银川市2016-2022年手足口病柯萨奇病毒A6型分离株VP1基因特征分析

目的 分析银川市2016-2022年引起手足口病的柯萨奇病毒A6型(CV-A6)VP1的基因特征,为手足口病的防治工作提供有效的参考依据。方法 收集2016-2022年银川市手足口病所有CV-A6核酸呈阳性的标本进行病毒分离培养,应用一步法聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增其VP1区完整基因核酸片段进行核苷酸序列测定,利用测序结果进行系统发育树构建、同源性分析及氨基酸突变位点分析。结果 2016-2022年银川市共分离到手足口病CV-A6型毒株90株,测序后成功获得CV-A6 VP1区全长序列的毒株83株。完整VP1区基因均由915个核苷酸组成,编码305个氨基酸。系统发育分析显示,2016-2022年银川市83株CV-A6分离株均属于D3基因亚型的D3a分支;同源性分析表明,银川市83株CV-A6分离株与原型株Gdula株(AY421764-USA-1949)之间核苷酸相似性为82.1%~84.1%,氨基酸相似性为76.2%~80.5%,遗传距离较远;银川市83株CV-A6分离株与原型株Gdula株的VP1区氨基酸序列比较发现32个氨基酸位点出现变异。结论 2016-2022年银川市手足口病83株CV-A6分离株均属于D3基因亚型的D3a分支。加强对CV-A6的持续监测及基因特征分析,对科学防控CV-A6引起的手足口病及其疫苗研发具有重要意义。

柯萨奇病毒A组10型VP1蛋白线性中和表位的筛选和鉴定

柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)是引起手足口病(HFMD)的常见病原体之一。应用重叠肽法筛选出覆盖CV-A10全长VP1区氨基酸序列的39条候选表位肽段,以间接酶联免疫吸附试验(ELISA)及微量中和抑制试验验证。结果发现,候选表位P6(CV-A10 VP1区第39~53位氨基酸)与CV-A10全病毒抗血清具有高反应性,且在3.91μg/mL的稀释质量浓度时仍具有中和抑制作用,为潜在中和表位。用P6肽免疫小鼠制备相应的抗血清,并以微量中和试验验证其保护能力,结果显示,P6抗血清的几何平均中和效价为1:8.97,可确定P6为CV-A10的中和表位。为了解P6序列在CV-A10型内的保守性,将P6的氨基酸序列与CV-A10各基因型代表株进行比对分析,结果显示,P6在CV-A10型内高度保守,表明P6为CV-A10的广谱性中和表位,可应用于CV-A10表位疫苗的研发。本研究旨在筛选鉴定CV-A10 VP1蛋白上的线性中和表位,为CV-A10表位疫苗的研发和HFMD的防控奠定基础。

柯萨奇病毒A组6型中国株的分子进化和时空传播分析

柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)是手足口病的主要病原体,可引起非典型手足口病和中枢神经系统疾病,对儿童造成严重的疾病负担,尚无上市的疫苗和抗病毒药物.基于3288条CV-A6中国株VP1序列,利用Nextstrain平台的augur病原体生物信息分析包,构建了CV-A6的时间尺度分子进化树,确定了进化分支和分支突变,分析了分支突变与抗原表位之间的联系.进一步分析了CV-A6中国株各分支在中国七大地理区域的时空分布和优势分支,绘制了主要分支的时空传播路线.结果发现,CV-A6中国株主要分为B、C和D三个进化分支以及D2、D3a和D3b三个子分支,抗原表位处的突变形成了新的进化分支,促进了病毒的流行.华南和华东是CV-A6中国株的主要起源地,华南和华东相互输出、华东输出全国是中国株的主要传播模式.对CV-A6中国株的分子进化和时空传播分析,为CV-A6引起的手足口病等疫情的监测、预警和防控提供了重要支持.

