量浓度20 mg/L、共培养48 h、侵染后培养时间为12 d能取得最佳的基因沉默效果。在此基础上,利用优化后的VIGS体系对油棕二酰甘油酰基转移酶基因(diacylglycerol acyltransferase gene,DGAT)进行沉默,取得了预期的基因沉默效果。

基于叶绿素合成关键基因构建马蹄莲佛焰苞离体VIGS技术体系

返青是天南星科观赏植物在发育过程中发生的一种典型的功能叶绿体重新分化形成的生理现象,其中马蹄莲佛焰苞常出现这一现象,但其潜在的调控机制并不明确。为了探究马蹄莲返青的调控机制,提高彩色马蹄莲的观赏品质,本研究以黄色品种Florex Gold为材料,以返青过程中两个叶绿素合成关键基因ZhGluTR和ZhChlH为研究对象,建立病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系,对马蹄莲进行基因功能验证。通过离体佛焰苞孔片试验并对取样部位和侵染时长进行综合分析,结果显示,中部真空抽吸5 min的试验组返青现象出现最迟,VIGS沉默效果最好。在上述沉默背景下,与对照组相比,ZhGluTR和ZhChlH沉默孔片的返青现象均出现得更迟,色调角值上升更缓慢,并且叶绿素含量更低,类胡萝卜素含量更高。综合上述结果表明,本研究建立的VIGS体系可分别有效沉默佛焰苞中的叶绿素合成关键基因ZhGluTR和ZhChlH。研究结果有助于进一步探究马蹄莲佛焰苞返青现象的分子调控机制。

植物基因功能鉴定新工具——病毒诱导基因沉默技术的研究进展

病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术是指带一段靶基因序列的VIGS重组病毒侵染植物、引起植物同源基因沉默与表型变异,进而通过表型变异进行基因功能分析的方法,是近年发展起来的从反向遗传学方向快速鉴定植物基因功能的技术,是转录后基因沉默机制的一种表现。①VIGS的分子机制,涉及基因沉默的起始、维持和信号放大、传播共3个阶段;②VIGS技术、载体与方法学的发展;③VIGS作为基因功能研究的优越性,如不必进行转基因、操作方法简便、获得结果快速等;④应用VIGS对植物抗病途径、代谢与发育调控中参与基因功能进行研究的概况。同时,展望了VIGS技术作为植物功能基因组学功能分析的高通量技术平台的美好前景。

病毒诱导的基因沉默技术及其在植物中的研究进展

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是近年来发现的一种转录后基因沉默现象,是植物抵抗病毒侵染的一种自然机制。现已被开发为快速鉴定植物基因功能的一种反向遗传学新技术。与传统的植物转基因技术相比,VIGS无需构建转基因植株,而且具有操作简便、获得表型快速等优点,目前已广泛应用于与植物抗病、逆境胁迫、细胞信号转导以及生长发育等相关基因功能的研究。该文就VIGS技术的作用机理、主要操作规程、在植物基因功能研究方面的应用以及存在的问题进行综述。

番茄环纹斑点病毒N和NSm基因的VIGS载体构建

【目的】番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot orthotospovirus,TZSV)由传毒介体蓟马以持久增殖型方式传播,且能与其他病毒复合侵染作物,对中国西南地区重要蔬菜的产量和观赏作物的品质造成严重影响,给当地农业生产带来了严重危害。TZSV的N和NSm基因与病毒分类、运动和系统侵染密切相关。本研究通过构建N和NSm基因沉默载体,以期为进一步研究TZSV N和NSm基因在病毒侵染方面的功能提供材料,为抗病育种以及田间绿色防控提供一些依据。【方法】根据TZSV N和NSm基因序列设计特异性引物,利用RT-RCR技术扩增得到TZSV N和NSm基因片段,将扩增得到的目的基因连接到pEASY-Blunt-Zero载体上,含有N和NSm基因序列的pEASY-Blunt-Zero载体和pTRV-pTV00载体用Bam HI和Hind III限制性内切酶进行双酶切,并将酶切产物进行纯化回收,纯化后产物与pTRV-pTV00载体使用T4 DNA连接酶连接,获得pTRV-PTV00-N和pTRV-PTV00-NSm重组载体,将其转入根癌农杆菌GV3101中,并注射到本氏烟和栽培烟K326中,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测病毒N和NSm基因的沉默效率,间接酶联免疫吸附试验(ID-ELISA)检测N和NSm蛋白的含量。【结果】RT-qPCR分析表明,本生烟和栽培烟K326中N和NSm基因在接种TZSV后5 d沉默效率均大于90%。ID-ELISA结果显示,2个蛋白含量在不同时间内均显著下降,其中NSm蛋白含量连续9 d显著下降。【结论】TZSV N和NSm基因沉默载体构建成功,并成功试验于本氏烟和栽培烟K326。通过构建TZSV N和NSm基因沉默载体,为研究TZSV致病机理提供了材料,为田间抗TZSV育种和防控提供了理论依据。

病毒诱导基因沉默技术引入普通生物学实验教学实践

普通生物学实验具有实践性强和操作性强等特点,在大学生物类专业人才培养中占有显著地位。为了能在实验教学中充分锻炼和培养学生的实验操作技能、创新能力和意识,提高教学质量,将当前生物学研究前沿技术--病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)技术引入普通生物学实验教学中。通过实验教学,明显提高了学生的兴趣,培养了学生独立工作能力和创新思维能力,使学生初步具备一定的科研能力和创新能力。

病毒诱导的基因沉默技术在双子叶植物中的应用研究进展

病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)是能够快速鉴定基因功能的反向遗传学重要方法之一,是一种RNA水平转录后的基因沉默现象。因其具有试验周期短、操作方法简单、成本低、效率高、获得表型快以及高通量等优点,被大量运用于植物基因功能研究中。阐述了VIGS技术的作用机制,综述了VIGS技术在茄科、豆科、蔷薇科、葫芦科、锦葵科和菊科等双子叶植物中的应用及存在的问题,对前景进行展望,为进一步拓展VIGS的应用提供参考。

VIGS基因沉默技术在作物基因功能研究中的应用与展望

随着作物基因组测序工作的陆续完成,大量影响作物重要农艺性状的基因功能等待挖掘。由于缺少高效的遗传转化方法,多种作物的基因功能研究进展缓慢。病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术不依赖遗传转化,通过病毒载体接种即可在当代植物体内实现对靶向基因的沉默。VIGS技术因其起效时间快、沉默效率高、操作成本低、便于高通量和应用植物范围广等特点,被越来越多地应用于不同作物基因功能和代谢通路解析的反向遗传学研究中。介绍了VIGS的技术原理及其发展过程,系统归纳了VIGS在不同作物中的应用,总结和讨论了现有VIGS应用的局限性以及影响其沉默效率的几个关键因素,并对VIGS技术在未来植物生物学研究中的应用进行了展望,以期为VIGS技术的进一步应用和发展提供参考。