miR⁃7靶向调控CTSK对贵州黑山羊卵巢颗粒细胞增殖和迁移的影响

【目的】探明miR⁃7与CTSK基因相互作用关系及其对贵州黑山羊卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响,为贵州黑山羊优良品种保藏、选育与开发利用提供依据。【方法】采用在线数据库筛选miR⁃7与CTSK基因3′UTR的结合靶点,通过将CTSK基因3′UTR插入双荧光素酶报告系统中进行互作位点检测;采用CCK⁃8和划痕试验检测miR⁃7是否靶向调控CTSK基因影响贵州黑山羊卵巢颗粒细胞的增殖和迁移;过表达miR⁃7后采用RT⁃qPCR检测其对促增殖蛋白PCNA、抗凋亡蛋白BCL2和促凋亡相关蛋白BAX、caspase⁃3、caspase⁃9表达水平的影响。【结果】成功构建CTSK基因3′⁃UTR 2个预测靶点的野生型和突变型双荧光素酶报告载体;双荧光素酶试验结果表明CTSK基因3′UTR区的2个预测靶位点均受miR⁃7调控;CCK⁃8和细胞划痕结果表明,转染miR⁃7试验组的卵巢颗粒细胞增殖和迁移能力均显著高于对照(NC)组;RT⁃qPCR结果表明,上调miR⁃7能极显著上调PCNA和BCL2的表达,抑制BAX、caspase⁃3和caspase⁃9的表达。【结论】miR⁃7可以靶向结合CTSK的3′UTR区2个靶位点并极显著抑制CTSK基因的表达;过表达miR⁃7可以显著促进贵州黑山羊卵巢颗粒细胞增殖和迁移能力,并促进增殖标志基因、抗凋亡基因的表达和抑制促凋亡相关基因的表达。研究结果可为进一步研究miR⁃7靶向调控CTSK表达影响贵州黑山羊繁殖性能的分子机制提供理论依据。

微RNA-93-5p对多囊卵巢综合征患者卵巢颗粒细胞增殖的影响及机制

目的探讨血浆微RNA(miR)-93-5p对多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵巢颗粒细胞增殖的影响及其可能机制。方法选择2022年1月至2023年1月焦作市人民医院收治的120例育龄期PCOS患者为PCOS组,选择同期在本院体检的18例育龄期健康女性为对照组。收集2组受试者的年龄、体质量和身高,计算体质量指数(BMI)。2组受试者均在自然月经周期的卵泡期或黄体酮诱导的撤退性出血期采集空腹静脉血,采用电化学法测定血清黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)、总睾酮(TT)、抗米勒管激素(AMH)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、空腹胰岛素(FINS)、空腹血糖(FBG)水平,并计算胰岛素抵抗稳态模型(HOMA-IR);采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测2组受试者血浆中miR-93-5p表达水平。取对数生长期人卵巢颗粒细胞KGN,以每孔3×10^(5)个细胞接种至6孔板中,随机分为miR-93-5p mimics组、LY294002+miR-93-5p组、AZD5363+miR-93-5p组、阴性对照(NC)组、空白对照组。miR-93-5p组KGN细胞转染miR-93-5p mimics;LY294002+miR-93-5p组KGN细胞转染miR-93-5p mimics,并于转染前1 h给予50 mmol·L^(-1) LY294002处理;AZD5363+miR-93-5p组KGN细胞转染miR-93-5p mimics,并于转染前1 h给予50μmol·L^(-1) AZD5363处理;NC组KGN细胞转染阴性对照质粒;空白对照组KGN细胞不做任何处理。应用qRT-PCR法检测各组KGN细胞中miR-93-5p表达,细胞计数试剂盒-8试验检测各组KGN细胞增殖情况。结果PCOS组与对照组受试者的年龄及FSH、ALT、AST水平比较差异无统计学意义(P>0.05);PCOS组患者的BMI、TT、AMH、LH、FINS、FBG、HOMA-IR显著高于对照组(P<0.05)。PCOS组患者血浆中miR-93-5p相对表达量显著高于对照组(t=-5.549,P<0.001)。miR-93-5p与TT、FINS、HOMA-IR呈中度正相关(r=0.434、0.622、0.586,P<0.001),与FBG和LH呈低度正相关(r=0.398、0.398,P<0.001)。ROC曲线显示,血浆miR-93-5p诊断PCOS的最佳临界值为1.380,曲线下面积为0.906(95%置信区间:0.839~0.973,P<0.001),敏感度为0.858,特异度为0.833,约登指数为0.691。miR-93-5p mimics组、LY294002+miR-93-5p组、AZD5363+miR-93-5p组KGN细胞中miR-93-5p相对表达量均显著高于空白对照组和NC组(P<0.05)。培养24、48、72 h时,miR-93-5p mimics组、LY294002+miR-93-5p组、AZD5363+miR-93-5p组KGN细胞的增殖能力显著高于空白对照组和NC组(P<0.05);LY294002+miR-93-5p组、AZD5363+miR-93-5p组细胞的增殖能力显著低于miR-93-5p mimics组(P<0.05)。结论PCOS患者血浆miR-93-5p呈过表达,miR-93-5p可能通过基于调控磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激B信号通路介导PCOS卵巢颗粒细胞增殖来参与PCOS的发生发展,血浆miR-93-5p水平对PCOS有一定的诊断价值。