高危型人乳头瘤病毒a9组感染女性不同程度宫颈病变的阴道微生物菌群特征

目的 研究不同程度宫颈病变女性阴道微生物菌群特征,探讨通过改变阴道菌群,阻止宫颈癌变的可能性。方法选取2021年10月至2023年5月首都医科大学附属北京朝阳医院阴道镜门诊就诊的单一亚型高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus,HR-HPV)α9组感染的患者,按宫颈组织病理学诊断结果分为低级别鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)或正常者(LSIL-组)207例和高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)及宫颈浸润癌者(HSIL+组)117例。应用16S r RNA V4区基因测序技术鉴定并比较两组受试者阴道微生物群特征。应用秩和检验、卡方检验、曲线拟合、线性判别分析效应(Linear discriminant analysis Effect Size,LEf Se)分析HPVα9组感染不同程度宫颈病变女性阴道微生物菌群特征与宫颈病变的关系。结果 HSIL+组与LSIL-组女性感染HPV亚型的差异有统计学意义(P<0.05),两组阴道微生物群的物种数目、香农指数差异无统计学意义(P>0.05)。在不同程度宫颈病变女性,阴道菌群动态改变,其变化趋势与宫颈病变的结局有关。LEf Se分析发现HSIL+组葡萄球菌属显著高于LSIL-组,LSIL-组普雷沃氏菌属的相对丰度高于HSIL+组(Z=2.59,P<0.05),普雷沃氏菌、假单胞菌与乳杆菌联合降低HSIL的发生。分层分析发现初次性生活年龄≤20岁、产次<3次、无恶性肿瘤家族史、教育程度≥本科、体质量指数<24 kg/m2时,普雷沃氏菌属相对丰度不同,发生高级别病变的风险不等,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论 不同程度宫颈病变阴道微生物群的构成不同,多个菌属间可能存在内在平衡。高度宫颈病变时葡萄球菌属丰度高,普雷沃氏菌属丰度增加与正常宫颈及低级别病变密切相关,并受多种因素影响。

猴痘病毒A5L蛋白的原核表达及其免疫原性评价

【目的】获取高纯度猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)A5L蛋白,制备小鼠抗A5L高效价抗血清,为MPXV A5L蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】构建重组质粒pET-28a-A5L,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,通过分析不同IPTG诱导浓度、诱导温度、诱导时间条件下重组蛋白A5L表达情况,筛选最佳表达条件。通过Western blotting鉴定重组蛋白A5L表达,利用SDS-PAGE分析重组蛋白可溶性。A5L蛋白经His-Bind镍柱亲和层析纯化后免疫小鼠,通过ELISA法检测抗体效价。【结果】双酶切和测序结果显示,原核表达载体pET-28a-A5L构建成功。Western blotting结果显示重组蛋白A5L在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达;A5L蛋白在诱导温度42℃、诱导剂(IPTG)浓度为1.6 mmol/L、诱导16 h后表达量最高,大小为40 ku。SDS-PAGE分析结果显示,A5L蛋白主要以包涵体形式存在,最佳咪唑洗脱浓度为50 mmol/L。ELISA结果显示,制备的鼠抗A5L蛋白抗体最高效价达1∶205 440。【结论】本研究成功构建了重组质粒pET-28a-A5L,并在原核表达系统中成功表达重组蛋白A5L,制备的A5L多克隆抗体具有较好的免疫原性,研究结果为进一步探究MPXV A5L蛋白的生物学功能奠定基础。

升降散体外抗流感病毒A/PR8/34/H1N1株的作用研究

目的研究升降散体外抗流感病毒A/PR8/34/H1N1株的作用。方法以磷酸奥司他韦作为阳性对照药物,在狗肾细胞株水平上,测定流感病毒的病毒滴度,计算流感病毒的半数细胞培养感染剂量(TCID_(50));测定阳性对照药和升降散的细胞毒性,得到药物的最大无毒浓度(TC_(0))和半数中毒浓度(TC_(50));通过3种不同的给药方式体外观察升降散对甲型流感病毒PR8感染的细胞病变效应(CPE)的作用影响,采用CCK8法计算升降散对甲型流感病毒PR8感染的细胞存活率的影响,计算药物的抗病毒有效率(ER);同时采用实时荧光定量PCR法在给药后12、24、48h动态检测细胞内Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9凋亡相关因子的表达水平,探讨升降散抗病毒作用机制。结果病毒滴度测定流感病毒PR8的TCID_(50)为10^(-5.20);药物毒性测定得到磷酸奥司他韦和升降散的TC_(0)分别为0.25、6.25mg/mL,TC_(50)分别为0.76、9.69mg/mL;3种给药方式下的升降散组和磷酸奥司他韦组的细胞存活率高于病毒对照组(P<0.05),在最大无毒浓度下升降散直接灭活抗流感病毒的ER为52.37%,通过预防病毒侵入细胞来抗病毒的ER和治疗病毒穿入细胞来抗病毒的ER低于50%;升降散组细胞在12、24、48 h的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因mRNA表达均被显著下调(P<0.05)。结论升降散具有一定的体外抗流感病毒作用,且能通过抑制流感病毒感染诱导的细胞凋亡起作用。

