百合“索邦”病程相关蛋白基因LhSorPR10-2的克隆与分析

病程相关蛋白(Pathogenesis-related Proteins,PR)是植物在受病原物侵染过程中诱导产生的一类蛋白.为研究百合“索邦”PR10基因的生物学功能,本研究在灰霉菌(Botrytis elliptica)处理不同时间的百合“索邦”叶片转录组数据库中筛选获得显著诱导表达的一个病程相关蛋白PR10基因,命名为“LhSorPR10-2”,并对其进行生物信息学分析、表达模式分析及其启动子克隆分析.结果显示:LhSorPR10-2全长761 bp,开放阅读框为474 bp,编码158个氨基酸,等电点为5.72.LhSorPR10-2在百合“索邦”中的表达具有组织特异性,在叶中表达量最高;该基因可被病原菌椭圆葡萄孢(Botrytis elliptica)和尖孢镰刀菌(Fusariumoxy sporum)诱导上调表达,并能被植物激素茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)和乙烯利(ETH)诱导响应以及高温(50℃)和低温(0℃)胁迫诱导表达.另外,启动子区的顺式作用元件分析显示LhSorPR10-2启动子区含有大量与光信号、植物激素、胁迫和分生组织等相关的功能域,推测其可能在生物及非生物胁迫响应过程中发挥重要作用.本研究旨在了解百合“索邦”PR10基因的有关特性及在抗病防御反应中的作用,为今后揭示该基因的抗性分子机制提供理论基础.

病程相关蛋白基因GmPR1-6的克隆及其在大豆抵抗SMV侵染过程中的功能初探

为了探究大豆抵抗大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)侵染的分子调控机制,挖掘抗病相关基因,培育抗病新品种,本研究从清除H2O2前后大豆响应SMV的转录组数据库中筛选得到1个差异表达的大豆病程相关蛋白基因GmPR1-6(Glyma.15G062400.1),利用生物信息学分析并结合实时荧光定量(Real time quantitative,RT-qPCR)技术以及病毒介导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)等技术验证其在大豆抵抗SMV侵染过程中的功能。结果表明,GmPR1-6在非亲组合中转录水平的表达量显著高于亲和组合;GmPR1-6基因沉默植株叶片接种SMV的部位胼胝质积累面积增大、胼胝质荧光强度减弱,病毒在胞间扩散的能力增强,说明GmPR1-6基因在大豆抵抗SMV侵染过程中发挥正调控作用。研究结果为进一步探究病程相关蛋白在大豆抵抗SMV侵染过程中的功能提供试验依据。

条锈菌诱导的小麦病程相关蛋白TaPR10基因的克隆及特征分析

【目的】克隆条锈菌诱导的小麦病程相关蛋白PR10基因,研究其在小麦成株抗条锈病防御反应中的作用。【方法】采用电子克隆、RT-PCR技术,从条锈菌侵染的小麦兴资9104中,分离病程相关蛋白10基因;采用生物信息学技术预测分析该基因的DNA序列结构及其编码蛋白的保守域及基本特性;利用实时荧光定量RT-PCR技术,分析该基因在小麦成株期和苗期受条锈菌CYR32侵染后的表达情况。【结果】分离到病程相关蛋白10基因,命名为TaPR10,ORF长483bp,编码由160个氨基酸组成的蛋白质TaPR10;TaPR10不含跨膜区、无信号肽、定位在胞内,除具有典型的病程相关蛋白Bet_v_I家族保守结构域外,还有其它4类功能保守域;与小麦、高粱、玉米和水稻等4种植物PR10蛋白的氨基酸序列相似性在80%左右;TaPR10 DNA序列内部存在188至271位84bp的内含子序列,其拼接位点序列具有GT-AG双核苷酸序列;TaPR10基因表达分析的结果表明,TaPR10基因在成株期和苗期反应中表达量均上调,成株期表达高于苗期。【结论】首次分离到一个条锈菌CYR32诱导的小麦TaPR10基因,该基因可能参与了小麦成株抗条锈病防御反应。

