基于qRT-PCR方法的三价轮状病毒重配疫苗效力试验中平行线模型的建立

目的建立基于定量逆转录聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法的三价轮状病毒重配疫苗效力试验的平行线模型,通过平行线模型建立试验有效性的验证方法以及疫苗相对效力和效力计算方法。方法系列稀释三价轮状病毒重配疫苗,在Vero细胞中轮状病毒增值到达平台期后,通过qRT-PCR方法检测不同接种剂量下mRNA的反应量(Ct值),以Ct值和剂量的对数建立平行线模型,随后对平行线模型进行方差分析(ANOVA)验证回归有效性以及平行性有效性进而验证试验有效性,有效性验证通过后计算相对效力和效力。结果对试生产中一个批次三价轮状病毒重配疫苗中G2、G3和G4型组分分别建立的平行线模型,G2型数据无异常值,G3型和G4型各检出一个异常值,剔除异常值后重新建立模型,分析平行线模型回归和平行性验证有效。试验有效性验证完成后计算相对效力和效力,各型相对效力分别为:G2:1.2(0.89~1.67),G3:7.1(4.49~11.74)和G4:3.5(2.49~5.07);效力分别为6.0(5.85~6.12)UI/mL,7.0(6.85~7.27)UI/mL和6.7(6.60~6.90)UI/mL。依据各型效力计算该批三价轮状病毒重配疫苗试产品总效力7.3 UI/mL。结论成功建立了三价轮状病毒重配疫苗效力试验的平行线模型,以此确立了三价轮状病毒重配疫苗相对效力和效力的计算方法以及试验有效性验证方法。

三种流感病毒重配而成的猪流感病毒所致的人类宿主感染

有假说认为，猪是禽类、人类以及猪流感病毒发生重配的混合器，它在形成能造成人类宿主广泛流行的新型流感病毒方面具有重要作用。近来发生在墨西哥、美国以及其它地区的猪源性甲型H1N1流感病毒的广泛传播就强调了这种重配病毒对世界公共卫生体系的破坏力。在1930年到1990年间，在猪群里流行的猪流感病毒主要是经典的甲型H1NI猪流感病毒，一直保持相对稳定。

三类流感病毒重配而成的猪流感病毒所致的人类宿主感染

有假说认为，猪是禽类、人类以及猪流感病毒发生重配的混合器，它在形成能造成人类宿主广泛流行的新型流感病毒方面具有重要作用。近来发生在墨西哥、美国以及其它地区的猪源性甲型H1N1流感病毒的广泛传播就强调了这种重配病毒对世界公共卫生体系的破坏力。在1930年到1990年间，在猪群里流行的猪流感病毒主要是经典的甲型H1N1猪流感病毒，一直保持相对稳定。

荧光灶试验和TCID_(50)-ELISA方法在Ⅲ价轮状病毒重配疫苗感染滴度测定中的对比研究

目的:对比荧光灶试验和TCID50-ELISA方法测定III价轮状病毒基因重配疫苗感染滴度的精确性,重复性和可行性。方法:同时采用TCID50-ELISA方法和荧光灶试验方法测定Ⅲ价轮状病毒基因重配疫苗的感染滴度,对测定结果进行比较分析。结果与结论:在Ⅲ价轮状病毒基因重配疫苗的感染滴度测定中,荧光灶试验方法和TCID50-ELISA方法各有其特点,荧光灶试验方法更加精确和快速,相对于TCID50-ELISA方法,具有更低的变异性,即其重复性较高;而TCID50-ELISA方法受主观因素的影响较低。

生物反应器培养轮状病毒基因重配株Ls条件的优化

目的轮状病毒基因重配株Ls(G3型)在生物反应器微载体培养Vero细胞条件的优化。方法采用3 L生物反应器微载体培养Vero细胞,观察Ls株在不同病毒感染复数(0.001、0.002、0.010、0.040 MOI)、不同温度(34.5℃和35.5℃)、不同病毒收获时间(24和48 h)对病毒增殖的影响。根据病毒滴度和收获量筛选出最适MOI、培养温度及病毒的收获时间。结果以0.002 MOI接种Vero细胞,温度为34.5℃培养病毒,滴度最高达7.50 lg CCID50/m L;48 h可连续收获4次病毒液,且收获总量及病毒滴度均高于24 h。结论通过对Ls株在生物反应器微载体Vero细胞培养条件的优化,获得的病毒液滴度高及连续培养多次收获量增加的有效方法,为进一步规模化培养奠定了基础。