木薯花叶病毒AC4蛋白与AtPARN互作研究

木薯(Manihot esculenta Crantz)作为重要的热带作物,是全球六大粮食作物之一,并为全球近七亿人口提供主粮,然而病毒侵染引起的病害在全球范围内严重威胁木薯产业的发展。木薯花叶病毒病(cassava mosaic disease,CMD)是最有威胁的病害之一,造成严重的经济损失。斯里兰卡木薯花叶病毒(SriLankancassavamosaicvirus,SLCMV)是引发木薯花叶病的病原物之一,SLCMV是典型的双组分双生病毒,其基因组由DNA-A和DNA-B两个环状组分组成。无义介导的mRNA降解(nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD)是真核细胞mRNA降解的主要途径之一,也是真核生物普遍存在的抗病毒防御机制。越来越多的研究显示,NMD不仅是真核生物重要的mRNA数量、质量调控机制,还与转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTGS)同样能降解病毒RNA,是真核生物普遍存在的抗病毒防御机制。NMD的mRNA衰减过程包括PTC的识别、脱腺苷酸、脱帽和最后的核酸外切酶降解4个过程,UPF1、PARN、DCP2和XRN4分别是上述4个过程中的关键蛋白。病毒是专性寄生生物,必须逃避或耐受寄主细胞的降解,才能成功感染。聚腺苷酸特异性核糖核酸酶[poly(A)-specific ribonuclease,PARN]是NMD信号通路的一个关键因子。目前,关于SLCMV抵御寄主NMD的分子机制尚不明确。本研究采用酵母双杂交(yeast two-hybrid system)和荧光双分子互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)试验证明斯里兰卡木薯花叶病毒(SLCMV)编码的沉默抑制子AC4与拟南芥PARN相互作用。据此推测SLCMV AC4蛋白可能通过与AtPARN相互作用而抑制寄主NMD的病毒防御功能帮助病毒逃避或耐受寄主细胞的降解。研究结果为阐明木薯花叶病毒调控寄主NMD抗病毒防御功能的分子机理奠定基础。

盐酸石蒜碱硫酯体内抗柯萨奇病毒A16的药效研究

目的研究盐酸石蒜碱硫酯在体内抗柯萨奇病毒A16(CVA16)的药效。方法通过腹腔注射病毒液方式感染10~11 d的ICR小鼠建立CVA16感染的小鼠模型。实验分为盐酸石蒜碱硫酯1.0、0.5、0.25 mg·kg^(-1)组;50 mg·kg^(-1)RBV对照组;病毒对照组;正常对照组。检测盐酸石蒜碱硫酯对病毒感染后小鼠发病情况、小鼠存活率和平均存活日;蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测肌肉组织中病毒蛋白的表达水平;采用细胞病变效应法(CPE)测定肌肉组织中的病毒滴度;采用苏木素伊红(HE)染色检测肌肉组织的病理变化。结果与病毒对照组相比,盐酸石蒜碱硫酯1.0和0.5 mg·kg^(-1)剂量组能够显著降低小鼠肌肉组织的病毒滴度和病毒蛋白表达,降低CVA16感染造成的小鼠肌肉组织的炎症损伤,延缓小鼠的发病过程,显著延长小鼠的平均存活时间,增加小鼠的存活率,具有明确的保护作用。结论盐酸石蒜碱硫酯1.0和0.5 mg·kg^(-1)剂量组对CVA16感染小鼠具有显著明确的保护作用,提示盐酸石蒜碱硫酯可能成为潜在的治疗手足口病的药物。