雄激素受体抑制剂恩杂鲁胺对山羊卵泡颗粒细胞增殖凋亡的影响

旨在通过使用恩杂鲁胺探究雄激素受体(AR)对山羊卵泡颗粒细胞增殖凋亡的影响。本研究首先对山羊卵泡颗粒细胞进行体外分离培养,然后利用显微镜观察和CCK8探究颗粒细胞的恩杂鲁胺适合培养浓度;之后将试验分为3个组,即空白对照组(不做处理)、阴性对照组(DMSO处理)和试验组(恩杂鲁胺处理),每个组均设置3个重复;然后利用EDU检测颗粒细胞的增殖情况,使用Caspase3活性与细胞凋亡检测试剂盒检测颗粒细胞的凋亡情况,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测颗粒细胞增殖凋亡相关基因和蛋白的表达情况。结果表明,AR抑制剂恩杂鲁胺能够显著地抑制颗粒细胞的增殖和降低颗粒细胞中CCND1、PCNA和MKI67基因的mRNA水平,并且还能够显著抑制CCND1、PCNA和β-catenin蛋白的表达;此外,恩杂鲁胺还能够促进山羊卵泡颗粒细胞的凋亡,显著提高山羊卵泡颗粒细胞中BAX和BCL2的mRNA水平,但不影响BAX和BCL2的蛋白表达,另外恩杂鲁胺虽然没有影响CASP3基因的mRNA水平但能够提高Caspase 3的活性。这些结果表明,恩杂鲁胺抑制AR活性后能够影响颗粒细胞中β-catenin、PCNA、CCND1、Caspase 3等的表达,参与调控颗粒细胞的增殖凋亡。

原花青素对体外培养牛卵泡颗粒细胞增殖及其类固醇合成与分泌功能的影响

【目的】探究原花青素(proanthocyanidins,PC)对体外培养的牛卵泡颗粒细胞(granulosa cells,GCs)增殖及其类固醇合成与分泌功能的影响。【方法】采集性成熟荷斯坦奶牛卵巢组织,分离卵泡GCs,使用免疫荧光对其进行鉴定。用不同质量浓度(10,30,50,70和90μg/mL)的PC对牛卵泡GCs作用不同时间(12,24和48 h)后,测定GCs存活率。以β-actin为内参基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测10,50和90μg/mL PC对牛卵泡GCs周期相关基因(CCND1和CCND2)、凋亡相关基因(caspase-3、caspase-9和Bim)以及类固醇激素合成相关基因(CYP19A1、CYP11A1、STAR和3β-HSD)相对表达量的影响,并检测培养上清液中类固醇激素(雌二醇(E_(2))和孕酮(P_(4)))的浓度。【结果】分离获得了纯度较高的牛卵泡GCs。当PC质量浓度为50μg/mL且培养24 h时,牛卵泡GCs的存活率最高。当PC质量浓度为50μg/mL时,牛卵泡GCs周期相关基因CCND1和CCND2相对表达量均极显著升高(P<0.01);凋亡相关基因caspase-3和caspase-9相对表达量均极显著降低(P<0.01),Bim相对表达量显著降低(P<0.05);E_(2)和P_(4)浓度均极显著增加(P<0.01);类固醇激素合成相关基因CYP19A1、CYP11A1、STAR和3β-HSD相对表达量均极显著升高(P<0.01)。当PC质量浓度为10μg/mL时,牛卵泡GCs凋亡相关基因caspase-3的相对表达量显著降低(P<0.05);P_(4)浓度显著增加(P<0.05);CYP19A1和3β-HSD相对表达量均显著升高(P<0.05),CYP11A1和STAR相对表达量均极显著升高(P<0.01)。当PC质量浓度为90μg/mL时,E_(2)浓度显著增加(P<0.05),P_(4)浓度极显著增加P<0.01);CYP19A1、CYP11A1、STAR和3β-HSD相对表达量均极显著升高(P<0.01)。【结论】50μg/mL PC通过促进牛卵泡GCs周期相关基因的表达和抑制凋亡相关基因的表达而促进牛卵泡GCs的增殖。10~90μg/mL PC通过促进类固醇激素合成相关基因的表达而促进了牛卵泡GCs合成和分泌类固醇激素,进而影响牛卵泡GCs类固醇激素合成与分泌功能。

