杆状病毒转移载体的构建及绿色荧光蛋白在斜纹夜蛾幼虫中的表达

为构建斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltMNPV)的重组病毒,以该病毒日本C3株基因组DNA为PCR扩增模板,根据GenBankSpltMNPV中国G2株基因序列,设计了两对引物分别扩增多角体蛋白基因的5′端侧翼序列(含启动子)和3′端侧翼序列(含终止子),将这两个片段依次克隆于pUC18质粒载体后,再将绿色荧光蛋白(GFP)基因亚克隆到上述载体的多角体蛋白基因启动子和终止子之间,获得转移载体pSplt_gfp。将pSplt_gfp与野生型SpltMNPV基因组DNA共转染Spli细胞,通过同源重组和有限稀释法筛选,获得了以gfp基因替代多角体蛋白基因的重组病毒SpltMNPV_gfp。SpltMNPV_gfp感染Spli细胞和斜纹夜蛾幼虫,分别在感染24h和48h后可发现绿色荧光蛋白的表达。该重组病毒的获得,为建立斜纹夜蛾核型多角体病毒表达体系奠定了基础。

人乳头瘤病毒16型和11型L1基因双价重组杆状病毒转移质粒的构建及鉴定

目的 :构建人乳头瘤病毒 16型与 11型 L 1基因双价重组杆状病毒转移质粒并对其进行鉴定。方法 :采用 PCR法从尖锐湿疣组织标本中扩增人乳头瘤病毒 11型晚期基因 L 1,并对其进行克隆测序 ;利用基因重组技术将人乳头瘤病毒 16型和 11型 L 1晚期基因共同装入杆状病毒转移载体中 ,分别位于强启动子 Ppolh和弱启动子 P10之下 ;利用酶切和 PCR技术对双价重组杆状病毒转移质粒进行鉴定。结果 :PCR扩增法获得尖税湿疣组织中感染的人乳头瘤病毒 11型的 L1基因 ,得到人乳头瘤病毒 16型 L1和 11型 L1基因双价重组杆状病毒转移质粒 ,经酶切电泳鉴定验证重组成功。结论 :本研究成功构建了双价重组杆状病毒转移质粒 ,为进一步构建双价 L 1蛋白表达系统进而建立双价基因工程亚单位疫苗打下基础。

新城疫病毒F_(48)E_9株病毒F基因表达盒的火鸡疱疹病毒转移质粒载体构建

将新城疫病毒 (NDV)F4 8E9株融合蛋白 (F)基因 170 0bp克隆到真核表达载体 pcDNA3 中 ,构建成表达F基因的载体 pc3F。然后将包含F基因及其上游的细胞巨化病毒启动子和增强子的 3 80 0bpDNA片段再克隆入包含火鸡疱疹病毒 (HVT)非必须片段载体 pTK2 B中 ,构建成功含有F基因表达盒的HVT转移质粒载体 pTK3 F。经限制性内切酶酶切分析 ,F基因表达盒的插入方向与pTK2 B中TK基因转录方向一致。

携带p53和p21基因腺病毒转移载体的构建

构建携带 p5 3和p2 1基因的重组腺病毒转移载体以研究 p5 3和 p2 1联合基因治疗效果 .将p5 3cDNA克隆到转移载体 pCMV5GFP替代 gfp ,得到 pCMVp5 3 ,使其受到CMV启动子的调控 ;同时将p2 1基因克隆到 pCMVp5 3,得到重组腺病毒转移载体pCMVp5 3/ p2 1.得到携带 p5 3和p2

含口蹄疫病毒VP1基因与结核杆菌HSP70基因的重组腺病毒转移载体的构建

根据GenBank已发表的结核杆菌HSP70的基因序列及O型口蹄疫病毒VP1基因序列,应 甩Primer5．0软件设计了2对引物,其中一对引物用于扩增结核杆菌基因组中的HSP70完整基 因,另一对引物用于以pMD-D为模板,扩增其中的VP1完整基因序列。将所扩增的2段基因串 联插入腺病毒转移载体pAdenovator-CMV5-IRES-GFP的BglⅡ位点,经PCR方法和限制性酶切方法 鉴定2基因已成功插入了转移载体并且插入方向正确,获得了重组腺病毒转移载体pAdenovator- CMV5-IRES-GFP-VP1-HSP,此转移载体可与腺病毒骨架载体进行细菌内同源重组,以产生重组腺 病毒载体。