从cDNA感染性克隆产生冷适应重配A型人流感病毒及免疫原性的初步研究

目的从cDNA感染性克隆产生冷适应重配A型人流感病毒株,并对其生物学特性和免疫原性进行初步测定。方法采用RT-PCR技术,分别扩增2006至2007年疫苗株A/New Caledonia/20/99的HA、NA全长基因片段,构建转录表达双向载体pMDV-A-HA、pMDV-A-NA,将这2个质粒与冷适应拯救系统的6个质粒共转染COS-1细胞,并对拯救的重配病毒的生物学特性和免疫原性进行初步鉴定。结果拯救出具有冷适应表型和温度敏感型的A型人流感弱毒株,初步测定了重配病毒的生物学特性和免疫原性。结论成功拯救具有冷适应和温度敏感表型的A型人流感弱毒株,并初步测定其免疫原性,为我国弱毒疫苗株的拯救和弱毒疫苗的发展奠定了基础。

轮状病毒基因重配LH9株(G4型)传代稳定性研究

对兰州生物制品研究所自行构建的轮状病毒基因重配株G4型LH9株在Vero细胞中传代的稳定性进行研究。将基因重配LH9毒株接种于Vero细胞上从7代传至17代,经电镜检查、病毒滴度测定、病毒基因组RNA电泳图谱分析、基因序列测定分析、轮状病毒型别鉴定及其它相关检定,结果均符合药典要求。证实该毒株为A群G4P〔12〕型轮状病毒,在Vero细胞传代中具有良好的稳定性,为疫苗研制提供安全有效的依据。

四价恒河猴-人重配轮状病毒疫苗免疫接种研究

人轮状病毒是世界范围内2岁以下幼儿腹泻和死亡的最主要病原体。本文介绍了四价恒河猴-人重配轮状病毒疫苗的研究进展。

携带H1N1 pdm09基因的重配猪流感病毒分子流行特征研究进展

在2009年甲型H1N1流感(H1N1 pdm09)大流行暴发初期,该病毒就已经成功地潜入到了猪群当中,继而参与到了猪流感病毒(SIV)的进化过程,通过不断地重配和适应,促进了新型SIV变异毒株的产生。目前,世界各地的猪群中普遍流行着携带有H1N1 pdm09基因片段的新型SIV,其重配形式呈现多样化。值得一提的是,由于H1N1 pdm09毒株的内部基因具有广泛的基因相容性,不同亚型、不同谱系的人源流感病毒、禽源流感病毒和本地猪流感病毒更倾向与它们优先发生重组。重配后的子代病毒较亲本毒株容易获得选择优势,能够在猪群中建立稳定的遗传谱系。研究发现H1N1 pdm09部分独特的内部基因片段在其高效的人际间传播过程中发挥着决定性的作用。一旦这类新型SIV成功突破种间屏障,获得适应新的哺乳动物的能力,将会对人类健康造成潜在的威胁。论文综述了携带有H1N1 pdm09基因的新型重配SIV的分子流行情况,特别就H1N1 pdm09内部基因与重组病毒致病性、传播能力等相关的分子基础进行了系统地综述,为防控新型SIV的暴发和保障公共卫生安全提供依据。

犬流感病毒的研究进展

犬流感(CI)是由犬流感病毒(CIV)引起的以呼吸道症状为主的犬类传染性疾病。2004年,在犬体内发现马源犬流感病毒后,人源、猪源、禽源等多种不同动物来源的犬流感病毒相继出现。这些病毒在犬体内复制、重配,甚至通过犬传播至其他宿主,对其他动物造成威胁。文章以犬流感的进化过程为基础,分析流感病毒在宿主改变过程中发生的对犬的适应性变化,以及不同犬流感的重点防治方向。

猪流感病毒基因池中的新成员:新甲型H1N1流感病毒基因片段的存在及潜在威胁

新甲型H1N1流感病毒(2009pandemic H1N1virus,pdm/09)于2009年在人群中暴发以后,迅速在全球范围内传播,引起了21世纪的第一次流感大流行。pdm/09是由人的流感病毒、禽流感和猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)经过重配后形成的病毒,它的基因片段已经进入了猪流感病毒当中并开始产生新的变异毒株,这些新的变异流感毒株在欧亚大陆、北美大陆及中国南部的各个地区被不断报道和发现,这表明猪源性pdm/09在人间流行后可返传给猪,成为猪流感病毒基因池中的固有组成,获得与SIV重组形成新的重配病毒的能力,并可能仍然具有感染人类的潜能。因此,必须关注新型重配病毒的进化:包括其在猪群中的生长适应、以及适应性感染人的进化过程。不仅如此,还必须加强对猪群及人群流感病毒的检测,了解重配病毒在人和猪两个种群中的进化过程。