L-半胱氨酸对绵羊卵巢颗粒细胞增殖、凋亡和类固醇激素分泌的影响

旨在探讨L-半胱氨酸(L-Cys)对体外培养绵羊卵巢颗粒细胞(GCs)增殖、凋亡和类固醇分泌的影响。本研究采集1~1.5岁龄体重相近饲养条件相同的30只健康性成熟小尾寒羊母羊新鲜卵巢,从优势卵泡(2~8 mm)中收集GCs,随机分为5组,每组6个重复,各组添加L-Cys浓度分别为0、100、300、500和700μmol·L^(-1),培养48 h后用CCK-8试剂盒进行细胞增殖活力测定,Annexin V-FITC/PI流式细胞仪检测GCs的凋亡情况,采用ELISA检测GCs培养液上清中孕酮和雌二醇的分泌水平并采用实时荧光定量PCR和Western blot分析L-Cys对绵羊颗粒细胞增殖相关基因(PCNA、CCND2、CCNB 1)、凋亡相关基因(BAX、Caspase-3、Bcl-2)和类固醇分泌相关基因的(STAR、3β-HSD、CYP 11A1、CYP 19A1)mRNA和蛋白表达的影响。结果显示,100、300和500μmol·L^(-1)组的L-Cys均可显著促进绵羊GCs的增殖活力(P<0.05),并显著抑制其凋亡率(P<0.05)。添加300μmol·L^(-1)的L-Cys显著抑制了孕酮(P 4,P<0.05)的分泌。进一步研究发现,300μmol·L^(-1)和500μmol·L^(-1)组的L-Cys可以上调增殖相关基因(PCNA、CCND2、CCNB 1)mRNA表达水平,其中300μmol·L^(-1)组的增殖蛋白(PCNA、CCND2、CCNB1)表达量显著上升(P<0.05);100μmol·L^(-1)和300μmol·L^(-1)组显著下调凋亡相关基因(BAX、Caspase-3)mRNA(P<0.05)及其蛋白表达水平(P<0.05)。添加300μmol·L^(-1)L-Cys显著降低了类固醇相关基因(STAR、3β-HSD)mRNA及蛋白表达水平(P<0.05),添加100μmol·L^(-1)和300μmol·L^(-1)L-Cys显著升高了类固醇相关基因(CYP 11A1、CYP 19A1)mRNA(P<0.05)及其蛋白表达水平(P<0.05)。综上,L-Cys通过上调基因PCNA、CCNB1、CCND2、Bcl-2 mRNA及其蛋白表达、下调基因BAX、Caspase-3 mRNA及其蛋白表达,促进绵羊GCs增殖,抑制其凋亡;L-Cys通过下调基因STAR、3β-HSD mRNA及其蛋白表达以及上调基因CYP 11A1 mRNA及其蛋白表达抑制P 4的分泌。

circRAF1调节人卵巢颗粒细胞的增殖与凋亡

目的探讨circRAF1在早发性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency,POI)中的表达及对人卵巢颗粒细胞(GCs)系(KGN细胞)增殖、凋亡的影响。方法RT-qPCR检测正常卵巢储备功能的患者(n=50)和POI患者(n=50)卵巢GCs及血清中circRAF1的表达,并分析其与卵巢储备功能指标的相关性;构建针对circRAF1的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染至KGN细胞;利用CCK-8、EdU实验检测细胞增殖,JC-1、Tunel实验检测细胞凋亡;RT-qPCR和WB检测细胞增殖与凋亡相关基因(FSHR、PCNA、Bcl-2、Casp-9、Bax)的表达。结果circRAF1在POI患者GCs及血清中表达下降,circRAF1的表达与血清中基础E2和AMH水平呈正相关(P<0.001),而与血清中基础FSH、LH水平呈负相关(P<0.001),同时,circRAF1的表达与AFC呈正相关(P<0.001)。干扰circRAF1的表达可抑制KGN细胞的增殖,促进其凋亡。结论POI患者GCs及血清中的circRAF1表达下调,且与卵巢储备功能下降有关;干扰circRAF1可以抑制GCs增殖,促进其凋亡。

经后增殖方含药血清对超排卵大鼠卵巢颗粒细胞GDF9表达及凋亡的调控机制

【目的】观察益气血法经后增殖方含药血清对超排卵大鼠卵巢颗粒细胞生长分化因子9(GDF9)表达及凋亡的调控机制。【方法】制备超排卵大鼠血清(空白血清)和经后增殖方灌胃的超排卵大鼠血清(含药血清)。建立控制性超排卵(COH)大鼠模型,收集卵巢颗粒细胞。实验分为5组:空白血清组,含药血清组,含药血清+SB203580[p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)抑制剂]组,含药血清+PDTC[核转录因子κB(NF-κB)抑制剂]组,含药血清+SB203580+PDTC组。采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测p38MAPK、酪蛋白激酶2(CK2)、核转录因子κB抑制因子α(IκBα)、NF-κB、GDF9 mRNA表达水平,蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测GDF9蛋白表达水平,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测卵巢颗粒细胞凋亡。【结果】经后增殖方含药血清降低COH大鼠卵巢颗粒细胞的p38MAPK和NF-κB mRNA表达,升高CK2和IκBαmRNA表达,提高GDF9 mRNA和蛋白的表达水平,降低卵巢颗粒细胞的凋亡率。单独添加p38MAPK抑制剂SB203580与单独添加NF-κB抑制剂PDTC均能促进GDF9 mRNA和蛋白表达、降低卵巢颗粒细胞凋亡率。【结论】益气血法经后增殖方含药血清可促进超排卵大鼠卵巢颗粒细胞GDF9表达,抑制卵巢颗粒细胞凋亡,其机制可能与调控p38MAPK和NF-κB双信号通路基因表达有关。