漾濞大泡核桃病程相关蛋白10基因JsPR10-1的克隆与表达分析

病程相关蛋白(pathogenesis-related protein,PR)10的激活与积累在植物抗逆境胁迫中有非常重要的作用。根据漾濞大泡核桃(Juglans sigillata)编码PR10的EST(expressed sequence tag)序列设计引物,利用快速扩增c DNA末端技术,克隆得到PR10基因的全长c DNA序列,并命名为Js PR10-1。Js PR10-1全长c DNA为776 bp,含有483 bp的开放阅读框、74 bp 5'-非编码区以及219 bp 3'-非编码区,编码含有160个氨基酸的蛋白质。全长基因序列中含有1个124 bp的内含子。Js PR10-1编码的蛋白质与栎树(Quercus suber)、欧洲山毛榉(Fagus sylvatica)以及欧洲板栗(Castanea sativa)的PR10相似性较高,并且在PR10的系统进化树中与双子叶植物聚为一支。qRT-PCR分析结果表明,植物信号分子水杨酸、茉莉酸、乙烯以及过氧化氢处理均可诱导Js PR10-1表达。在接种胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)后,Js PR10-1的表达量迅速上升并在接种8 h时达到最大值,表明Js PR10-1参与漾濞大泡核桃对胶孢炭疽菌的防卫反应。本研究为揭示漾濞大泡核桃抗性机制奠定了理论依据。

烟草病程相关蛋白NtPR10基因克隆与表达分析

为鉴定烟草病程相关蛋白PR10的生物学功能,从普通烟草G28中克隆得到了Nt PR10基因,基因全长483 bp,编码160个氨基酸。基因结构分析表明,该基因编码的蛋白包含病程相关蛋白家族Bet_v_I保守域,具有与核酸酶活性相关的"P-Loop"结构。利用TMHMM、Signal P、Prosite Scan等软件分析发现,Nt PR10不含跨膜区,无信号肽,有胞内定位特征。采用实时荧光定量PCR分别分析了TMV诱导下该基因在抗、感品种枯斑三生和G28中的表达模式。结果表明,在TMV诱导下,Nt PR10基因在感病品种G28中显著上调表达;而在抗病品种枯斑三生中,TMV侵染后6 h,Nt PR10基因显著上调表达,第12小时至第8天显著下调表达,而后至第16天逐渐升高至侵染前水平。综合以上结果,Nt PR10应答了TMV侵染过程,并且在抗、感品种中整体呈现出相反的表达趋势,暗示了Nt PR10在TMV侵染过程中具有重要功能,为深入分析Nt PR10的抗病生物学功能奠定了基础。

植物病程相关蛋白PR10研究进展

PR(pathogenesis related protein)蛋白产生与积累是植物体应答生物或非生物胁迫的主要特征之一。近年来大量PR蛋白被鉴定,根据它们的结构,亲源关系和生物活性,被分为17个功能家族。PR10蛋白具有核酸酶相似结构,一般为分子量16～19kD的酸性蛋白。近年来相关研究表明一些PR10蛋白具有核酸酶活性和体外抗菌活性,在植物防御反应中发挥重要作用,具有较为广泛的应用前景。本文就PR10蛋白的生理功能、基因结构、表达调控及其与植物抗病的关系等方面的最新研究进展作一综述,并结合本实验室工作展望其在植物抗性育种方面的应用前景。

向日葵病程相关蛋白HaPR1基因的克隆与功能

病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins)经常被用作植物抗病反应的分子标记。本文在核盘菌诱导向日葵转录组文库的基础上克隆1个病程相关蛋白1基因Ha PR1的c DNA全长序列,并进行了表达模式和功能分析。结果表明,该基因c DNA全长开放阅读框为489 bp,编码162个氨基酸,分子量为17.52 k D,等电点为8.19,具有6个保守半胱氨酸,4个保守的allergen V5/Tpx-1结构域,Gen Bank登录号为KR071874。经比较Ha PR1与多种物种PR1高度同源。实时荧光定量PCR检测结果表明,Ha PR1相对表达量在向日葵叶中最高,根中其次,茎中最低。干旱、盐、草酸、核盘菌及其代谢物均可显著诱导其表达。利用农杆菌介导法将该基因导入烟草,提高了转基因株系对核盘菌的抗性。对抗性株系烟草防御酶活性及丙二醛含量测定发现转基因烟草叶片在核盘菌胁迫下显著提高了SOD、POD和CAT活性,降低了MDA含量。初步推断Ha PR1具有抗核盘菌的功能。