保守性多巴胺能神经营养因子重组杆状病毒转移载体的构建及鉴定

目的 构建并鉴定小鼠保守性多巴胺能神经营养因子（mCDNF）重组杆状病毒转移载体pFastBacHTb-mCDNF. 方法 应用Trizol法提取小鼠组织总RNA,反转成cDNA,经PCR扩增得到带有预定酶切位点（BamH Ⅰ、Xho Ⅰ）的mCDNF基因全长（564 bp）,回收片段并克隆至pGEM-T载体,测序验证PCR结果的准确性.将mCDNF定向克隆到pFastBacHTb载体,构建含有mCDNF基因的重组质粒pFastBacHTb-mCDNF,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,摇菌抽取质粒进行测序和双酶切鉴定. 结果 RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示得到预定大小的目的 条带（564 bp）,mCDNF的T-A克隆经蓝白斑抗性筛选获得阳性克隆,PCR及测序均提示pGEM-T-CDNF载体成功构建.重组质粒pGEM-T-mCDNF和pFastBacHTb载体进行BamH Ⅰ、Xho Ⅰ限制性内切酶酶切后再连接,得到pFastBacHTb-mCDNF重组质粒,并经PCR、酶切及测序验证无误. 结论 本实验成功构建了mCDNF重组杆状病毒转移载体pFastBacHTb-mCDNF,为该营养因子的进一步研究奠定了一定基础.

人类免疫缺陷病毒整合酶链转移抑制新药——卡波拉韦及其复方长效注射液

人类免疫缺陷病毒(HIV)是侵袭人体免疫系统的病原体,严重危害人类健康和生命安全。HIV感染引起获得性免疫缺陷综合征(AIDS),简称艾滋病,仍然是全球主要的公共卫生问题。据世界卫生组织(WHO)在2020年世界艾滋病日前夕发布的公告指出:自1981年确认艾滋病的病原体HIV,迄今,已经夺走了近3300万人的生命。国际社会为应对艾滋病作出了协调一致的努力,服务范围不断扩大。全世界医药工作者经过几十年的努力,潜心研究,已获得6大类抗HIV新药,近50多种有效的治疗感染HIV新药的单方或复方制剂,有利于开展鸡尾酒疗法,即“高效抗逆转录病毒治疗”。随着获得有效的预防、诊断、治疗和护理HIV感染及其伴随的机会感染的措施越来越多,艾滋病毒感染已从一种致死性疾病转变为可控、可治的慢性传染性疾病,使HIV携带者能够过上长寿健康的生活。据WHO报告,截至2019年底,估计全球还有3800万人感染HIV。在2014年,联合国艾滋病联合规划署(UNAIDS)提出“2030年终结艾滋病”的愿景。该领域仍存在着巨大的未获满足的医疗需求,包括降低服药负担、提高治疗依从性、减少耐药突变等。目前,离实现全球终结HIV感染的愿景尚有一段较长的距离,顺应UNAIDS的号召,仍需要全世界各国领导者、医药科技工作者和各行各业的有识之士为实现此项远大的愿景,各尽所能地付出应有的贡献,特别是从事疫苗研发的医药研究学者,虽然历经过多方面的努力,进行了大量的试验研究工作,但至今仍未能取得突破性的进展。从事新药研发的学者在既往取得成绩的基础上,继续深入研究,在已开发高效低毒的新类型抗逆转录病毒(ARV)药物中,应着眼于长效、低耐药性和价廉的抗HIV新品种,使广大患者减少用药量,减轻经济负担。在已开发的6大类新药中,HIV整合酶链转移抑制药是最有潜力的品种之一,人体细胞中无相应的整合酶,其抑制药在HIV复制过程中,能阻断催化病毒DNA与宿主染色体DNA的整合,减轻新药研发的干扰,成为抑制HIV的新靶点。截至2020年底已批准上市4个品种,单药使用疗效不佳,易产生耐药性,若与核苷或非核苷类逆转酶抑制药及蛋白酶抑制药组成多种复方制剂,可发挥强有力抗HIV活性新药。由英国葛兰素史克公司控股,美国辉瑞大药厂和日本盐野义制药公司持股的ViiV医疗保健公司是一家专门从事抗HIV/AIDS新药研发的公司,近期推出HIV整合酶抑制药卡波拉韦(cabotegravir,CAV)及其与美国强生制药公司的非核苷类逆转录酶抑制药利匹韦林(rilpivirine,RPV)组合成为长效复方制剂。每月或隔月肌内注射一次CAV与RPV混悬缓释注射液,能达到长效抑制HIV复制的疗效。2019年7月3日和2019年7月30日ViiV医疗保健公司分别向美国食品药品监督管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)提出每月注射一次的复方新药上市申请(NDA)。2020年1月10日该公司收到FDA长效复方制剂的完整回复函,2020年11月18日ViiV公司获得FDA突破性治疗的指定,给以优先评审的待遇。2020年10月21日欧洲、中东、非洲三地区(EMEA)的人用药品委员会(CHMP)对于复方长效制剂给予积极评价,建议批准上市。2021年1月13日和2021年1月21日,首个长效注射治疗HIV新药分别被美国和欧盟批准上市。商品名均为Vocabria。该复方新制剂预防HIV感染的活性比恩曲他滨(FTC)与替诺福韦二吡呋酯(TDF)的复方抑制剂(商品名Truvada)的有效性高89%,95%CI(68,96)%。此前,加拿大卫生厅于2020年9月9日首先批准长效复方注射液上市。2021年2月24日,ViiV医疗保健公司向美国FDA提交补充新药申请(sNDA),要求扩大卡波拉韦长效复方制剂的使用范围,允许隔月一次,肌内注射CAB复方制剂,以稳定的方案治疗成年人HIV感染。何时批准上市尚待定。该文对人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)整合酶链转移新抑制药——卡波拉韦(cabotegravir)及其长效复方缓释肌内注射液的非临床和临床药理毒理学、临床研究、不良反应、适应证、剂量与用法、用药注意事项及知识产权状态和国内外研究进展等进行介绍。