2013-2022年江苏省柯萨奇病毒A6型全基因组序列特征分析

目的 研究江苏省2013-2022年分离到的柯萨奇病毒A6型(CV-A6)全基因组序列特征及对全基因组各编码区进行遗传进化分析,以期从分子流行病学特征的角度解释CV-A6取代肠道病毒A71和柯萨奇病毒A16成为江苏省引起手足口病(HFMD)主要病原的原因。方法 选取2013-2022年间江苏省地区流行的35株CV-A6毒株进行全基因组测序,采用DNASTAR、MEGA7.0和Similarity plots3.5.1等软件对获取的全基因组序列进行比对、相似性分析、系统进化分析和基因重组分析,对P1编码区和3D区主要氨基酸变异位点进行分析。结果 35株CV-A6江苏毒株的全基因组核苷酸和氨基酸序列相似性分别为87.5%~99.6%和97.0%~99.8%,与CV-A6原型株Gdula/USA/1949的全基因组核苷酸序列相似性仅为80.3%~81.0%,氨基酸序列相似性为94.7%~95.3%。基于VP1序列的系统进化树结果显示,2013-2022年江苏省有34株CV-A6分离毒株分属于D3a基因亚型,1株分属于D2基因亚型;基于3D区进化树划分不同重组模式,2013-2022年江苏省流行的CV-A6出现过4个重组进化分支:RF-A、RF-L、RF-K和RF-C型。重组分析结果显示:江苏省流行的CV-A6毒株与CV-A6原型株Gdula/USA/1949在结构蛋白序列上具有较高的相似性。而在非结构蛋白和非编码区则与其他EV-A原型株序列相似性更高。而氨基酸突变位点分析结果显示,与原型株Gdula/USA/1949相比,P1区和3D区多个氨基酸位点变异频繁,可能会使得衣壳蛋白的结构、潜在的受体结合位点产生变化。结论 通过对2013-2022年江苏省CV-A6的全基因组序列分析,有助于了解江苏省CV-A6基因重组及遗传进化关系,解释了近年来CV-A6成为手足口病的主要病原体的可能原因,对CV-A6的防控工作提供了基础资料。

2018—2020年黔东南少数民族自治州肠道病毒A71型基因特征分析

目的对2018—2020年黔东南州手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)进行鉴定分析,并对肠道病毒A组71型(enterovirus A71,EV-A71)VP1编码区进行基因特征分析。方法2018—2020年黔东南州共采集HFMD病例标本2789份,首先,采用荧光定量RT-PCR初筛肠道病毒核酸,阳性病例标本采用人类横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞进行病毒分离,对分离到的病毒株提取病毒核酸,经RT-PCR方法扩增VP1编码区核苷酸序列并进行序列测定。使用MEGA 11.0软件构建遗传进化树进行基因特征分析。结果2789份HFMD标本中检出EV-A71核酸阳性标本为328份,阳性率为11.8%。从部分EV-71阳性患者的咽拭子及肛拭子中,分离培养获得7株病毒株,其中6株来自于轻症病例,另1株为重症病例,均属于EV-A71基因型C4a基因亚型,分成2个不同的簇。7株EV-A71 VP1序列之间核苷酸和氨基酸同源性分别为89.8%~99.9%和98.0%~99.7%;与BrCr原型参考株间的核苷酸和氨基酸同源性分别为77.1%~78.8%和94.8%~96.6%;并在VP1有18处氨基酸位点发生变异。结论2018—2020年黔东南州EV-A71分离株属于C4a基因亚型,多处氨基酸位点存在变异,可导致多条传播链循环。

猪塞内卡病毒A、猪水疱病毒和口蹄疫病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种鉴别猪塞内卡病毒A(SVA)、猪水疱病毒(SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)的方法,针对3种病毒的基因保守区域设计引物和探针,建立了可同时检测上述3种病毒的Taq Man三重荧光定量PCR方法。该方法仅能特异性扩增SVA和FMDV病毒基因以及SVDV阳性质粒,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、经典猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒的阳性样品cDNA或DNA无交叉反应,对3种病毒核酸的最低检出限均为10 copies/μL,组内和组间变异系数均小于4%。应用该方法对2019-2022年采集的吉林省部分地区267份病料和本实验室留存的30份猪血清样品进行检测,未检出SVA、FMDV以及SVDV。建立的三重荧光PCR方法有利于对3种病毒进行有效的流行病学调查,可给快速准确鉴别致猪水疱症状病毒性疾病提供诊断方法。

