动态光散射法测定病毒载体基因治疗产品的平均粒径及粒径分布

目的:建立病毒载体基因产品的粒径及分布的测定方法。方法:采用马尔文Zetasizer Nano ZS型纳米粒度仪,以氯化钠注射液作为稀释剂对样品进行适当稀释后,用手动测量方式进行测定。结果:测定的60 nm标准纳米粒子平均粒径为61.24±0.68nm,多分散指数(polydispersity index,PDI)为0.020±0.012 nm。重组人新型P53腺病毒注射液测定6次,平均粒径为122.42±1.80 nm,相对标准偏差(RSD)为1.4%;PDI值为0.056±0.014 nm,RSD为25.1%。重组人新型P53腺病毒注射液于37℃存放时,平均粒径和PDI值随时间延长有显著增加。至28天时,平均粒径增加到130.50,PDI值增加到0.265。结论:动态光散射法快速、简便、准确,可用于病毒载体基因治疗产品的粒径及分布的检测。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(二)

二、适用范围本指导原则中的rAAV载体是指基于腺相关病毒的结构和理化特性,经设计和重组改造所形成的用于携带外源目的基因(或核酸片段)的病毒载体。本指导原则主要针对应用于体内基因治疗的rAAV载体类产品在申报临床试验时应完成和提交的药学研究信息提出建议。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(一)

一、前言体内基因治疗产品一般选用适当的载体或转染方式将外源基因(或基因编辑工具)导入人体,通过替代、补偿、阻断、修正特定基因以达到治疗疾病的目的。重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体因其理化性质稳定、致病性弱、整合风险低、外源基因表达持久等结构和生物学方面的优势,已成为体内基因治疗领域研究、应用最为广泛的载体之一。

重组腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则(三)

三、一般原则临床试验申报阶段,rAAV载体类产品可参考《中国药典》的相关要求(尤其是“人用基因治疗制品总论”的要求),结合申报阶段的特点,制定合理的药学研究计划和质量控制策略。临床试验用药品应按照“《药品生产质量管理规范(2010年修订)》临床试验用药品附录”(2022年第43号)的相关要求进行生产。临床试验用药品的研发、生产、使用和废弃处理应符合生物安全相关法律法规的要求。

基于病毒载体的神经病理性疼痛靶向基因治疗

神经病理性疼痛(neuropathic pain,NP)是由躯体感觉系统的损害或疾病导致的疼痛,严重影响病人的生理和心理健康。但目前的治疗效果往往并不理想。基因治疗是一种新兴的治疗策略,在诸多研究中已经证实病毒载体介导的基因治疗能够缓解NP。因此,本文根据NP的病理生理机制作为理论依据,讨论了基于病毒载体缓解NP的基因治疗,并对不同靶点的基因治疗进行归纳。对未来NP的研究方向提供了有益的参考和治疗思路。

2型腺伴随病毒基因治疗载体的构建

目的 构建一种适用于中枢神经系统疾病的基因治疗载体。方法 以野生型 2型腺伴随病毒 (AAV 2 )质粒pssv9int 及逆转录病毒载体质粒plxsn为基本元件 ,利用重组DNA技术 ,构建了一种通用型AAV载体质粒pssHG Neo。结果 该质粒除含有必备的原核细胞复制子及Ampr 筛选基因外 ,还含有真核细胞筛选基因———Neor 及供插入目的基因的多克隆位点 (MCS) ,在MCS的上游为逆转录病毒的长末端重复序列 (5’LTR) ,具有启动子的功能 ,启动定向插入到MCS的外源目的基因。质粒中的AAV反向末端重复序列 (ITR)具有定点整合于人基因组 1 9号染色体S1位点的特点。

重组腺相关病毒:很有潜力的基因治疗载体

腺相关病毒(AAV)是细小病毒家族的一员,为无包膜的线性单链DNA病毒.由于AAV具有长期潜伏于人体而不具有任何明显致病性等优点,人们对AAV作为一种理想的基因治疗载体给予了很大期望.但是,近来发现,这类载体在应用上有许多明显的缺陷,包括某些细胞膜上病毒受体数量极少,重组AAV载体位点特异性整合不足,AAV衣壳成分和转基因产物引起宿主的免疫反应等等.这些缺陷促使人们加大对AAV生物学特性和转染过程的研究,从而更好地对AAV载体进行改进,使新一代重组AAV载体具备基因治疗所必需的安全性、高效性和靶向性,以期更广泛地应用于临床.