昆虫杆状病毒基因转移与表达系统在海洋动物中的应用进展

昆虫杆状病毒介导的基因转移与表达系统是基于Tn7转座酶的转座原理而设计的一种基因转移与表达技术,因其安全性能好、重组蛋白表达量高和表达产物可进行翻译后加工等优点,目前已在哺乳动物、鸟类、昆虫与淡水鱼类等动物中得到广泛应用,但是其在海洋动物中的应用还不多。本文对昆虫杆状病毒介导的基因转移与表达技术在海洋脊椎和无脊椎动物中的应用进行了综述与展望。

病毒介导的基因转移技术在海洋无脊椎动物中的研究进展

病毒介导的基因转移技术是利用携带外源目的基因的病毒载体、1个或多个包装载体以及包装细胞,模拟病毒的侵染和转移行为,实现将外源目的基因导入宿主细胞的基因转移技术。目前,已建立的比较成熟的病毒基因转移系统包括逆转录病毒、腺病毒、杆状病毒、腺相关病毒和慢病毒系统。这些病毒基因转移系统已在哺乳动物、鸟类和昆虫细胞上得到广泛应用,前三种病毒基因转移系统在海洋脊椎动物鱼类中也已得到很好的应用,而在海洋无脊椎动物中,仅能见到逆转录病毒和杆状病毒基因转移系统的应用报道。本文综述了逆转录病毒和杆状病毒介导的基因转移技术在海洋无脊椎动物中的研究进展,并对其应用前景进行了展望。

汉坦病毒G2糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其在免疫诊断中的应用

目的构建汉坦病毒(HV)Z10株包膜糖蛋白G2基因的重组表达载体,探索其在昆虫细胞中的表达及在免疫荧光诊断中的应用。方法以质粒pUCmZ10M为模板设计引物,用聚合酶链反应(PCR)扩增Z10株G2基因片段,将G2片段克隆入pUCmT质粒载体,碱法提取质粒pUCmZ10G2,酶切后将回收片段插入杆状病毒转移载体pFastBacHTa,构建重组体pFastBacHTaZ10G2,重组体转化感受态细胞E.coliDH10Bac后,经2轮筛选,提取重组质粒转染昆虫细胞sf9,并用间接免疫荧光技术检测表达的G2蛋白。结果获得含有编码HVZ10株的包膜糖蛋白G2基因的重组质粒,转染昆虫细胞表达出G2蛋白,与肾综合征出血热(HFRS)阳性血清反应,昆虫细胞内呈现特异性环状荧光。检测40份HFRS血清,与全病毒细胞抗原片的符合率为95%。结论成功构建HVZ10株包膜糖蛋白G2基因的表达载体,并在昆虫细胞中表达。可利用重组G2蛋白检测HV感染。