黄芩苷对多囊卵巢综合征大鼠颗粒细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨黄芩苷对多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)大鼠颗粒细胞增殖和凋亡的影响及对磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号通路的调节作用。方法48只大鼠成功建立PCOS模型,并随机分为模型组、黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组和阳性对照组,每组12只,另取12只大鼠作为对照组。黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组大鼠分别灌胃25、50 mg∙kg^(−1)黄芩苷,阳性对照组大鼠灌胃0.3392 mg∙kg^(−1)炔雌醇环丙孕酮片(达英-35),对照组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水,每日1次,连续3周。用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immuno⁃sorbent assay,ELISA)检测黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)、睾酮(testos⁃terone,T)以及雌二醇(estradiol,E2)含量;用HE染色观察卵巢组织病理损伤,细胞增殖检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测颗粒细胞存活率;用流式细胞仪检测细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测PI3K、磷酸化磷脂肌醇3-激酶(phospho PI3K,p-PI3K)、Akt以及p-Akt蛋白相对表达量。结果对照组大鼠可见黄体,未见囊状扩张卵泡;模型组大鼠卵巢体积变大,少见黄体,可见囊状扩张卵泡;黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组及阳性对照组大鼠卵巢体积变小,可见黄体,囊状卵泡扩增不明显。与对照组比较,模型组FSH和E2水平、颗粒细胞存活率以及p-PI3K和p-Akt蛋白相对表达量降低,LH、T水平和颗粒细胞凋亡率升高(P<0.05);与模型组比较,黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组和阳性对照组FSH、E2水平,颗粒细胞存活率及p-PI3K和p-Akt蛋白相对表达量升高,LH、T水平及颗粒细胞凋亡率降低,其中阳性对照组各指标水平变化最显著,其次是黄芩苷高剂量组(P<0.05)。结论黄芩苷可促进PCOS大鼠卵巢颗粒细胞增殖,抑制凋亡,改善卵巢组织病理损伤,其可能是通过激活PI3K/Akt信号通路发挥作用的。

miR-96对牦牛颗粒细胞凋亡和增殖的影响

为研究牦牛卵巢组织内miR-96对颗粒细胞凋亡、增殖及激素分泌的影响,本试验通过采集成年牦牛卵巢内颗粒细胞,分离培养后将其分为4个处理组,分别转染miR-96模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor)及两者的阴性对照(NC)后培养并检测颗粒细胞受到的影响。使用流式细胞术和CCK-8法对细胞凋亡和增殖情况进行检测,采用qPCR和Western Blot检测凋亡相关基因表达情况,ELISA检测转染后类固醇激素分泌情况。结果表明:miR-96-mimics使颗粒细胞凋亡发生抑制促进细胞增殖,并促使凋亡相关基因Bcl-2表达极显著升高,Bax表达极显著降低;ELISA检测类固醇激素水平变化显示,与mimics NC组相比miR-96-mimics组细胞培养液中孕酮(P4)分泌水平极显著降低,雌二醇(E_(2))分泌水平极显著升高;与inhibitor NC组相比miR-96-inhibitor组孕酮(P4)分泌水平极显著升高,雌二醇(E_(2))分泌水平显著降低。miR-96可促进颗粒细胞增殖并抑制凋亡,同时会对生殖激素分泌产生影响,从而参与调控牦牛卵泡发育与闭锁的过程。

多囊卵巢综合征颗粒细胞增殖凋亡相关信号通路的研究进展

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄期妇女常见的内分泌代谢疾病,是导致育龄期妇女发生排卵障碍,甚至不孕的主要原因,严重影响女性的身心健康。PCOS因其临床表现具有异质性,发病机制目前尚无定论。PCOS患者卵泡发育过程中常表现为颗粒细胞的异常增殖或凋亡,但其机制尚不明确,可能与丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶、核转录因子κB、转化生长因子β/Smads、磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶/蛋白激酶B、Wnt/β⁃连环蛋白等多种信号通路的相互作用有关。本文结合既往研究结果,对上述5条信号通路导致PCOS颗粒细胞异常增殖或凋亡的研究进展进行综述,以期为今后PCOS的治疗提供新的思路。

