本生烟病程相关蛋白PR-10的原核表达及抗血清制备

病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins,PRs)是植物受生物或非生物胁迫后诱导并积累的一类蛋白质,具有抗病抗逆的多种功能。为检测本生烟病程相关蛋白10(Nicotiana benthamiana Pathogenesis-related protein 10,NbPR10)的表达,制备其抗血清,并用以探究其可能的特性和功能。将已有的NbPR10基因构建到原核表达载体p GEX-KG中获得重组质粒p GEXKG-NbPR10,转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.2 m M IPTG诱导表达分子量约44 k Da的融合蛋白(含GST标签),用GST亲和柱纯化获得纯化的融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔制备NbPR10蛋白的抗血清,经Western blot测定抗血清效价达1∶10 000,能至多检测到稀释比例为1∶320的转基因本生烟叶片中的PR10蛋白或1 ng原核表达的蛋白,且能检测到本生烟根和茎中的PR10蛋白,证明PR10在本生烟根和茎中表达量较在叶部高,为进一步研究NbPR10蛋白的功能提供参考。

病程相关蛋白10在植物防御反应中的作用

文章对近几年来与病程相关蛋白10(PR-10)有关的基因的基本特征、在植物中的表达模式、核酸酶活性和抗菌活性PR-10在植物防御系统中的作用研究进展作了介绍。

植物病程相关蛋白PR10研究进展

PR(pathogenesis related protein)蛋白产生与积累是植物体应答生物或非生物胁迫的主要特征之一。近年来大量PR蛋白被鉴定,根据它们的结构,亲源关系和生物活性,被分为17个功能家族。PR10蛋白具有核酸酶相似结构,一般为分子量16～19kD的酸性蛋白。近年来相关研究表明一些PR10蛋白具有核酸酶活性和体外抗菌活性,在植物防御反应中发挥重要作用,具有较为广泛的应用前景。本文就PR10蛋白的生理功能、基因结构、表达调控及其与植物抗病的关系等方面的最新研究进展作一综述,并结合本实验室工作展望其在植物抗性育种方面的应用前景。

漾濞大泡核桃病程相关蛋白10基因JsPR10-1的克隆与表达分析

病程相关蛋白(pathogenesis-related protein,PR)10的激活与积累在植物抗逆境胁迫中有非常重要的作用。根据漾濞大泡核桃(Juglans sigillata)编码PR10的EST(expressed sequence tag)序列设计引物,利用快速扩增c DNA末端技术,克隆得到PR10基因的全长c DNA序列,并命名为Js PR10-1。Js PR10-1全长c DNA为776 bp,含有483 bp的开放阅读框、74 bp 5'-非编码区以及219 bp 3'-非编码区,编码含有160个氨基酸的蛋白质。全长基因序列中含有1个124 bp的内含子。Js PR10-1编码的蛋白质与栎树(Quercus suber)、欧洲山毛榉(Fagus sylvatica)以及欧洲板栗(Castanea sativa)的PR10相似性较高,并且在PR10的系统进化树中与双子叶植物聚为一支。qRT-PCR分析结果表明,植物信号分子水杨酸、茉莉酸、乙烯以及过氧化氢处理均可诱导Js PR10-1表达。在接种胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)后,Js PR10-1的表达量迅速上升并在接种8 h时达到最大值,表明Js PR10-1参与漾濞大泡核桃对胶孢炭疽菌的防卫反应。本研究为揭示漾濞大泡核桃抗性机制奠定了理论依据。

烟草病程相关蛋白NtPR10基因克隆与表达分析

为鉴定烟草病程相关蛋白PR10的生物学功能,从普通烟草G28中克隆得到了Nt PR10基因,基因全长483 bp,编码160个氨基酸。基因结构分析表明,该基因编码的蛋白包含病程相关蛋白家族Bet_v_I保守域,具有与核酸酶活性相关的"P-Loop"结构。利用TMHMM、Signal P、Prosite Scan等软件分析发现,Nt PR10不含跨膜区,无信号肽,有胞内定位特征。采用实时荧光定量PCR分别分析了TMV诱导下该基因在抗、感品种枯斑三生和G28中的表达模式。结果表明,在TMV诱导下,Nt PR10基因在感病品种G28中显著上调表达;而在抗病品种枯斑三生中,TMV侵染后6 h,Nt PR10基因显著上调表达,第12小时至第8天显著下调表达,而后至第16天逐渐升高至侵染前水平。综合以上结果,Nt PR10应答了TMV侵染过程,并且在抗、感品种中整体呈现出相反的表达趋势,暗示了Nt PR10在TMV侵染过程中具有重要功能,为深入分析Nt PR10的抗病生物学功能奠定了基础。

植物病程相关蛋白PR10研究进展

植物病程蛋白是植物受生物或非生物胁迫后诱导产生并积累的一类蛋白质总称,是植物防卫体系的重要组成部分。近年来,根据它们的结构、亲源关系和生物活性,PR蛋白主要分为17个功能家族。PR10蛋白是具有核酸酶相似结构,一般为分子量15～19 kDa的酸性蛋白。近年来相关研究表明,一些PR10蛋白具有核酸酶活性和体外抗菌功能,在植物防御反应中发挥重要作用,具有较为广泛的应用前景。为此,就PR10蛋白的基因结构、表达模式、核酸酶活性、抗病机制、在转基因方面应用等方面的最新研究进展并结合本实验室工作进行综述,为其在植物抗性育种方面的应用提供参考。