病毒载体与造血干细胞基因治疗

多种获得性和遗传性疾病累及造血细胞。造血干细胞是人类基因治疗的重要靶细胞。成功的造血干细胞基因治疗不仅需要高效基因转移 ,还需要治疗基因的长期、高水平表达。反转录病毒载体是造血干细胞基因治疗的常用载体 ,结合优化的造血干细胞转导条件 ,其介导的腺苷脱氨酶缺陷引起的严重联合免疫缺陷和X染色体连锁的严重联合免疫缺陷的基因治疗已经获得初步成功 ;其他整合型病毒载体如慢病毒和腺相关病毒载体 ,也在临床前造血干细胞基因治疗研究中得到广泛应用。从病毒载体。

慢病毒载体在肿瘤基因治疗中的应用

载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。目前常用的有病毒载体和非病毒载体两类,病毒载体由于转导效率较高且可以用于体内和体外的基因转导,是目前基因治疗研究和临床应用的主要工具,包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体等。慢病毒载体是近来受到广泛注意的一种逆转录病毒载体,由于具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点,适于体内基因治疗,因此有望成为理想的基因转移载体。本文以HIV-1为代表对慢病毒载体构建,结构优化及其在肿瘤基因治疗中的应用作一综述。

腺病毒载体纯化及在肿瘤基因治疗中的应用

腺病毒是一种线性无包膜的双链DNA病毒,用于载体构建的主要是人类2型和5型腺病毒。现在通过对腺病毒的改造,已经成功构建出第一代、第二代、第三代和条件复制型腺病毒载体。随着腺病毒载体在蛋白质表达中的广泛使用,对高产量、高纯度腺病毒载体的需求量逐渐增大,因此近年来在传统纯化腺病毒载体的基础上发展出各种纯化新方法。同时,由于腺病毒载体自身的一些优点,使其在疫苗和肿瘤基因治疗中也得到了较为广泛的应用。

慢病毒载体的改进为基因治疗带来了新的希望

基因治疗被认为是治愈疾病的最佳方式,但是本世纪初一系列不良事件发生,使基因治疗一度受挫。通过几年来研究和改进,慢病毒以其高转染率、靶细胞中稳定的表达和良好的安全性,为基因治疗又带来了新的曙光。目前慢病毒载体在HIV感染、地中海贫血、X连锁的肾上腺脑白质营养不良等疾病中已开展了相关的临床试验,获得了一定的治疗效应,尚未观察到严重的与基因治疗相关的不良事件。初步取得的成果使基因治疗再次成为人们关注的热点。本文就基因治疗为何受阻于病毒载体问题,慢病毒载体的高效安全特征和慢病毒载体的制备问题进行了综述。

腺相关病毒基因治疗载体的改良与应用

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的非致病特性使得以其为基础的重组病毒载体具有卓越的安全性,成为在基因治疗中最富吸引力的候选载体之一,并且在多种疾病的临床治疗中广泛应用。在过去的十余年中,随着分子病毒学领域对AAV基础研究的进展,研究者不断地为重组腺相关病毒的生产和改良提供新的思路和方案,以改善其对宿主或靶向细胞的感染选择性和转导效率,其中相当部分已逐渐向临床试验阶段过渡。本综述将在介绍AAV基本生物学特征的同时,结合一些实验室研究的成功案例,重点讨论AAV的改良策略、实施方案与应用特点,并对当前以AAV为载体的基因治疗的全球现状及其所面临的挑战与前景进行分析和探讨。

基因治疗病毒载体的研究进展

基因转移载体是基因治疗的重要组成部分,包括病毒载体和非病毒载体。目前应用的病毒载体主要有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体等。不同的病毒载体各有利弊。随着对病毒载体的不断改造完善,提高其基因转移效率和安全性,病毒载体将在基因治疗中继续发挥重要作用。

肿瘤基因治疗中腺病毒载体改造热点

腺病毒以其具有的诸多优点被广泛应用于肿瘤基因治疗中.但由于腺病毒载体在体内存在感染效率低、免疫原性强等缺点,限制了其在临床中的作用.为了解决这些问题,研究人员制定了一系列改造腺病毒载体的策略.如通过对纤毛蛋白的改造来增强腺病毒载体感染肿瘤细胞的能力;对六邻体蛋白的改造和对病毒衣壳进行聚乙二醇化处理使得腺病毒载体能够逃逸人体的免疫识别.此外,为了增强腺病毒载体对肿瘤细胞的靶向性和杀伤效力,人们也对病毒载体的基因组进行了富有成效的改造.值得注意的是,肿瘤趋向性细胞载体的研究,为腺病毒介导的肿瘤基因治疗系统提供了一种全新的策略.因此,如何能有机地结合多项改造策略,最大限度地提高腺病毒载体在今后临床应用中的高效性、安全性将是未来研究的重点.本文针对最近肿瘤基因治疗中腺病毒载体改造取得的一些进展做一概述和讨论.