CircASPH靶向miR-28-5p/IGF-1R轴对多囊卵巢综合征卵巢颗粒细胞增殖迁移和侵袭的影响

目的:探讨环状RNA天冬酰胺β-羟化酶(CircASPH)靶向miR-28-5p/胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)轴对多囊卵巢综合征(PCOS)卵巢颗粒细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:使用人卵巢颗粒细胞KGN、COV434为研究对象,通过双荧光素酶报告基因实验、下拉实验证实CircASPH、miR-28-5p、IGF-1R三者间的靶向关系。将KGN、COV434细胞分为si-NC组、si-ASPH组、si-ASPH+anti-NC组、si-ASPH+anti-miR-28-5p组,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CircASPH、miR-28-5p和IGF-1R mRNA表达水平,并用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(Edu)染色和迁移小室实验分别检测细胞增殖、迁移和侵袭行为;采用蛋白印迹实验检测增殖细胞核抗原、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、波形蛋白、N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、IGF-1R蛋白表达。结果:生物信息学分析和双荧光素酶报告基因实验显示,CircASPH、IGF-1R与miR-28-5p有靶向结合位点。与si-NC组比较,si-ASPH组CircASPH表达水平、OD 490值、Edu阳性细胞率、细胞迁移与侵袭数、MMP-2、波形蛋白、N-钙黏蛋白降低,miR-28-5p表达水平和E-钙黏蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与si-ASPH+anti-NC组比较,si-ASPH+anti-miR-28-5p组miR-28-5p表达水平和E-钙黏蛋白降低,OD 490值、Edu阳性细胞率、细胞迁移与侵袭数、MMP-2、波形蛋白、N-钙黏蛋白升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:在KGN、COV434细胞中,抑制CircASPH表达可通过调节miR-28-5p/IGF-1R轴,抑制卵巢颗粒细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化,可能成为治疗PCOS的一种新靶点。

HSD17B12对兔卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响

本实验旨在研究羟基类固醇17-β脱氢酶12(17βHydroxysteroid Dehydrogenase Type 12,HSD17B12)对兔卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响。首先克隆了兔HSD17B12基因,进行生物信息学分析;分离原代兔颗粒细胞(Granulosa Cells,GCs),并利用FSHR免疫荧光法进行鉴定;构建HSD17B12基因过表达质粒及干扰RNA,转染GCs,利用qRT-PCR检测HSD17B12对增殖、凋亡相关基因的调控作用,并利用流式细胞、CCK8等方法检测HSD17B12对GCs增殖、凋亡的影响。结果显示:①利用FSHR免疫荧光染色,鉴定分离原代细胞是GCs,FSHR表达呈阳性。②克隆HSD17B12基因,发现其cDNA全长为938 bp,编码312个氨基酸。进化树显示兔与黑猩猩(Pan Troglodytes)、猕猴(Macaca Mulatta)等聚在一起,鸡(Gallus Gallus)为外支。③过表达HSD17B12可以提高增殖相关基因AKT1-1的表达(P<0.01),降低凋亡相关基因Bad、Fas、FasL、P53(P<0.01)以及Bcl-2(P<0.05)的表达;干扰后,对基因的调控作用相反。④HSD17B12可促进GCs增殖,抑制GCs凋亡(P<0.01)。因此,HSD17B12可能通过调控AKT1、Bad、Fas、FasL、P53等基因的表达,显著促进兔GCs增殖,抑制其凋亡,为其在母兔卵巢发育中的作用机制研究提供理论依据。

转录因子SOX3对卵巢颗粒细胞增殖和雌二醇分泌的影响

目的研究性别决定区Y框蛋白3(SOX3)对人卵巢颗粒细胞(KGN)增殖和雌二醇分泌的影响。方法在NCBI数据库Gene-Bank中搜索人SOX3(NM_005634.3)的基因序列,用PCR方法扩增目的基因SOX3,将其克隆到慢病毒载体pLV-EF1a-GFP-2A-Puro上,获得过表达慢病毒重组质粒pLV-EF1a-GFP-2A-Puro-SOX3;将测序正确的过表达慢病毒重组质粒以及包装质粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)共同转染到人胚肾细胞系(HEK 293T)细胞中(pLV-SOX3组),将pLV-EF1a-GFP-2A-Puro及包装质粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)共同转染到HEK 293T细胞中(pLV-NC组),转染48 h后收集两组慢病毒颗粒并测定病毒的滴度,将两组慢病毒感染KGN细胞,经嘌呤霉素筛选2周后,获得稳定表达的细胞系;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot法检测两组中SOX3的mRNA和蛋白水平;CCK-8法检测两组细胞增殖能力;ELISA测定两组雌二醇的浓度。结果PCR产物的鉴定和测序结果表明SOX3基因片段扩增成功,酶切和测序结果表明过表达慢病毒重组质粒构建完成;慢病毒感染HEK 293T细胞后可检测到绿色荧光,表明慢病毒包装成功;慢病毒感染KGN细胞后经嘌呤霉素筛选,荧光显微镜下观察细胞表达绿色荧光;RT-qPCR和Western blot检测结果均表明pLV-SOX3组中SOX3表达水平高于pLV-NC组(P<0.05)。CCK-8检测结果表明,pLV-SOX3组较pLV-NC组细胞增殖能力明显增强(P<0.01)。ELISA结果显示,pLV-SOX3组雌二醇浓度较pLV-NC组升高(P<0.05)。结论过表达转录因子SOX3能够促进KGN的增殖和雌二醇分泌。