盐穗木病程相关蛋白HcPR10抗血清的制备及鉴定

病程相关蛋白(PRs)在植物抗病抗逆过程中发挥重要作用。盐穗木病程相关蛋白基因HcPR10(GenBank:KF673356)来自盐穗木(Halostachys capsica)在600 mmol·L^-1NaCl胁迫下的盐抑制差减文库。为探究盐穗木病程相关蛋白HcPR10发挥生物学功能的机制,该研究通过体外表达和纯化HcPR10重组蛋白制备特异性的HcPR10多克隆抗体。并采用双酶切构建原核重组表达载体pET28a-HcPR10,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21诱导表达,通过正交分析优化重组蛋白可溶性诱导表达的条件,利用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,基于纯化获得的His-HcPR10重组蛋白和转HcPR10拟南芥总蛋白,分别利用ELISA和Western Blotting检测抗血清效价和特异性。结果表明:成功构建重组表达载体pET28a-HcPR10;正交结果显示诱导温度27℃,诱导转速200 r·min^-1,IPTG浓度0.7 mmol·L^-1,诱导时间6 h条件下可诱导表达大量可溶性目的蛋白;ELISA检测抗HcPR10血清效价达1∶243000,Western Blotting印迹结果显示制备的抗血清可以与重组蛋白和转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)中异源表达的HcPR10蛋白特异性结合。该研究获得了效价高、特异性强的盐穗木病程相关蛋白HcPR10抗血清,为进一步研究HcPR10的亚细胞定位及生物学功能奠定了基础。

黄芪中一种新的PR-10蛋白的纯化和性质

为了进一步研究蒙古黄芪(Astragalus mongholicusBunge)中的蛋白质及其功能,通过金属离子螯合层析、离子交换层析和凝胶过滤得到一种新蛋白(AmPR-10),并对其部分性质进行了研究。AmPR-10在SDS-PAGE上的分子质量为17.2 ku,凝胶过滤层析测得分子质量为32.6 ku,说明其为同源二聚体。糖蛋白染色显示为糖蛋白,总糖含量为13.7%,离子交换色谱法分析其中含有73%阿拉伯糖、15%葡萄糖、微量的果糖和一种未知糖;N-端序列分析结果显示其与病程相关蛋白家族PR-10中黄羽扇豆L1PR-10.1C同源性高达80%。同时,AmPR-10具有核糖核酸酶活性,纯AmPR-10的核糖核酸酶比活性为74.11 U/mg,这点与一些PR-10蛋白类似。

甘蔗ShPR10基因的克隆及其编码蛋白与甘蔗线条花叶病毒P1蛋白的互作研究

病程相关蛋白10(pathogenesis related protein 10,PR10)在植物抵抗病毒侵染中发挥重要作用。前期以甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)编码的RNA沉默抑制子P1为诱饵,筛选获得一个甘蔗ShPR10蛋白。为探究ShPR10在甘蔗应答SCSMV侵染过程中的功能,利用同源克隆技术克隆甘蔗ShPR10基因并对其编码蛋白进行生物信息学分析,利用绿色荧光蛋白融合表达法分析ShPR10蛋白的亚细胞定位,采用酵母双杂交和双分子荧光互补技术验证ShPR10与SCSMV P1的互作关系,采用农杆菌共浸润瞬时表达系统和Western blot技术分析ShPR10对P1沉默抑制子活性的影响。结果显示,甘蔗ShPR10基因开放阅读框全长570 bp,编码一个不稳定亲水蛋白,蛋白分子量为21.17 kD,等电点为4.77,含有一个P-loop基序,不含跨膜结构域和信号肽。ShPR10二级结构包含51.85%的无规则卷曲、35.98%的α-螺旋、7.41%的延伸链和4.76%的β-转角。ShPR10蛋白与玉米ZmPR10蛋白的氨基酸序列相似性高达91.53%,两者在进化树上聚为一个分支。ShPR10定位在细胞质和细胞核,与SCSMV P1在酵母细胞和烟草细胞中存在互作关系。ShPR10本身不具有沉默抑制子活性,其表达削弱了P1的沉默抑制子活性,但对P1蛋白的含量无明显影响。综上,ShPR10可能通过结合P1来削弱P1的沉默抑制子活性,从而提高甘蔗对SCSMV的抗性。

水稻PR10a基因启动子的克隆及其活性检测

从水稻中克隆得到病程相关蛋白10a基因的启动子PR10aP,构建该启动子驱动的可溶性绿色荧光蛋白基因(smGFP)的植物表达载体p3300-PR10aP-GFP,并用农杆菌介导法将其导入烟草,检测转基因植株经水杨酸(SA)诱导前后GFP的表达水平。序列分析表明PR10aP长度为1182bp,与已经报道的序列存在4个碱基的差别,含已报道序列的顺式作用元件,如水杨酸相关的W-box、ACGT序列等,也有增强子as-a-like元件及CAAT、TATA等常见应答元件。PCR检测结果显示,成功地获得了转基因烟草,荧光检测表明启动子PR10aP在正常条件下不表现活性,而在水杨酸诱导下GFP表达,证明新获得的水稻病程相关蛋白10a的启动子PR10aP具有水杨酸诱导性。

抗病基因VpPR10转化‘砀山酥梨’及转化条件的优化

将源自中国野生华东葡萄的抗病基因——病程相关蛋白基因导入‘砀山酥梨’,并对转化系统条件进行优化。首先将VpPR10基因重组于中间表达载体pWR-Ⅱ,得到重组质粒pWR-Ⅱ-VpPR10;继而以改进冻融法将其导入根癌农杆菌EHA105,再利用根癌农杆菌介导的叶盘转化法进行遗传转化。根癌农杆菌浓度OD600=0.5,离体叶片侵染5min,在含有100μmol·L-1乙酰丁香酮的培养基中暗处共培养48h有利于砀山酥梨的遗传转化;经PCR分析、Southern blot和RT-PCR检测,证明目的基因VpPR10已导入并整合到砀山酥梨基因组中;转化率为1.08%。