内蒙古自治区2015-2018年B Yamagata系流感病毒全基因组序列分析

目的了解2015-2018年内蒙古自治区B Yamagata系流感病毒的全基因组序列特征。方法采集流感样病例呼吸道标本进行流感病毒分离,提取病毒RNA,采用一步法RT-PCR扩增病毒全基因组序列并测序,通过生物信息学软件分析病毒基因特征。结果本次研究的B Yamagata系流感病毒全基因与B/Phuket/3073/2013疫苗株的核苷酸同源性在97.7%～99.9%之间;B/Inner Mongolia/1200/2015和B/Inner Mongolia/1178/2015毒株发生抗原漂移,并出现HA-BY/NABV系间重配现象;所有毒株对神经氨酸酶抑制剂敏感。结论 2015-2018年内蒙古自治区B Yamagata系流感病毒抗原性和基因特征在逐渐发生变异,出现系间重配株,部分流感流行株与疫苗匹配性不佳。

传染性法氏囊病病毒自然重配株全基因组序列分析

从具有新的流行病学特征的传染性法氏囊病（IBD）发病鸡群中分离到2株传染性法氏囊病病毒（IBDV），分别命名为QL和ZZ—ll，对4周龄SPF鸡的致死率分别为94％和86％。为分析该毒株的分子生物学特征，对其全基因组序列进行了测定，2个病毒株基因组A节段长度为3260bp、B节段长度2827bp。病毒演化分析结果显示2个病毒基因组A节段的核苷酸序列与已发表的强毒株序列的同源性分别为96．8％～98．1％和96．9％～98．4％，处在IB—DV超强毒株分支上；而B节段与已发表的弱毒株序列的同源性分别为89．7％～90．4％和90．0％～90．7％，位于弱毒株分支上。IBDV超强毒株和弱毒株序列特征氨基酸残基与基序分析表明，QL和ZZ—11两个病毒株的A节段VP2基因的氨基酸残基为222A、249Q、253Q、254G、256I、294I和299S，七肽基序为SWSASGS，均符合超强毒株的分子特征；而B节段777～782位核苷酸序列为GGTGCC，没有KpnI酶切位点，具有弱毒株的序列特点。以上分析结果表明，QL和ZZ—11为IBDV自然重配株，A节段源于超强毒株，而B节段源于弱毒株。

口服人-牛(WC_3株)5价轮状病毒基因重配活疫苗保护效果的Meta分析

目的评价口服人-牛(WC_3株)5价轮状病毒基因重配活疫苗(PRV)的保护效果。方法检索中国生物医学文献数据库等中文数据库和美国国家医学图书馆数据库等外文数据库,检索有关PRV保护效果的研究纳入分析。按照研究地区的社会经济发展水平、疫苗株和流行株的匹配情况,分别合并试验组和对照组针对不同型别轮状病毒感染引起的急性肠炎发病的相对危险度(RR)或比值比(OR),计算疫苗效力(VE)。结果共纳入5篇病例对照研究。高发展水平国家,在疫苗株和流行株完全匹配的情况下,VE=94%(95%CI:84%~98%);在疫苗株和流行株不完全匹配的情况下,VE=82%(95%CI:70%~89%);在单一抗原匹配的情况下,VE=82%(95%CI:70%~89%);在单一抗原不匹配的情况下,VE=75%(95%CI:47%~88%)。中等发展水平国家,在疫苗株和流行株不完全匹配的情况下,VE=37%(95%CI:10%~56%);在单一抗原匹配的情况下,VE=71%(95%CI:60%~78%);在单一抗原不匹配的情况下,VE=76%(95%CI:61%~85%)。结论接种PRV可降低轮状病毒感染引起的急性肠炎发病率,PRV的保护效果与疫苗株和流行株匹配情况以及地区因素有关。

甲型H1N1流感血清流行病学研究进展

甲型H1N1流感（甲流）病毒是4源重配病毒，由经典猪流感病毒、欧洲猪流感病毒、禽流感病毒和人流感病毒重配而成，人群对甲流病毒普遍易感。2009年6月11日，世界卫生组织（WHO）宣布将甲流流行警告级别提升为6级，全球进入流感大流行阶段。