TGFA过表达对水牛卵巢颗粒细胞功能的影响

本试验旨在探索转化生长因子α(Transforming Growth Factor alpha,TGF-α)的编码基因TGFA对水牛卵巢颗粒细胞(BGCs)增殖、凋亡和类固醇激素分泌能力的影响,为进一步探明TGFA在调控水牛卵泡发育中的作用提供理论支持。构建TGFA过表达载体,采用脂质体将其转染至BGCs,CCK-8、EdU、流式细胞术、ELISA等技术分别检测细胞活力、增殖、凋亡和类固醇激素分泌情况,同时运用qRT-PCR和WesternBlot检测相关基因和蛋白的表达变化。结果表明,TGFA过表达后BGCs活力显著提高,EdU阳性细胞率显著升高,增殖相关基因PCNA和CyclinD1的表达量显著上调。同时,细胞凋亡率显著降低,促凋亡基因CASPASE 3、BAX和P53的表达量显著降低,促凋亡蛋白CASPASE3的表达量显著下调;雌激素(Estradiol,E2)和孕酮(Progesterone,也称黄体酮,缩写:PROG)的分泌量显著降低,类固醇激素合成相关基因3-βHSD和CYP19A1的表达量显著下调,其蛋白表达量也显著降低。综上,TGFA过表达促进BGCs增殖,抑制细胞凋亡和类固醇激素分泌,从而调节水牛卵泡发育。

陕北白绒山羊卵巢颗粒细胞分离及培养条件的优化

为了解析颗粒细胞的生物学特性及其在卵巢排卵、母羊高产中的生物学作用,试验以陕北白绒山羊卵巢为研究对象,比较了切剖法和注射器抽吸法分离卵巢颗粒细胞,检测细胞活率;分别用DMEM、DMEM/F12和MEM培养基加入10%FBS、β巯基乙醇和1%双抗培养颗粒细胞(即DMEM组、DMEM/F12组和MEM组),用CCK-8法检测培养24 h、48 h的细胞活力,EdU掺入法检测细胞增殖,RT-PCR法检测增殖相关基因(PCNA、CyclinD1、CDK2)及凋亡相关基因(BAX、BCL-2、Caspase3)的表达。结果表明:注射器抽吸法分离卵巢颗粒细胞所得的细胞活率高于切剖法,切剖法可以获得更多的细胞数量;MEM组的细胞活力极显著高于DMEM/F12组和DMEM组(P<0.01),DMEM/F12组细胞活力在24 h、48 h时高于DMEM组但差异不显著(P>0.05)。MEM组与DMEM/F12组EdU染色阳性细胞数差异不显著(P>0.05),MEM组与DMEM/F12组均显著高于DMEM组(P<0.05);MEM组PCNA、CyclinD1基因的表达量高于其他两组,但差异不显著(P>0.05),CDK2基因的表达量极显著高于其他两组(P<0.01),DMEM/F12组和DMEM组的PCNA、CyclinD1和CDK2基因的表达量差异不显著(P>0.05)。MEM组Caspase3的表达量低于其他两组但差异不显著(P>0.05),BCL-2/BAX的相对表达量极显著高于DMEM/F12组和DMEM组(P<0.01)。说明采用抽吸法分离卵巢颗粒细胞并辅以MEM培养基培养,可以实现对陕北白绒山羊卵巢颗粒细胞的有效体外培养。