病程相关蛋白10在植物防御反应中的作用

文章对近几年来与病程相关蛋白10(PR-10)有关的基因的基本特征、在植物中的表达模式、核酸酶活性和抗菌活性PR-10在植物防御系统中的作用研究进展作了介绍。

协同抑制番茄ACO1对果实成熟及病程相关蛋白基因表达的影响

目的探讨协同抑制番茄ACO1基因对果实成熟和病程相关蛋白基因表达、内源乙烯生物合成及果实耐贮性的影响。方法采用PCR或RT-PCR方法克隆了番茄ACC氧化酶1、ACC氧化酶3、EBF1、PR1、PR5以及NP24基因片段,并以此制备探针,以协同抑制ACO1的转基因番茄和野生型番茄为研究对象,进行Northern杂交,同时测定了伤害叶片和果实的乙烯释放量,并进行了果实贮藏试验等。结果Northern杂交结果表明,番茄ACO1基因表达被抑制后,与果实成熟相关基因LeACO3和LeEBF1,以及病程相关蛋白基因LePR1、LePR5和LeNP24的表达量急剧降低。乙烯释放量测定试验和果实贮藏试验结果表明,协同抑制LeACO1番茄完整和受伤叶片以及完整果实内源乙烯释放量相对于野生型番茄大大减少,成熟果实贮藏时间延长。结论协同抑制番茄ACO1基因表达的同时,与果实成熟相关基因和病程相关蛋白基因的表达也不同程度地受到抑制,而且其内源乙烯生物合成减少,果实耐贮性增强。

TcLr35小麦中病程相关蛋白1基因的克隆及分析

根据已发表的植物病程相关蛋白1基因设计引物,利用RT-PCR技术,从被小麦叶锈菌诱导的小麦抗叶锈病基因近等基因系材料TcLr35中获得一个病程相关蛋白1基因cDNA片段,长度为489bp,3′端包含21个poly(A),暂命名为PR12。利用5′RACE技术获得了818bp的PR12全长,该基因包含495bp的开放读码框,147bp的5′非翻译区(non translated region,NTR),155bp的3′非翻译区和21bp的多聚腺苷酸尾。编码164个通读的蛋白质氨基酸序列,基因产物具有植物防御体系中病程相关蛋白SCP保守结构域,与GenBank中多个植物病程相关蛋白1基因具有较高的同源性。Southern杂交显示,该基因在小麦基因组中为单拷贝。

甘蔗ShPR10基因的克隆及其编码蛋白与甘蔗线条花叶病毒P1蛋白的互作研究

病程相关蛋白10(pathogenesis related protein 10,PR10)在植物抵抗病毒侵染中发挥重要作用。前期以甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)编码的RNA沉默抑制子P1为诱饵,筛选获得一个甘蔗ShPR10蛋白。为探究ShPR10在甘蔗应答SCSMV侵染过程中的功能,利用同源克隆技术克隆甘蔗ShPR10基因并对其编码蛋白进行生物信息学分析,利用绿色荧光蛋白融合表达法分析ShPR10蛋白的亚细胞定位,采用酵母双杂交和双分子荧光互补技术验证ShPR10与SCSMV P1的互作关系,采用农杆菌共浸润瞬时表达系统和Western blot技术分析ShPR10对P1沉默抑制子活性的影响。结果显示,甘蔗ShPR10基因开放阅读框全长570 bp,编码一个不稳定亲水蛋白,蛋白分子量为21.17 kD,等电点为4.77,含有一个P-loop基序,不含跨膜结构域和信号肽。ShPR10二级结构包含51.85%的无规则卷曲、35.98%的α-螺旋、7.41%的延伸链和4.76%的β-转角。ShPR10蛋白与玉米ZmPR10蛋白的氨基酸序列相似性高达91.53%,两者在进化树上聚为一个分支。ShPR10定位在细胞质和细胞核,与SCSMV P1在酵母细胞和烟草细胞中存在互作关系。ShPR10本身不具有沉默抑制子活性,其表达削弱了P1的沉默抑制子活性,但对P1蛋白的含量无明显影响。综上,ShPR10可能通过结合P1来削弱P1的沉默抑制子活性,从而提高甘蔗对SCSMV的抗性。