慢病毒载体及其介导的RNA干扰在基因治疗中的应用研究

主要就慢病毒载体及其介导的RNA干扰技术在基因治疗中的应用研究进行了综述,并对其在该领域具有的广阔前景进行了展望.慢病毒载体作为一种新型的载体,可有效地将携带的目的基因导入宿主细胞,并将其整合到宿主细胞基因组中,从而使目的基因得以持久稳定地表达.该载体因具有高感染性、高表达效率及不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为基因治疗研究中的一个重要工具.RNA干扰技术可以特异性抑制或关闭特定基因的表达,因此该技术可广泛应用在基因功能探究和恶性肿瘤治疗等领域.由慢病毒载体介导的RNA干扰技术能持久、稳定、特异性地抑制各类细胞中特定基因的表达,在病毒感染、肿瘤等疾病的基因治疗中被广泛应用,成为生物医学领域的新热点.

杆状病毒作为基因治疗载体的研究进展

杆状病毒是昆虫专一性的病原病毒 .近来的研究表明杆状病毒能进入哺乳动物细胞 ,但病毒自身不能在哺乳动物细胞中复制 ,感染也不引起细胞病变 .另外 ,已经证明杆状病毒能在体外或体内高效地转导许多类型哺乳动物细胞 ,并且能得到固定表达细胞系 ,显示了杆状病毒作为基因治疗载体有着良好的应用前景 .

基因治疗原发性高血压的新途径:内皮型一氧化氮合成酶CDNA腺病毒载体在人胎肾293细胞的表达

研究内皮型一氧化氮合成酶（endothelialnitric oxide synthase,eNOS)CDNA 腺病毒载体 PadRSVeNOSCDNA 导入在人胎肾 293细胞 ( )中的表达。方法:大量制备及纯化质粒 eNOSCDNA ,将纯化eNOSCDNA 载体通过脂质体转染 293细胞48h 后,应用化学比色法测定293细胞提取物NOS 活性。结果:被转染 293细胞 NOS活性显著提高于未转染293细胞 NOS 活性犤( 0.62±0.03),(0.093±0.01)kU /L,P <0.001犦。结论:PA dRSVeNOSCDNA 导入人胎肾 293细胞是一种能使 NOS 活性显著升高的方法,为基因治疗原发性高血压及肾脏血管性疾病研究提供一条新的途径。

Hochest染料-荧光分光光度法测定基因治疗非病毒载体中DNA的含量

目的 利用荧光染料Hoechst 332 5 8与DNA结合后 ,荧光强度显著增强的特点 ,建立了基因治疗非病毒载体中DNA的含量测定方法。方法 对Hoechst 332 5 8-DNA溶液进行荧光扫描 ,并建立了标准曲线。分别测定了纳米粒胶体溶液超速冷冻离心后的上清液和用酶消化后的脂质体提取液中DNA的含量。结果 Hoechst332 5 8-DNA溶液的最佳激发波长为 35 3.6nm ,最佳发射波长为 4 5 4 .4nm ,标准曲线的线性范围为 0 .2～ 1.0 μg·ml-1。测得包载DNA纳米粒的平均包封率为 75 .1%± 8.6 %(n =5 ) ,DNA阳离子脂质体的平均抗核酸酶能力为 84 .9%± 7.8% (n =5 )。结论 荧光染料Hoechst332 5 8可用于测定基因治疗非病毒载体中DNA的含量 ,所建立的荧光分光光度法为载基因纳米粒、脂质体制备工艺和质量标准的建立提供了依据。

基因治疗的病毒载体系统

病毒载体是基因治疗中应用最为广泛的载体系统。该文就RNA病毒载体、DNA病毒载体和杂合病毒载体的生物学特性、基因组特点以及其在基因治疗中的优缺点进行综述,并对病毒载体系统的发展前景进行了展望。

腺病毒载体介导CEA基因元件调控自杀基因治疗

构建以ＣＥＡ启动子控制ＨＳＶＴＫ基因表达的复制缺陷型腺病毒载体（ＡｄＣＥＡＴＫ）．纯化的重组腺病毒滴度达１×１０１２ｐｆｕ／ｍｌ．ＣＥＡ阴性的ＨｅＬａ细胞感染ＡｄＣＭＶＴＫ后对丙氧鸟苷（ＧＣＶ）很敏感，而感染了ＡｄＣＥＡＴＫ后不被ＧＣＶ杀伤．与此相反ＣＥＡ阳性的ＬｏＶｏ细胞中ＡｄＣＭＶＴＫ和ＡｄＣＥＡＴＫ都有很好的表达活性，说明ＣＥＡ启动子有良好的细胞专一性．ＡｄＣＥＡＴＫ／ＧＣＶ系统还有明显的旁杀伤效应．此载体将有助于实现对ＣＥＡ阳性肿瘤的专一性自杀基因治疗．