Ⅲ价轮状病毒基因重配疫苗免疫原性及对造血系统的影响

目的:研究Ⅲ价轮状病毒基因重配疫苗对SD大鼠的免疫原性及对造血系统的长期毒性。方法:疫苗组大鼠(n=30)免疫3次,每次每只动物2 mL ig,第1次免疫后3周、第3次免疫后1和4周各处死大鼠10只,检测血清特异性抗体,血液学和骨髓。结果:在各时间点疫苗组血清抗体滴度均明显高于对照组。第1次免疫后3周时可测出针对G1,G2,G3,G4和G10型抗原的抗体,逐渐升高。针对G2,G3和G4型的抗体滴度明显高于G1和G10型(P<0.01或<0.05)。疫苗组大鼠LY计数和MCH出现了可逆性变化(P<0.05),但无明显毒性,大鼠骨髓象无明显改变。结论:Ⅲ价轮状病毒基因重配疫苗对大鼠有明显免疫原性,对造血系统无明显毒性。

口服三价重配轮状病毒减毒活疫苗(Vero细胞)运输稳定性研究

目的 评价口服三价重配轮状病毒减毒活疫苗(Vero细胞)的运输稳定性。方法 通过非温度因素研究及温度偏移研究考察疫苗的运输稳定性。以兰州市至广西壮族自治区公路运输路线来模拟疫苗运输过程的最差条件,进行一次往返运输,用以考察非温度因素条件下的疫苗稳定性。极端温度及温度循环等破坏性试验来模拟疫苗脱冷链后在极端条件下的情况,通过检测外观、pH、渗透压、装量、不溶性微粒、重金属、病毒滴度、异常毒性等项目来考察疫苗温度偏移稳定性。结果 9批次疫苗往返运输后外观均合格,内包材破损率均为0%,运输前后病毒滴度差异均无统计学意义(P>0.05),各质量指标均符合可接受标准。疫苗在(37±2)℃放置7 d病毒滴度平均下降1.1 lgCCID;/mL,与2~8℃及(-20±5)℃差异均有统计学意义(P均<0.05),(-20±5)℃放置7 d病毒滴度与2~8℃差异无统计学意义(P>0.05)。3次温度循环后,疫苗病毒滴度略有下降,不溶性微粒、重金属检测、异常毒性等质量指标均符合药典要求。结论 长距离公路运输后疫苗的安全性、有效性不受非温度因素影响,稳定性良好,且疫苗在特定温度偏移范围内及一定时间段内仍安全、有效。

甲型流感病毒X31(H3N2)小鼠适应后毒力增强与HA及PB2突变相关

流感小鼠适应毒株及感染模型是研究流感病毒致病机理、评价抗流感病毒药物和疫苗效果的重要工具。为建立甲型流感病毒X31(H3N2)的鼠肺适应毒株,并探讨其在小鼠适应过程中毒力增强的分子机制,本研究将X31在BALB/c小鼠肺组织中连续传代,通过观察病毒滴度测定、感染小鼠症状变化、体重改变和致死力等指标,发现X31经过鼠肺连续传代10次以后,病毒毒力逐渐增强,与原代病毒相比,鼠肺中病毒滴度提高10倍,半数致死量(50%lethal dose,LD50)提高大于1 000倍。确定获得高致病力的鼠肺适应毒株(Mouse adapted X31,X31MA);对X31MA毒株全基因组测序发现,血凝素(Hemagglutinin,HA)基因出现3个有义突变(P221H、V309I、K411T),聚合酶碱性蛋白2(Basic protein 2,PB2)基因出现1个有义突变(M483T)。结果表明,通过在小鼠肺组织中连续传代X31(H3N2)致病力增强,其HA和PB2蛋白中四个适应性突变位点可能与流感病毒X31MA毒力增加相关。本研究为流感疫苗评价及致病机制研究提供了重要技术支持。

甲型流感病毒UTR可变区碱基多态性研究进展

随着对甲型流感病毒结构与功能研究的深入,病毒的增殖和致病机制已逐渐被阐明。甲型流感病毒基因的UTR可变区具有片段特异性,被认为与病毒的转录、复制及包装功能密切相关。本文系统地综述甲型流感病毒UTR可变区碱基多样性与病毒的转录、复制及包装之间的关系,为研究UTR可变区碱基多态性与流感病毒重配的分子机制两者间的关系奠定基础。