通过二维病毒覆盖蛋白结合试验(VOPBA)鉴定与新城疫病毒和人类呼吸道合胞病毒相互作用细胞蛋白的研究

虽然已有研究报道新城疫病毒(NDV)和呼吸道合胞病毒(RSV)的起始结合受体分别为唾液酸含有分子和黏多糖,但是这2种病毒受体的确切特性仍有待破译。另外,宿主细胞表面的额外分子可能参与病毒侵入机制。本试验运用了病毒覆盖蛋白结合试验(VOPBA)来确定细胞表面与NDV和RSV相互作用的细胞蛋白。通过二维凝胶电泳试验及电转到PVDF膜来分离细胞膜,然后采用高浓度病毒将其标记。NDV与一个来自鸡成纤维细胞的蛋白质二硫键异构酶相互作用,而对于RSV,作者检测到15个反应点,鉴定为6个不同蛋白,最为突出的是核仁蛋白。本试验分别讨论了PDI和核仁蛋白在NDV和RSV入侵细胞过程中的可能作用。

牙鲆淋巴囊肿病毒靶器官上病毒结合蛋白的鉴定

利用抗牙鲆淋巴囊肿病毒单克隆抗体的间接免疫荧光检测技术,在患淋巴囊肿病牙鲆的表皮、鳃、胃、肠及肾中发现淋巴囊肿病毒的感染,以此确定为病毒感染的主要靶器官。用NP-40细胞裂解液分别抽提靶器官的总蛋白,利用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)对靶器官上淋巴囊肿病毒结合蛋白进行鉴定,结果显示在胃、肠及肾的组织蛋白中均有1个分子量为27.8 kDa的蛋白与淋巴囊肿病毒特异结合,在鳃和表皮的组织蛋白中分别存在分子量为37.6 kDa和56.0 kDa的蛋白与淋巴囊肿病毒特异结合。推测在淋巴囊肿病毒靶器官上的这3种病毒结合蛋白有可能是病毒的受体蛋白。

鸭胚成纤维细胞上坦布苏病毒受体蛋白的鉴定

【目的】拓展对坦布苏病毒受体的认知,为研究其在鸭体内的感染机制打下基础。【方法】取9日龄SPF鸭胚制备鸭胚成纤维细胞(DEF),待细胞长成单层后提取DEF膜蛋白,利用免疫共沉淀试验筛选出DEF膜蛋白中可与坦布苏病毒结合的蛋白,经病毒辅覆蛋白结合分析(VOPBA)验证后通过LC-MSMS质谱分析进行鉴定;同时人工合成鸭热休克蛋白70基因(HSP70)序列的开放阅读框(1905 bp),构建重组质粒pET32a-HSP70并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,以重组蛋白免疫小鼠制备抗鸭HSP70血清,与DEF细胞共孵育后接种坦布苏病毒,并采用实时荧光定量PCR检测抗血清对病毒感染的抑制作用。【结果】DEF膜蛋白中分子量约70 kD的蛋白可与坦布苏病毒结合,经LC-MSMS质谱分析和序列比对可确定该蛋白即为鸭热休克蛋白70(HSP70)。含重组质粒pET32aHSP70的BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导4 h后,SDS-PAGE检测发现在分子量约85 kD处出现目的蛋白条带,获得的重组鸭HSP70蛋白主要以包涵体形式进行表达,且能与His标签抗体发生特异性反应。以重组鸭HSP70蛋白免疫小鼠获得的抗鸭HSP70血清可封闭DEF细胞上的HSP70,而竞争性抑制坦布苏病毒感染。【结论】HSP70是坦布苏病毒感染DEF细胞的受体,可作为新的靶点用于抗坦布苏病毒药物设计。

鸡胚成纤维细胞膜上禽流感病毒受体蛋白的鉴定

提取鸡胚成纤维细胞膜蛋白,利用病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)鉴定禽流感病毒在鸡胚成纤维细胞膜上的受体。结果显示,所提取的细胞膜蛋白中含有8条疑似病毒受体条带。本实验初步鉴定了禽流感病毒在鸡胚成纤维细胞上的受体蛋白,为揭示流感病毒感染鸡的机制提供了初步证据。

小反刍兽疫病毒细胞膜受体的鉴定

【目的】对小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)H蛋白胞外区(tH)细胞膜受体进行鉴定,为PPRV致病机制的研究奠定基础。【方法】克隆PPRV H基因胞外区(tH),在毕赤酵母(Pichia pasto-ris)中进行真核表达,纯化后免疫家兔,获得兔抗PPRV-tH蛋白特异性抗体;提取山羊外周血淋巴细胞膜蛋白,经SDS-PAGE检测后,湿转印法转印至NC膜,分别利用纯化的重组tH蛋白和PPRV进行病毒铺覆蛋白结合试验(VOPBA),对受体进行鉴定。【结果】成功克隆了1 653bp的PPRVtH基因,构建其重组酵母表达质粒pPIC9K-tH,诱导表达后获得了60ku目的蛋白。重组tH蛋白免疫家兔后获得了效价为1∶200的抗血清。Western-blotting分析发现,该重组蛋白可与PPRV多克隆抗体发生特异性反应,山羊外周血淋巴细胞膜蛋白上有2个与PPRV和重组tH蛋白结合的蛋白带,分子质量约为38和100ku。【结论】从山羊外周血淋巴细胞膜蛋白上鉴定到了2种与PPRV结合的蛋白组分,其特性有待于进一步研究。