用基因枪法将小麦病程相关蛋白基因TaPR-1导入小麦的研究

为验证小麦病程相关蛋白基因TαPR-1的功能，利用gus基因瞬间表达技术对基因枪法转化小麦幼胚的两个重要参数金粉用量和轰击距离进行了优化。研究结果表明,金粉用量为250．0μg．轰击距离9cm的轰击参数最为理想，GUS瞬间表达率和平均蓝点数分别可达89．8％和33．7个。采用此轰击参数．将TαPR-1基因导入扬麦158幼胚．经3～5mg／L Bialaphos筛选获得49株抗性再生植株．经PCR、Southern杂交分析．其中2株为阳性植株．转化率为0．11％。对转基因小麦植株进行苗期离体叶段和田间成株白粉病接种鉴定．初步结果表明，转基因植株对白粉病抗性与对照相比无明显差别。

植物病程相关蛋白的基因表达调控

植物病程相关蛋白 (PR)的表达在植物抗病反应中具有重要意义 ,是近年来植物抗病研究领域的一个热点。

小麦病程相关蛋白1基因的克隆及特征分析

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从被白粉菌诱导的小麦－簇毛麦６ＶＳ／６ＡＬ易位系中获得病程相关蛋 白１（ＴａＰｒ－１）。ＤＮＡ克隆．该基因具有编码１６４氨基酸的开放阅读框，其中包含２４个氨基酸构 成的信号肽和１４０个氨基酸组成的成熟肽（ＭＷ为１５．１ｋＤ）．经蛋白结构比较分析，发现其与 植物中已分离的多种 ＰＫ类蛋白具一定的同源性。 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示，易位系被诱导 １２小时 左右，该基因转录物累积最多，其在抗病易位系和感病亲本扬５中表达水平有明显差异。 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交表明在小麦基因组中该基因的拷贝数多于１个，且该基因在扬５和易位系中表 现多态性，表明６ＶＳ上有可能携带该基因。

不结球白菜病程相关蛋白基因BcPR5的克隆及表达分析

[目的]本文旨在研究不结球白菜病程相关蛋白基因Bc PR5的结构与表达特征。[方法]通过RACE技术,从抗病品种‘苏州青’叶片克隆到Bc PR5基因的全长c DNA序列。采用RT-q PCR方法分析该基因在霜霉病菌诱导,水杨酸(SA)、茉莉酸(Me J)和脱落酸(ABA)等激素处理条件下的表达模式。SDS-PAGE技术分析该基因的原核表达特征。[结果]Bc PR5基因的c DNA全长为954 bp,其中开放阅读框长度为732 bp,共编码243个氨基酸,相对分子质量为26.1×103,理论等电点是9.3。氨基酸同源系统进化分析表明,不结球白菜Bc PR5基因与同属植物的进化关系相近,其中与大白菜第6号染色体上的基因同源性最高(100%)。RT-q PCR分析表明,抗病品种‘苏州青’和感病品种‘矮脚黄’在霜霉病菌和非生物胁迫(SA、Me J和ABA)诱导过程中,Bc PR5基因的表达量均呈先升高后降低的趋势,且抗病品种高于感病品种。原核表达结果表明,该蛋白在终浓度为1.0 mmol·L-1的IPTG诱导4 h后能实现融合蛋白的高效表达。[结论]Bc PR5在不结球白菜抗霜霉病防御反应中发挥着重要作用,研究结果为该基因的功能验证提供理论基础。

低温诱导湖北海棠病程相关蛋白基因家族MhPRs的表达

以湖北海棠组培苗为材料,利用半定量RT-PCR研究了低温4℃处理后湖北海棠MhNPR 1、MhT-GA2以及病程相关蛋白基因家族成员(MhPR 1、MhPR 5、MhPR8和Mhchit 1)基因的表达量。结果表明:低温处理可以诱导这些基因的表达,并且所有基因的表达量在48 h达到最大。可以推测:(1)低温作为一种逆境条件,可能使植物体内SA含量提高,诱导MhNPR1基因表达,使NPR1蛋白从细胞质进入细胞核,与TGA类转录因子相互作用,诱导下游病程相关蛋白基因表达;(2)低温可能直接诱导病程相关蛋白基因表达。

