脂多糖处理时间对山羊瘤胃上皮细胞损伤的影响

在山羊瘤胃上皮细胞(GRECs)基础培养基中加入1μg/mL脂多糖(LPS),培养3、6、9 h后,检测细胞活性、抗氧化指标、炎症因子及紧密连接蛋白基因的表达。结果发现:1)LPS处理3 h组GRECs的活性显著低于处理6 h和9 h组的,而处理6 h和9 h组GRECs的活性无显著差异;2)LPS处理3 h组GRECs的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH–PX)活性极显著低于处理6 h和9 h组的,但MDA含量的变化则相反,GRECs的SOD和CAT活性随LPS处理时间的延长而显著升高,ROS含量则随LPS处理时间的延长而极显著降低;3)LPS处理3h组GRECs的TNF–ɑ和IL–1β相对表达量极显著高于处理6h和9h组的,IL–1β相对表达量随LPS处理时间的延长而显著降低,各组间IL–6相对表达量无显著差异;4)LPS处理3 h组GRECs的ZO–1分布低,随着处理时间延长ZO–1分布增加,LPS处理3 h的GRECs紧密连接蛋白Claudin–1相对表达量显著高于处理6 h和9 h组的。说明随着LPS处理时间的延长,山羊瘤胃上皮细胞能够通过提高自身抗氧化和抗炎症能力来缓解氧化损伤,进而改善细胞屏障功能。

枯草芽孢杆菌LTA诱导绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1表达的影响研究

为探究枯草芽孢杆菌的脂磷壁酸(LTA)对绵羊瘤胃上皮细胞(ORECs)中绵羊β-防御素-1(SBD-1)表达的影响,本试验使用不同浓度(0、10、20、30、40和50μg/mL)的枯草芽孢杆菌LTA刺激ORECs 8 h,并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光定量PCR试验(qPCR)分别检测ORECs SBD-1蛋白和mRNA的表达量,确定最佳刺激浓度;再用最佳刺激浓度的枯草芽孢杆菌LTA分别刺激ORECs不同时间(0、2、4、8、12和24 h),采用qPCR和ELISA方法检测SBD-1的mRNA和蛋白表达量,确定最佳刺激时间。结果表明:不同条件下的枯草芽孢杆菌LTA均可使ORECs中SBD-1的表达量上调,其中在刺激浓度为10μg/mL与刺激时间为8 h的情况下,SBD-1的表达量最高,且与对照组呈极显著差异(P<0.01);并且不同条件下的枯草芽孢杆菌LTA对ORECs的刺激均不产生细胞毒性作用。这说明枯草芽孢杆菌LTA可诱导ORECs中SBD-1表达量增加,且最佳诱导浓度和时间分别为10μg/mL和8 h。本研究为枯草芽孢杆菌LTA诱导调节SBD-1机制的研究提供理论依据。

不同氮源对瘤胃上皮细胞凋亡的影响

本试验采用细胞增殖试验、流式细胞术检测试验、Western blot试验、Hochest33342染色荧光显微镜检测等探究不同氮源(蛋氨酸与氯化铵)对瘤胃上皮细胞凋亡的影响及其可能的调控机制。结果表明:对瘤胃上皮细胞来说,处理36 h时,添加0.12 mmol NH4Cl组和0 mmol Met缺失组的OD值均达到对照组的一半,且均显著低于0.048 mmol Met组、0.12 mmol Met组(对照组)和0.048 mmol NH4Cl组(P <0.05),0 mmol Met组比0.12 mmol NH4Cl组细胞活性显著降低(P <0.05);添加0 mmol Met组的总凋亡率和晚期凋亡率最高,显著高于0.12 mmol Met组(对照组)和0.12 mmol NH4Cl组(P <0.05),而0 mmol Met组和0.12 mmol NH4Cl组的早期细胞凋亡率均显著高于0.12 mmol Met组(对照组)(P <0.05);与对照组相比,0.12 mmol NH4Cl组和0 mmol Met组的线粒体膜电势分别显著下降到71.99%和67.67%;与对照组相比,0 mmol Met组和0.12 mmol NH4Cl组的促调亡蛋白Caspase-3、Bax和p53的表达均显著上调(P <0.05),抑调亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达均显著下调(P <0.05);与对照组相比,0 mmol Met组和0.12 mmol NH4Cl组的p-mTOR和p-AMPK蛋白的表达均显著上调(P <0.05),而PI3K和p-AKT的蛋白表达量显著下调(P <0.05)。综上,蛋氨酸缺乏会诱导瘤胃上皮细胞发生凋亡,NH4Cl替代可以缓解凋亡的发生,其诱导过程可能通过PI3K-Akt-mTOR信号通路和AMPK-mTOR信号通路完成,该结果说明了蛋氨酸不可或缺的重要性,可为反刍动物的配合饲料发展研究提供参考。

