共表达猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒NJ-a株ORF4、ORF5与ORF6基因重组改良型痘苗病毒安卡拉株的构建

为探讨共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinerep roductive and respiratory syndrome Virus,PRRSV)保护性抗原基因的重组改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified Vaccinia Virus Ankala,MVA)的免疫效力,将PRRSVNJ-a株ORF4、ORF5和ORF6基因插入转移载体pⅡLR中,获得了三基因共表达的转移载体pⅡLR-ORF5/ORF6/ORF4,通过同源重组的方法获得重组病毒rMVA-GP5/M/GP4。以lacZ为报告基因进行噬斑筛选和重组病毒纯化后,PCR方法证明ORF4、ORF5和ORF6成功的插入MVA基因组中;经Western blot检测与间接免疫荧光试验证实,重组病毒感染细胞能正确表达PRRSVGP4、GP5与M蛋白。用rMVA-GP5/M/GP4免疫6周龄Babl/C小鼠,首免后3周可检测到特异性PRRSV中和抗体,8周后中和抗体效价可达25,并能继续维持4周;淋巴细胞增殖试验结果表明,重组病毒免疫小鼠产生强烈的特异性细胞增殖反应。上述研究结果表明rMVA-GP5/M/GP4具有良好的免疫原性,可作为预防PRRS的候选疫苗进一步研究。

基于改良型痘苗病毒安卡拉株载体的新型流感疫苗研究进展

流感是由流感病毒引起的一种严重危害公众健康的呼吸道传染病,已引起全球的高度关注,接种疫苗是预防流感最有效的措施。当前,建立快速流感疫苗研发生产平台对于流感的预防与控制至关重要。以病毒为载体的活疫苗为感染性疾病的防控提供了新的手段。改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified Vaccinia virus Ankara,MVA)是一种复制缺陷型病毒载体。MVA能够同时容纳并表达多个外源抗原、诱导较好的体液和细胞免疫应答并具备良好的安全性,具有成为理想疫苗载体的潜力。本文就MVA载体在流感疫苗研究中的应用做一综述。

共表达PRRSV修饰的GP5与M蛋白的重组改良型痘苗病毒安卡拉株的构建及其生物学特性

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)修饰的ORF5(MORF5)与ORF6基因分别克隆入笔者构建的改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified vaccinia virus ankara,MVA)转移载体pLR-gpt的两个多克隆位点中,构建重组转移载体pLR-MORF5/ORF6。经脂质体介导,将构建好的pLR-MORF5/ORF6转染已感染亲本MVA2h的BHK-21细胞单层,用药物选择性培养基(MXHAT)在24孔板上进行连续筛选纯化,得到带有筛选标记的重组病毒rMVAgpt-MGP5/M。将rMVAgpt-MGP5/M感染表达Cre重组酶的BHK-21细胞(BHK-Cre),获得删除筛选标记的重组病毒rMVA-MGP5/M。PCR证明MORF5与ORF6成功插入MVA基因组中;Western blotting与间接免疫荧光证明重组病毒能表达MGP5与M蛋白;重组病毒的生长特性表明与亲本MVA出现病变的时间及病毒滴度基本一致。结果表明,本研究成功构建了共表达PRRSVMGP5与M蛋白的重组MVA,并且表达产物具有免疫原性;外源基因的插入不影响MVA复制,具较好的稳定性,从而为PRRSV新型基因工程疫苗的研制奠定了良好的基础。

非复制型痘苗病毒的生物学性状研究进展

痘病毒被广泛用于针对多种感染性疾病和癌症的疫苗研究,而非复制型痘苗病毒的发展又进一步提高了其安全性。来源于中国天花疫苗株的复制缺陷型痘苗病毒天坛株(NTV)正是一株非复制型痘苗病毒。为了促进未来NTV作为疫苗候选株在临床中的应用,我们对NTV与另外2株非复制型痘苗病毒,即改良痘苗病毒安卡拉株(MVA)和NYVAC的生物学性状做简要综述,主要讨论了它们的基因组结构、体外生长特性、病毒复制和形态发生、组织中的病毒分布和病毒-宿主细胞间的相互作用。

重组嵌合腺病毒35型和重组痘苗病毒SIV疫苗在小鼠体内联合免疫的实验研究

目的研究嵌合腺病毒35型载体和痘苗病毒载体SIVenvT疫苗通过不同策略联合免疫小鼠所诱导的细胞和体液免疫应答。方法通过PCR和Western blot方法对表达SIV mac239株SIVenvT基因的重组嵌合腺病毒35型(rAd5F35-SIVenvT)和重组痘苗病毒安卡拉株(rMVA-SIVenvT)进行体外鉴定。采用两种不同的策略联合免疫BALB/c小鼠,即同源载体免疫和异源载体免疫。通过ELISPOT方法检测小鼠脾脏中分泌SIV Env特异性IFN-γ的淋巴细胞数量,ELISA方法检测血清SIV gp120抗体滴度,比较两种免疫策略诱导小鼠产生细胞和体液免疫应答的差异。结果rAd5F35-SIVenvT和rMVA-SIVenvT均能在HEK293细胞中有效表达SIVenvT蛋白。初次免疫后第4周,两组SIV Env特异性细胞免疫应答和SIV gp120抗体均达到峰值,随后呈波动下降趋势。异源免疫组诱导小鼠的应答水平高于同源组,其中第4周和第16周异源组细胞免疫应答强度显著高于同源组,第4周异源组SIV gp120抗体滴度显著高于同源组。结论rAd5F35-SIVenvT和rMVA-SIVenvT两种载体疫苗联合免疫策略能诱导小鼠产生较强细胞和体液免疫应答。

重组病毒MVA-S的构建及其在小鼠中的免疫效果

目的 构建表达HBsAg重组MVA病毒,鉴定其抗原性并探讨不同免疫策略对免疫效果的影响.方法 通过基因克隆的方法构建携带目的基因的重组pSC11质粒,该重组质粒与MVA病毒共转染BHK-21细胞后,发生同源重组,经数轮蓝白斑筛选后,获得携带目的基因的重组病毒MVA-S.通过PCR和Western Blot鉴定目的基因的表达.分别采用单独免疫和联合免疫的策略免疫BALB/c小鼠,通过ELISpot检测细胞免疫水平.结果 PCR和Western Blot证实MVA-S携带目的基因并具有抗原性.ELISpot结果显示MVA-S能诱导小鼠产生特异性细胞免疫,MVA-S与DNA-S疫苗单独免疫效果无统计学差异;DNA-S疫苗和MVA-S联合免疫效果强于DNA-S疫苗单独免疫;等剂量DNA-S疫苗初始免疫,高剂量MVA-S加强免疫效果更强;2种DNA疫苗（pVR-S、pcDNA-S）分别初始免疫、等剂量MVA-S加强免疫,组间差异无统计学意义.结论 研究成功构建了表达目的基因的重组病毒MVA-S,该重组病毒可诱导小鼠产生特异性细胞免疫,联合免疫效果更强.