烟草病程相关蛋白基因启动子的克隆及序列分析

在植物的防御反应中 ,会诱导产生一些宿主编码的蛋白 ,叫做病程相关蛋白。该文通过PCR扩增 ,从烟草 (Nicotianatabacumcv.Samsun)中克隆了水扬酸诱导表达的PR - 1a基因的两个启动子TP12及TP13。以期用于构建诱导表达基因敲除系统 ,并用于无性繁殖植物的无标记基因转化。序列分析表明 ,启动子TP12含 1313个核苷酸 ,与已报道的序列比较 ,核苷酸的同源性为 98.6 % ;TP13含 6 5 4个核苷酸 ,与已报道的序列比较 ,核苷酸的同源性为 99.4 %。

桑树病程相关蛋白基因MuPR1-2的克隆及功能分析

病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins,PRs)是植物体内受病原物或其他环境因子胁迫而诱导表达的一类蛋白质,在植物抗病反应过程中起着非常重要的作用。在桑树叶片中扩增得到MuPR1-2基因(Gen Bank登录号:KC453994),该基因编码区全长609 bp,编码蛋白质含有202个氨基酸,具有一个典型的信号肽和PR蛋白结构域以及PR1蛋白所共有的α-β-α夹心结构。将Mu PR1-2与绿色荧光蛋白基因gfp融合转入拟南芥,通过对转基因拟南芥根尖的显微结构观察,证明MuPR1-2蛋白定位于细胞壁或分泌到细胞间隙。转入MuPR1-2基因的拟南芥对丁香假单胞菌番茄致病变种(Pst DC3000)和灰霉菌具有较强的抵抗能力,表明Mu PR1-2在植物防御功能中具有重要作用。

植物病程相关蛋白PR10研究进展

植物病程蛋白是植物受生物或非生物胁迫后诱导产生并积累的一类蛋白质总称,是植物防卫体系的重要组成部分。近年来,根据它们的结构、亲源关系和生物活性,PR蛋白主要分为17个功能家族。PR10蛋白是具有核酸酶相似结构,一般为分子量15～19 kDa的酸性蛋白。近年来相关研究表明,一些PR10蛋白具有核酸酶活性和体外抗菌功能,在植物防御反应中发挥重要作用,具有较为广泛的应用前景。为此,就PR10蛋白的基因结构、表达模式、核酸酶活性、抗病机制、在转基因方面应用等方面的最新研究进展并结合本实验室工作进行综述,为其在植物抗性育种方面的应用提供参考。

利用农杆菌介导法快速鉴定小麦病程相关蛋白基因TaPR1的功能

本研究拟采用农杆菌瞬时表达体系,在小麦叶片中快速表达目的基因,以鉴定其在小麦抗叶锈病防御反应中的功能。在前期研究基础上,将已克隆获得的小麦病程相关蛋白基因TaPR1构建到小麦过表达载体pLGY-02,转化农杆菌菌株GV3101。然后以感病小麦品种‘金禾9123’为试材,将携带pLGY-02-TaPR1重组质粒的农杆菌GV3101注射到小麦叶片中,以空载体pLGY-02为对照。3 d后接种叶锈菌,14 d后观察小麦叶片表型。同时,在接菌后24、36、48 h时分别采集小麦叶片材料,利用DAB组织化学染色法,监测接种叶锈菌后叶片中H_2O_2的变化,并通过组织病理学显微观察,快速验证TaPR1在小麦与锈菌互作过程中的功能。结果发现,注射重组质粒pLGY-02-TaPR1的叶片发病程度、叶片孢子堆数均轻于、少于对照组叶片,且发病滞后;DAB组织化学染色结果表明,TaPR1表达量增加使得H_2O_2的清除在一定程度上受到抑制,小麦叶片中H_2O_2的分布与积累量均显著多于对照组叶片,说明TaPR1对小麦叶锈菌的致病性具有抑制作用,即TaPR1基因参与了小麦抗叶锈病防御反应。本研究成功构建了能在小麦中瞬时表达的重组载体pLGY-02-TaPR1,并建立了农杆菌介导的在小麦叶片细胞中高效表达外源基因的转化体系,为利用瞬时表达法验证小麦抗性基因功能奠定了基础。