Notch1表达下调抑制病理性瘢痕成纤维细胞增殖并诱导其凋亡

目的探讨慢病毒介导的Notch1表达下调对病理瘢痕成纤维细胞(PSF)中caspase-9活化水平及线粒体膜电位的影响。方法分离培养增生性PSFs,感染Notch1 siRNA慢病毒和阴性对照慢病毒。分别采用RT-qPCR和Western blot检测细胞中Notch1mRNA和蛋白表达;MTT法检测细胞增殖;PI单染法检测细胞周期;Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡;Western blot检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期依赖性蛋白激酶4(CDK4)、活化的caspase-3(c-caspase-3)和caspase-9(c-caspase-9)蛋白及胞质和线粒体中细胞色素C(cytochrome C)蛋白;JC-1法检测细胞线粒体膜电位。结果Notch1 siRNA慢病毒感染后的PSFs中Notch1表达水平明显低于阴性对照慢病毒和未感染的PSFs的表达水平(P<0.05)。下调Notch1后的PSFs增殖能力降低(P<0.05);细胞G0/G1期比例升高(P<0.05);细胞凋亡率升高(P<0.05);c-caspase-3和c-caspase-9蛋白表达升高(P<0.05);细胞线粒体膜电位明显下降(P<0.05);细胞中cyclin D1和CDK4蛋白水平降低(P<0.05);胞质内的cytochrome C蛋白含量升高(P<0.05)及线粒体中cytochrome C蛋白水平降低(P<0.05)。结论Notch1表达下调抑制PSFs增殖并诱导凋亡。

抑制Akt信号通路对病理性瘢痕成纤维细胞生长、细胞周期及凋亡的影响

目的:研究抑制蛋白激酶B(Akt)信号通路对病理性瘢痕成纤维细胞生长、细胞周期及凋亡的影响。方法:体外分离培养人病理性瘢痕成纤维细胞,用不同浓度的Akt信号通路抑制剂LY294002处理后,采用MTT法检测细胞增殖情况,计算IC50。用IC50浓度的LY294002处理病理性瘢痕成纤维细胞后,流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况,Western blot检测活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(Cleaved Caspase-9)、Akt、磷酸化的Akt(p-Akt)水平。结果:不同浓度的LY294002作用后细胞在570 nm处的吸光度值(A值)降低(P<0.001),IC50为30 mg/L。30 mg/L LY294002作用后细胞被阻滞在G0/G1期(P<0.001)。30 mg/L LY294002作用后细胞凋亡率高于0 mg/L作用组,细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表达水平高于0 mg/L作用组,而p-Akt表达水平明显低于0 mg/L作用组(P<0.001)。结论:抑制Akt信号通路能够抑制病理性瘢痕成纤维细胞生长,阻滞细胞周期,促进细胞凋亡,促进细胞中Caspase-3、Caspase-9活化。

长链非编码LINC00312通过内质网IRE1-JNK途径促进病理性瘢痕成纤维细胞凋亡

目的探讨长链非编码RNA LINC00312(LncRNA LINC00312)对人病理性瘢痕成纤维细胞凋亡的影响及其可能机制。方法体外分离培养人病理性瘢痕成纤维细胞,并采用LINC00312 shRNA慢病毒和阴性对照慢病毒感染细胞,qRT-PCR法检测感染前后细胞中LINC00312的表达水平。根据实验需求,将细胞分为4组:空白对照组(Blank)、阴性对照慢病毒组(NC-shRNA)、LINC00312 shRNA慢病毒组(LINC00312-shRNA)及IRE1α特异性抑制剂组(LINC00312-shRNA+KIRA6)。采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况;Hoechst染色法观察各组细胞形态变化;Annexin V-FITC/PI法检测各组细胞凋亡情况;Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2以及内质网应激相关蛋白GRP78、IRE1、p-IRE1、JNK、p-JNK的表达水平。结果LINC00312 shRNA慢病毒感染后细胞中LINC00312的表达水平显著降低(P<0.05);与Blank组和NC-shRNA组比较,LINC00312-shRNA组细胞增殖活性明显降低,细胞核呈大量碎块致密浓染,凋亡水平明显升高,cleaved Caspase-3、Bax、GRP78、p-IRE1、p-JNK等蛋白表达水平明显升高,Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与LINC00312-shRNA组比较,LINC00312-shRNA+KIRA6组细胞增殖活性明显升高,细胞核的碎块致密浓染数量减少,凋亡水平明显降低,cleaved Caspase-3、Bax、GRP78、p-IRE1、p-JNK蛋白表达水平明显降低,而Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论沉默LINC00312可能通过激活内质网IRE1-JNK介导的凋亡途径,并诱导人病理性瘢痕成纤维细胞凋亡。