LPS对牦牛瘤胃上皮细胞补体C3激活和ATP生成代谢的影响

旨在通过脂多糖(LPS)诱导牦牛瘤胃上皮细胞建立炎症模型,考察瘤胃上皮细胞作为非免疫细胞是否存在细胞内补体C3激活,及其对细胞三磷酸腺苷(ATP)生成的影响,为瘤胃健康营养调控技术提供试验依据。用不同浓度的LPS处理牦牛瘤胃上皮细胞系,采用CCK-8法测定细胞活力;ELISA试剂盒测定细胞内补体C3激活产物C3a、C3b浓度以及培养基中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)浓度;化学法检测细胞内ATP浓度,线粒体红色荧光探针和流式细胞仪检测线粒体数量及膜电位;qPCR检测细胞IL-1β、IL-6、TNF-α,补体C3及其激活关键酶组织蛋白酶B(CTSB)和组织蛋白酶L(CTSL),以及ATP合成酶亚基(ATP 5A和ATP 5C1)等基因相对表达量。结果发现:1)不同浓度LPS处理后,牦牛瘤胃上皮细胞活力极显著下调(P<0.01),TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子的基因表达量和浓度极显著上调(P<0.01),在LPS浓度为10μg·mL^(-1)时,牦牛瘤胃上皮细胞炎症模型构建成功;2)炎症下,牦牛瘤胃上皮细胞内补体C3及其激活关键酶CTSB的基因表达量极显著升高(P<0.01),激活产物补体片段C3a和C3b浓度极显著升高(P<0.01);3)炎症下,牦牛瘤胃上皮细胞ATP含量极显著下降(P<0.01),线粒体膜电位显著降低(P<0.05),ATP合成酶亚基ATP 5A和ATP 5C1的基因表达量随着LPS处理浓度升高显著下调(P<0.01)。综上,利用LPS诱导建立了牦牛瘤胃上皮细胞炎症模型。在LPS刺激下,牦牛瘤胃上皮细胞可发生细胞内补体C3激活过程,并抑制线粒体ATP合成酶亚基ATP 5A、ATP 5C1和有氧呼吸关键酶ME 1的基因表达,线粒体膜电位降低,抑制ATP生成。因此,LPS诱导炎症可抑制瘤胃上皮细胞ATP生成,从而导致瘤胃健康问题。

枯草芽孢杆菌细胞壁通过TLR-2-MyD88-NF-κB/MAPK信号通路调控绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1的表达