新发鸽腺病毒A型感染的病理变化

近年来,我国信鸽和肉鸽养殖业发展迅猛,已经成为我国继鸡、鸭、鹅之后的第四大家禽产业。鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAdV)是鸽群中常见的一种病原,国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)将鸽腺病毒分为PiAdV-A和PiAdV-B。2022年1月起,我国新疆、河北、北京等地区的信鸽公棚以及肉鸽养殖场暴发了一种以鸽肝组织弥漫性坏死和突然死亡为特征的新型鸽腺病毒病。该病在肉鸽场传播缓慢,持续时间长,发病种鸽消瘦、突然死亡,病程长达3个月,累计死亡率15%,给养鸽业造成了严重的经济损失。在信鸽公棚,主要是5-6月龄信鸽发病,病程较短,表现为采食量下降,死亡率10%-13%,严重影响信鸽的比赛成绩。经病理剖检、组织病理学、电镜观察和病原核酸检测等方法综合诊断为鸽腺病毒A型感染。

塞内卡病毒A反向遗传技术及其应用

塞内卡病毒A(SVA)是引起猪口鼻部、蹄冠部水疱样病变,甚至引起新生仔猪急性死亡的新发病毒。SVA是无囊膜的单股、正链RNA病毒,由于其基因组不断发生重组和进化,因此给养猪业造成较大的经济损失。反向遗传作为一种从基因入手开展体外遗传学研究的技术,能够在病毒cDNA分子水平上进行基因定向改造,进而借助宿主细胞实现病毒复制、翻译、包装和拯救的目的,最终研究重组病毒的生物学特性。本文就SVA反向遗传技术的研究及其应用进行综合评述,以期为进一步探究SVA复制、表达、调控等分子机制提供思路。

2016—2020年安徽省手足口病相关柯萨奇病毒A组16型分子分型研究

目的了解安徽省手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)相关柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CV-A16)基因型别分布情况。方法通过中国疾病预防控制信息系统传染病报告管理信息系统收集安徽省2016—2020年HFMD病例资料,并收集HFMD患儿咽拭子标本。对荧光定量PCR检出的CV-A16核酸阳性病例样本采用RT-PCR扩增VP1区基因片段并测序。运用肠道病毒在线分型工具确定基因型别,再利用MEGA 6.0生物软件构建CV-A16 VP1区基因进化树并分析VP1区氨基酸变异位点。结果2016—2020年安徽省累计报告HFMD实验室确诊病例16650例,其中CV-A16确诊病例3809例(占22.88%),各年中CV-A16确诊病例占比依次为20.72%(219/1057)、22.91%(677/2955)、23.89%(1004/4202)、42.58%(1687/3962)、4.96%(222/4474)。对获取的436份CV-A16阳性标本进行测序,获得290条VP1区基因序列,均属于B基因型,其中B1a基因亚型65条,B1b 225条。290条VP1区基因序列核苷酸同源性为86.80%~100.00%,与CV-A16原型株G-10核苷酸同源性为74.10%~76.80%。65条B1a毒株VP1区基因序列与B1a参考株核苷酸同源性为93.00%~99.90%,225条B1b毒株VP1区基因序列与B1b参考株核苷酸同源性为88.40%~99.60%。B1a基因亚型流行株在遗传进化上分为4个分支簇,B1b基因亚型流行株在遗传进化上分为6个分支簇。与原型株G-10 VP1区编码氨基酸位点变异分析显示,290条VP1区基因存在多个位点变异。结论2016—2020年安徽省HFMD CV-A16流行株B1a与B1b基因亚型二者共同流行,应持续关注安徽省肠道病毒病原监测与分子进化变异情况。