表达NDV F48E9株F基因的MDV CVI988株转移质粒载体的构建

将新城疫病毒(NDV)F48E9株融合蛋白(F)基因1700bp克隆到真核表达载体pIRES中,构建成表达F基因的载体pIRESF,然后将包含F基因及其上游的内含子和下游的polyA的2900bpDNA片段再克隆入包含gB启动子的SK载体中,并使其克隆到gB启动子600bp的下游,最后将包含gB启动子和F基因表达盒3500bp克隆到包含MDVCVI988非必须片段US10的载体SK中。该研究为进一步在细胞中转染并获得表达F基因的MDVCVI988重组病毒奠定了基础。

逆转录病毒介导的牛生长激素基因转染NIH3T3细胞和人胚肺成纤维细胞

目的:以牛生长激素(bGH)为模型,建立逆转录病毒载体转移系统,体外转染鼠成纤维细胞株NIH3T3和人胚肺成纤维细胞2BS,以获得bGH表达。方法:将PCR扩增的bGH基因片段插入逆转录病毒载体pSXLG-MDR相应酶切位点,获得的重组逆转录病毒质粒。应用脂质体方法转染重组质粒进入包装细胞PA317,筛选长春新碱抗性克隆株,收集上清液感染NIH3T3细胞和人胚肺成纤维细胞2BS,筛选携带bGH基因的成纤维细胞的克隆株3T3/bGH和2BS/bGH。结果:RT-PCR分析表明基因转染组的3T3/bGH细胞和2BS/bGH细胞在相当于680bp处有一清晰的条带,而空质粒对照组无相应条带出现。RIA分析表明转染基因细胞的培养液及胞浆蛋白有bGH蛋白表达,而作为对照的3T3/mdr细胞和NIH/3T3细胞均无此蛋白表达。结论:应用逆转录病毒IRBS载体系统转染bGH基因进入成纤维细胞,该系统易筛选,转染效率较高。

含NDV F48E9株F基因的MDV CVI988株转移质粒载体的真核表达

为进一步提高重组病毒的表达水平,用构建的含gB启动子和NDV F48E9株F基因的MDV CVI988株转移质粒载体pUS10F转染293T细胞,通过PCR和接免疫荧光(IFA)法研究了其在真核中的表达,并确定最佳的转染条件。结果表明,真核细胞中带有F基因,转移质粒载体已经进入细胞DNA;转染转移质粒载体 pUS10F后的293 T细胞所表达的NDV F基因产物抗原性较好,能够与抗NDV的标准血清反应。确定的最佳转染条件为:DNA 3μg／mL,转染后48 h外源基因在细胞中的表达量最高,在6孔板和96孔板中细胞数量分别以 2×105／孔和1×101／孔的转染效果最好。

狂犬病病毒核蛋白在Bac—To—Bac／AcMNPV杆状病毒系统的表达

为真核表达狂犬病病毒的核蛋白，本研究通过RT-PCR克隆狂犬病病毒ERA株核蛋白基因．将其克隆于杆状病毒转移载体pFastBacHTB中，构建重组质粒pFastBacHTB-NP并将其转化DH10Bac细胞，得到重组穿梭质粒reBacmid—NP；通过转染昆虫细胞sf9包装重组杆状病毒。

A型流感病毒PB1-F2蛋白的原核表达、纯化及鉴定

对A型流感病毒PB1-F2蛋白进行了原核表达及纯化,获得了谷胱甘肽硫转移酶(GST)-PB1-F2融合蛋白,以用于研究流感病毒PB1-F2蛋白的功能及分子作用机制。以RT-PCR方法扩增PB1-F2基因,将其克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上。重组质粒pGEX-6P-1-PB1-F2转化大肠杆菌(Es-cherichia coli)菌株BL21,并诱导表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot试验鉴定。结果显示,大肠杆菌细胞经诱导,表达出了相对分子量约为36kDa的蛋白,与GST-PB1-F2融合蛋白大小相符;Western blot鉴定显示,该融合蛋白能够被抗GST的抗体特异性识别。试验在大肠杆菌表达系统中成功表达纯化了GST-PB1-F2融合蛋白,为深入研究PB1-F2蛋白的功能奠定了基础。