miR-535靶向GAB2基因通过激活PI3K/AKT信号通路促进山羊颗粒细胞增殖

【背景】MicroRNA(miRNA)是长度为18—25 nt的短RNA分子,在哺乳动物卵巢颗粒细胞调控卵泡发育过程中起着重要作用。团队前期对云上黑山羊高、低产羔数个体卵巢转录组测序结果显示,miR-535能够影响山羊产羔数,但具体调控机制尚不清楚。【目的】通过研究miR-535靶向GAB2(GRB2 associated binding protein 2)及其相关信号通路PI3K/AKT对山羊颗粒细胞增殖的影响,进一步探讨其分子生物学调控机制。【方法】在本研究中,选择具有两胎以上产羔记录的高、低产云上黑山羊各3只,同期发情处理后采集卵泡期卵巢组织,收集原代颗粒细胞。使用荧光定量PCR(reverse transcription-quantitativePCR,RT-qPCR)检测miR-535和GAB2在云上黑山羊高、低产卵巢组织中的表达量。构建GAB2的过表达/干扰载体,使用RT-qPCR、Western blot、免疫荧光、CCK8、EdU和细胞凋亡检测候选基因GAB2对山羊卵巢颗粒细胞增殖的影响。使用miRDB和miRanda软件预测miR-535和GAB2的靶向关系,构建GAB2的野生型和突变型载体,利用双荧光素酶活性检验检测miR-535和GAB2的靶向关系。构建过表达/干扰miR-535载体,探究其颗粒细胞增殖及下游基因功能的影响。【结果】RT-qPCR结果显示,GAB2在高产云上黑山羊卵巢组织中的表达量显著低于低产个体,miR-535的表达则相反(P<0.05);随后,RT-qPCR和Westernblot结果表明,在颗粒细胞中过表达GAB2后,CCND2、CDK4和BCL2的表达量显著升高(P<0.05),BAX的表达量显著降低(P<0.05),抑制其表达则与之相反;EdU和CCK8检测显示,GAB2过表达后显著促进颗粒细胞增殖(P<0.05),抑制其表达后则相反;双荧光素酶报告试验表明,miR-535抑制了GAB2基因3’UTR区域的双荧光素酶活性。RT-qPCR和Western blot结果显示,在颗粒细胞中过表达miR-535后,GAB2、CCND2、CDK4和BCL2的表达量显著降低(P<0.05),BAX的表达量显著升高(P<0.05),抑制其表达后则与之相反;EdU和CCK8检测显示,miR-535过表达后抑制颗粒细胞增殖,抑制其表达后则相反;细胞凋亡试验表明,miR-535过表达后促进颗粒细胞增殖,抑制其表达后则相反。在颗粒细胞中抑制miR-535后,发现PI3K/AKT信号通路标志因子AKT1的表达水平显著升高(P<0.05)。【结论】miR-535通过抑制GAB2的表达,抑制了山羊颗粒细胞的增殖,为进一步探究miR-535调控山羊颗粒细胞的生物学功能提供了理论依据。

Y-box结合蛋白1通过沉默信息调节因子1 mRNA稳定性调节抑制人颗粒细胞凋亡在早发性卵巢功能不全中的作用与机制

目的:探讨Y-box结合蛋白1(YBX1)调节沉默信息调节因子1(SIRT1)对颗粒细胞增殖和凋亡的影响,研究YBX1和SIRT1在早发性卵巢功能不全(POI)患者及卵巢功能正常患者间表达水平差异及临床意义。方法:留取2022年6月至2023年7月于江苏大学第四附属医院生殖医学中心进行体外受精(IVF)/卵胞浆内单精子注射(ICSI)助孕的POI患者(POI组)及卵巢储备功能正常患者(对照组)的颗粒细胞和血清,利用免疫印迹(WB)检测YBX1蛋白表达水平;利用实时荧光定量核酸扩增法(RT-qPCR)检测YBX1及SIRT1 mRNA表达水平,并分析血清中其与卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、雌二醇(E_(2))、抗苗勒管激素(AMH)、窦卵泡数(AFC)的相关性;利用5-溴-2-脱氧尿嘧啶(EdU)、细胞计数试剂8(CCK8)检测细胞增殖、原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡;RT-qPCR检测细胞内增殖细胞核抗原(PCNA)、B细胞淋巴瘤因子-2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(BAX)、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA表达情况;RNA免疫沉淀(RIP)实验检测YBX1与SIRT1的相互作用。结果:与对照组患者相比,POI组患者颗粒细胞和血清中YBX1蛋白及SIRT1 mRNA的表达降低(P<0.05);血清中YBX1、SIRT1 mRNA表达与FSH、LH负相关(r<0,P<0.05),与E_(2)、AMH、AFC正相关(r>0,P<0.05);在颗粒细胞中上调YBX1后SIRT1蛋白表达量、SIRT1 mRNA的稳定性、EdU阳性率、细胞活性、PCNA mRNA表达量、Bcl2/BAX比值均增加(P<0.05),Caspase-3 mRNA表达量、TUNEL阳性率均降低(P<0.05)。结论:YBX1和SIRT1在POI患者中表达水平显著下调,且其表达水平与临床卵巢功能指标相关;YBX1结合SIRT1 mRNA增强其稳定性,可能促进颗粒细胞增殖,抑制细胞凋亡,提示YBX1和SIRT1有望成为POI诊疗的新靶点。