HMGB-1和NSE对肠道病毒A71感染的手足口病患儿病情预测价值

目的研究肠道病毒A71(EV71)引起的不同病情严重程度手足口病(HFMD)患儿外周血中神经元特异性烯醇化酶(NSE)及高迁移率族蛋白-1(HMGB-1)水平,分析两者对EV71感染HFMD病情的预测价值。方法将59例EV71感染的HFMD患儿作为HFMD组,另选择60例体检健康儿童作为对照组,HFMD组患儿根据其入院时病情严重程度分为普通型组(n=30)、重症重型组(n=22)及重症危重型组(n=7),比较HFMD组和对照组、不同严重程度HFMD组儿童间入院或体检时的血清HMGB-1、NSE、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,采用Spearman法分析HFMD患儿学清NSE、HMGB-1水平与IL-6、TNF-α水平的相关性,采用受试者工作曲线(ROC)下面积(AUC)评估血清NSE、HMGB-1对HFMD病情的预测价值。结果HFMD组患儿血清HMGB-1、NSE、IL-6、TNF-α水平高于对照组(P<0.01),HFMD组患儿血清HMGB-1、NSE、IL-6、TNF-α水平比较,普通型组<重症重型组<重症危重型组(P<0.05);HFMD患儿血清NSE、HMGB-1与IL-6、TNF-α呈正相关(r=0.56、0.49、0.83、0.69,P<0.01);NSE、HMGB-1及两者联合对重症重型及重症危重型的AUC分别为0.74(95%CI为0.62~0.87)、0.92(95%CI为0.85~0.98)及0.92(95%CI为0.85~0.99)。结论EV71感染会引起HFMD患儿血清NSE及HMGB-1水平升高,并与病情严重程度及IL-6、TNF-α水平呈正相关,两者联合检测可作为预测HFMD病情的重要指标。

滤泡辅助性T细胞在柯萨奇病毒A6型手足口病患儿外周血中的表达及作用

目的探讨滤泡辅助性T细胞(Tfh)在柯萨奇病毒A6型手足口病(HFMD)患儿外周血中的表达水平及作用。方法采集2022年6月至2023年8月杭州市儿童医院收治的A6型HFMD患儿33例作为HFMD组,选择同期体检健康儿童26例作为健康人对照组,利用流式细胞术检测HFMD患儿和体检健康儿童外周血中的Tfh频数,分析并比较二者之间的关系。结果HFMD组和健康人对照组CXCR5^(+)CD4^(+)细胞占CD4^(+)T淋巴细胞的频数分别为3.95(2.31,6.21)%和1.44(0,94,2.43)%,两组之间差异有统计学意义(P<0.001)。HFMD组中ICOS^(+)CXCR5^(+)CD4^(+)和PD-1^(+)CXCR5^(+)CD4^(+)Tfh细胞频数分别为1.44(0.81,2.86)%和1.64(0.65,4.05)%,而在健康人对照组分别为0.84(0.27,1.46)%和0.47(0.13,1.12)%,两组之间差异有统计学意义(P<0.05);且两者均与CXCR5^(+)CD4^(+)细胞水平呈显著正相关(P均<0.05)。结论Tfh细胞在柯萨奇病毒A6型肠道病毒感染引起的HFMD患儿免疫反应中具有重要的作用。

柯萨奇病毒A组5型实时荧光RT-PCR检测方法的建立与评价

目的建立柯萨奇病毒A组5型(CVA5)特异的一步法实时荧光反转录聚合酶链反应(RT-PCR)核酸检测方法。方法以流行于遵义地区的CVA5病毒株和NCBI基因库中随机下载的CVA5 VP1基因序列作为参考序列,分析这些序列的保守区域,在其保守区设计特异性的引物与Taqman探针,建立检测CVA5的一步法实时荧光RT-PCR。通过构建含CVA5 VP1保守区域的重组质粒,绘制标准曲线,并对检测方法的灵敏度、特异性、重复性及临床样本检出限进行评价。利用该方法对遵义地区273份未明确分型的肠道病毒阳性样本进行检测,将检出的部分CVA5阳性产物进行测序。结果成功建立一种基于实时荧光RT-PCR的CVA5检测方法,该方法在10^(4)~10^(9)copy/mL范围内具有良好的线性关系(R 2>0.999),平均扩增效率为102.26%。灵敏度高,对临床样本的检出限为103copy/mL。该方法的特异性强,与柯萨奇病毒A组2型(CVA2)、柯萨奇病毒A组4型(CVA4)、柯萨奇病毒A组6型(CVA6)、丙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒和鼻病毒等均不发生交叉反应。重复性实验的变异系数低于1.5%。273份未明确分型肠道病毒阳性样本中共检出25份CVA5,占未明确分型阳性样本的9.16%。结论该研究建立的一步法CVA5RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于CVA5的检测。