TNF-α基因转染增强树突细胞迁移及CCR7受体表达

为探讨腺病毒介导肿瘤坏死因子 - α(TNF- α)基因转染诱导树突细胞 (DCs)趋化因子受体差异性表达 ,分别用 10 0 MOI的 Ad V- TNF- α和 Ad V- p L p A (无外源基因插入 )感染小鼠树突细胞 (m DCs) ,经流式细胞仪检测细胞表型变化 ,RNA酶保护实验检测其趋化因子受体表达 ,体内、体外细胞趋化试验分析比较其迁移差异。发现 Ad V- TNF-α感染 m DCs后 CD11b、CD40、CD86 ,ICAM- 1以及 CCR7受体表达较对照组明显增高 ,CCR2受体表达量却下调 ;体外细胞趋化试验表明 DCTNF -α对 MIP- 3β(CCR7配体 )迁移应答增强 ,体内细胞趋化试验显示 DCTNF-α淋巴结趋化迁移效率较空白对照组和 Ad V- p L p A感染组分别增高 7倍和 3倍。提示 :Ad V- TNF- α感染促使 m DCs成熟 。

Studies of Hepatitis B Virus-Specific Transfer Factor reparation

制备一种乙型肝炎病毒特异性转移因子制剂 (HBV STF) ,为临床应用提供有价值的实验依据。从人HBsAg阳性胎盘中制备了HBV STF ,并对其理化性质、免疫学活性进行了检测和初步的临床试用。每批样品经无菌试验、热原质检查、动物安全性试验等均符合药典要求。本品最大紫外吸收光谱在 2 5 6± 2nm处 ,E2 60nm/E2 80nm比值大于 2 7。其水解氨基酸含 17种。对人T淋巴细胞E受体的激活试验结果显示 ,HBV STF的Ea RFc平均增高率在 83 47%～ 10 3 48%之间 ,抗原特异性皮肤试验表明HBV STF能刺激小鼠体内T淋巴细胞增殖 ,诱导小鼠跖趾部皮肤的迟发性变态反应。对HBV STF的初步临床试用也取得明显效果 ,显示HBV STF是一种可用于治疗乙肝的安全。

乙肝病毒特异性转移因子治疗慢性乙型肝炎的临床研究

目的 评价乙肝病毒特异性转移因子治疗慢性乙型肝炎的临床疗效。方法 选择慢性乙型肝炎 86例 ,随机分为两组。对照组 40例 ,应用常规保肝降酶疗法 ;研究组 46例 ,在保肝降酶疗法的基础上加用乙肝病毒特异性转移因子。结果 研究组HBeAg及HBVDNA的阴转率显著高于对照组 (P <0 0 5 ) ,抗 HBe阳转率亦显著高于对照组 (P <0 0 1)。结论 乙肝病毒特异性转移因子用于治疗慢性乙型肝炎 ,可以改善患者的乙肝病毒病原学指标。

宫颈癌组织中HLA-Ⅰ缺失与HPV16、18感染的相关性研究(英文)

目的 探讨宫颈癌与人类组织相容性抗原 (HLA)表达缺失和人乳头瘤病毒 (HPV) 16、18感染的关系。方法 采用免疫组织化学S -P法检测特异性鼠抗人HLAⅠ类分子单克隆抗体及HPV16、18E6蛋白在宫颈癌组织中表达情况。结果 6 2例宫颈癌组织中有 4 2例HLAⅠ抗原呈阳性表达 ,2 0例呈阴性表达 ,阴性表达率 32 .3%。有 4 4例HPV16、18E6呈阳性表达 ,阳性率 70 .9% (4 4 / 6 2 )。在HPV16、18E6阳性表达组织中其HLAⅠ抗原缺失明显增加。HLAⅠ抗原阳性表达组织中CD3+ T细胞和CD8+ T细胞数量明显多于HLAⅠ抗原阴性表达组织 ,肿瘤恶性程度及淋巴结转移与HLAⅠ抗原下调有关。结论 宫颈癌组织存在HLAⅠ抗原部分缺失与HPV16、18感染密切相关。HLAⅠ抗原部分缺失 ,形成了免疫逃逸导致了肿瘤细胞的发生、发展、浸润、转移。