补肾调泡周期疗法组方对大鼠原代卵巢颗粒细胞增殖、分泌及AMH、AMHR2、Smad4表达的影响

目的研究补肾调泡周期疗法组方(逍遥散、三子汤)对大鼠原代卵巢颗粒细胞增殖、分泌功能及抗苗勒氏管激素(AMH)、抗苗勒氏管激素Ⅱ型受体(AMHR2)、Smad同源物4(Smad4)表达的影响。方法6~8周龄SD雌鼠20只随机分为空白组、阳性药物组(7.8 IU·kg^(-1)FSH)、逍遥散组(12 g·kg^(-1))、三子汤组(16 g·kg^(-1))各5只,连续给药4 d后采血,制备含药血清。选取21~25日龄SD雌鼠提取大鼠卵巢颗粒细胞,贴壁生长至70%,用免疫荧光法进行大鼠卵巢颗粒细胞纯度鉴定。培养成功的大鼠原代卵巢颗粒细胞分别用各组含药血清培养液培养,CCK-8法筛选各组含药血清最佳干预浓度;各组采用最佳干预浓度培养细胞,CCK-8法检测各组颗粒细胞24、48、72、96 h增殖情况;ELISA法检测各组颗粒细胞培养液上清AMH、雌二醇(E_(2))及孕酮(P)浓度;Western Bolt法检测各组颗粒细胞AMH、AMHR2和Smad4蛋白表达;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组颗粒细胞中AMH、AMHR2和Smad4 mRNA表达水平。结果与空白组比较,各组含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞增殖均有促进作用(P<0.05,P<0.01);与阳性药物组比较,三子汤组促进颗粒细胞增殖作用最佳(P<0.01),逍遥散次之(P<0.05);各组颗粒细胞增殖与含药血清干预时间呈正相关,干预48 h启动细胞增殖活性,96 h细胞增殖达到高峰。与空白组比较各组颗粒细胞培养液上清AMH、E_(2)及P的浓度均明显升高(P<0.05,P<0.01);与阳性药物组比较,逍遥散组促P分泌效果更佳(P<0.05)。与空白组比较各组卵巢颗粒细胞AMH、AMHR2、Smad4蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),阳性药物组AMHR2蛋白表达较逍遥散、三子汤组升高明显(P<0.01)。与空白组比较各组卵巢颗粒细胞AMH、AMHR2、Smad4 mRNA表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),其中三子汤组AMH、AMHR2 mRNA表达明显优于阳性药物组与逍遥散组(P<0.01)。结论补肾调泡周期疗法组方逍遥散、三子汤能促进大鼠原代卵巢颗粒细胞增殖并与干预时间呈正相关性,促进颗粒细胞分泌甾体激素和AMH,并可能通过上调AMH、AMHR2、Smad4蛋白及mRNA表达,促进卵泡发育和成熟,并以此改善卵巢生殖和内分泌功能。

淫羊藿苷调节SDF-1/CXCR4信号通路对多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响

目的探讨淫羊藿苷调节基质细胞衍生因子-1(SDF-1)/CXC型趋化因子受体4(CXCR4)信号轴对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响。方法将从PCOS模型组大鼠卵巢组织中成功分离的颗粒细胞分为PCOS组、淫羊藿苷低剂量组、淫羊藿苷中剂量组、淫羊藿苷高剂量组、重组大鼠SDF-1蛋白(Rr-SDF-1)组、淫羊藿苷高剂量+Rr-SDF-1组,另取从正常对照组大鼠卵巢组织中成功分离的颗粒细胞作为对照组。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测卵巢颗粒细胞上清液中卵泡刺激素(FSH)、睾酮(T)、黄体生成素(LH)水平;CCK-8法、EdU染色检测颗粒细胞增殖;流式细胞术检测颗粒细胞凋亡;Western blot检测颗粒细胞中Bcl-2相关X蛋白(Bax)、裂解的胱天蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)、SDF-1、CXCR4蛋白表达。结果与对照组比较,PCOS组FSH水平、光密度(OD)_(450)值、EdU阳性细胞率降低,T、LH水平、细胞凋亡率、Bax、Cleaved Caspase-3、SDF-1、CXCR4蛋白表达水平升高(P<0.05)。与PCOS组比较,淫羊藿苷低、中、高剂量组FSH水平、OD_(450)值、EdU阳性细胞率均依次升高,T、LH水平、细胞凋亡率、Bax、Cleaved Caspase-3、SDF-1、CXCR4蛋白表达水平均依次降低;Rr-SDF-1组对应指标变化趋势与上述相反(P<0.05)。与淫羊藿苷高剂量组比较,淫羊藿苷高剂量+Rr-SDF-1组FSH水平、OD_(450)值、EdU阳性细胞率降低,T、LH水平、细胞凋亡率、Bax、Cleaved Caspase-3、SDF-1、CXCR4蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论淫羊藿苷可能通过抑制SDF-1/CXCR4信号通路抑制PCOS大鼠卵巢颗粒细胞凋亡。

Smad9基因干扰表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖及内分泌的影响

为阐明BMP/Smad信号通路下游的转录因子Smad9对鹅卵泡发育的调控作用,研究采用RNAi技术干扰Smad9基因在鹅卵泡颗粒细胞的表达。通过对SMAD9蛋白表达定位,Smad9基因干扰后颗粒细胞的增殖情况以及卵泡发育相关激素及其受体的表达分析,探讨Smad9基因表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖及其内分泌功能的影响。结果显示,SMAD9蛋白在鹅卵泡仅表达于颗粒细胞,Smad9-siRNA显著抑制Smad9的表达。Smad9干扰后颗粒细胞的增殖能力明显降低,细胞上清中雌二醇(E 2)的水平显著下降,孕酮(P 4)水平未见明显变化,细胞色素P450芳香化酶基因(CYP19A1)和促黄体素受体(LHR)基因的表达显著下降,促卵泡素受体(FSHR)基因的表达无显著变化。这些结果表明,干扰Smad9基因表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖和内分泌功能均产生显著影响,其机制可能是Smad9基因表达抑制后引起颗粒细胞E 2合成减少和LHR的表达下降有关。