2013～2014年杭州地区手足口病柯萨奇病毒A6型和A10型VP1基因特征分析

目的了解2013-2014年杭州地区手足口病病原谱的分布,并对其病原基因特征进行分析。方法采集2013年3月至2014年4月手足口病患儿标本1 340例,提取病毒核酸,通过逆转录和PCR扩增肠道病毒VP1序列并测序,经Blast比对确定病毒基因型。对柯萨奇病毒A6型（CA-A6）和A10型（CA-A10）VP1全长序列进行同源性比对分析,并构建系统进化树。结果1 340例手足口病患儿标本中,肠道病毒检出阳性率为81.43%（1 090/1 340）。其中,CV-A6阳性率为41.04%,取代EV-71（14.48%）成为杭州地区检出阳性率最高的肠道病毒;CV-A10检出率（8.51%）也高于CV-A16（3.81%）,列于第三位。同源性比对及系统进化分析显示,2013-2014年的25株CV-A6病毒核苷酸同源性为89.0%-99.7%,主要分布于G、H基因亚型;15株CV-A10病毒核苷酸同源性为95.3%-99.9%,分布于F、G基因亚型。结论 2013-2014年杭州地区儿童手足口病的主要病原体发生重大变化,CV-A6病毒成为最主要病原,CV-A10病毒也存在潜在威胁,需加强对其他肠道病毒的持续监测和分子特征分析。

检测柯萨奇病毒A组6、10、16型的多重荧光RT-PCR建立及应用

目的建立检测手足口病(HFMD)肠道病毒的多重荧光RT-PCR方法。方法用多重荧光RT-PCR技术对引起HFMD的3种常见人肠道病毒[柯萨奇病毒A组(CVA)6、10、16型]进行检测,用基因测序法进行验证,并以灭活的CVA6、CVA10、CVA16病毒标准株以及引起临床相似症状的病原体样本进行特异性和灵敏度分析。结果 322例临床疑似HFMD标本,经本多重荧光RT-PCR法检测出CVA16、CVA10和CVA6型阳性样本分别为81、16和9份(总阳性率32.9%),且与基因测序法结果完全符合。将多重PCR体系中c-MMLV逆转录酶的量增至5 U,Hot-Taq酶的量增至8.5 U,可使其扩增效率提升至单重PCR扩增水平。优化后的体系可扩增出CVA6、CVA10和CVA16型阳性病毒标准RNA的检测下限分别是10,5和1 TCID50/mL。结论建立了一种灵敏、特异、高效和高通量的检测HFMD肠道病毒的多重荧光RT-PCR法,为其快速诊断提供了新的实验方法。

樱桃病毒A实时荧光定量PCR检测技术的建立与应用

在樱桃病毒A(CVA)mp基因保守区域设计了3对检测引物,经特异性筛选后,获得可用于病毒定量研究的引物。制备质粒标准品,建立标准曲线,同时验证该方法的灵敏度和特异性,并应用于田间果树样品CVA定量检测。最终成功筛选出1对检测效率高、特异性强的引物(CVA-dF2、CVA-dR2),基于SYBR Green I荧光染料建立反转录实时荧光定量PCR检测CVA的方法。该方法重复性好、灵敏度高,无需借助内参基因即可准确检测目的病毒载量,绝对定量标准曲线斜率为-3.5746,决定系数R2为0.9986,扩增效率为0.9044,比常规RT-PCR检测灵敏度高10倍。该方法的建立为CVA定量研究提供了有力工具,可用于果树中CVA批量检测或低丰度病毒样品检测。