为了探索枯草芽孢杆菌细胞壁诱导绵羊β-防御素-1(SBD-1)表达的主要信号转导途径,本试验首先使用反复冻融法与超声波破碎法相结合的方法破碎枯草芽孢杆菌并收集其细胞壁,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测方法分析细胞壁成分及其含量,然后利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)方法检测枯草芽孢杆菌细胞壁刺激绵羊瘤胃上皮细胞(ORECs)后通路因子(TLR-2、MyD88、NF-κB、p38、JNK和ERK1/2)mRNA和蛋白的表达变化,最后使用通路抑制剂分别阻断NF-κB、p38、JNK和ERK1/2信号通路,用枯草芽孢杆菌细胞壁刺激ORECs并检测刺激后SBD-1 mRNA表达变化,从而确定诱导SBD-1表达的主要信号通路。结果显示,枯草芽孢杆菌细胞壁制备成功,细胞壁主要成分为肽聚糖和磷壁酸,含量分别为(90.85±0.91)%和(8.85±0.11)%。与对照组相比,枯草芽孢杆菌细胞壁刺激ORECs后信号通路因子(TLR-2、MyD88、NF-κB、p38、JNK和ERK1/2)的mRNA和蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01),使用通路抑制剂阻断各个信号通路后再刺激ORECs,SBD-1 mRNA表达水平均极显著下降(P<0.01),且添加NF-κB和JNK抑制剂组下降幅度最大。结果表明,枯草芽孢杆菌细胞壁可能通过TLR-2-MyD88-NF-κB/MAPK信号通路调控ORECs SBD-1的表达。

转录因子GATA结合蛋白2在奶牛瘤胃上皮细胞中对尿素转运因子-B基因启动子的作用研究

本研究旨在探明转录因子GATA结合蛋白2(GATA2)在奶牛瘤胃上皮细胞中对尿素转运因子-B(UT-B)基因启动子的作用。首先构建UT-B基因的启动子载体与GATA2真核表达载体,二者共转染奶牛瘤胃上皮细胞,通过荧光素酶报告基因研究GATA2过表达对UT-B基因启动子转录活性的调控作用。不同浓度(0.5、1.0和1.5 mmol/L)尿素作用下,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测氮转运相关基因UT-B、GATA2、水通道蛋白3(AQP3)的基因表达量,Western blot检测其蛋白表达量。结果表明:1)1.0 mmol/L尿素可显著提高体外培养条件下奶牛瘤胃上皮细胞UT-B、GATA2及AQP3基因和蛋白表达量(P<0.05)。2)奶牛瘤胃上皮细胞中,GATA2显著上调UT-B-1、UT-B-2基因启动子活性(P<0.05)。由此可见,GATA2影响氮转运相关基因(AQP3、UT-B)转录变化且对UT-B基因启动子具有调控作用,这对探明奶牛瘤胃氮再循环的机制,丰富奶牛氮素营养理论具有重要意义。

枯草芽孢杆菌肽聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)表达的影响

为了探究来源于枯草芽孢杆菌细胞壁的肽聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞(ORECs)中β-防御素-1(SBD-1)表达的影响,本试验使用30μg/mL肽聚糖刺激ORECs不同时间(2、4、6、8、10和12 h),采用荧光定量PCR(qPCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法分别检测SBD-1的mRNA和蛋白表达量,确定最佳刺激时间;再使用不同浓度的肽聚糖(0、10、20、30、40和50μg/mL)刺激ORECs 2 h,采用qPCR和ELISA方法检测SBD-1的mRNA和蛋白表达量,确定最佳刺激浓度。结果显示:(1)使用30μg/mL肽聚糖刺激ORECs不同时间时,SBD-1的mRNA和蛋白表达量随着时间的增加呈先下降后升高的趋势,2 h时表达量最多并极显著高于对照组(P<0.001)。(2)使用不同浓度肽聚糖刺激ORECs 2 h时,SBD-1的mRNA和蛋白表达量随着肽聚糖浓度的升高呈现先升高后降低的趋势,在20μg/mL时表达量最多并极显著高于对照组(P<0.001)。(3)不同时间刺激试验和不同浓度刺激试验均不会对ORECs产生细胞毒性作用。结果表明,来源于枯草芽孢杆菌的肽聚糖能够诱导ORECs表达SBD-1,最佳刺激条件为20μg/mL枯草芽孢杆菌肽聚糖刺激ORECs 2 h。

二烯丙基二硫醚对过氧化氢诱导的湖羊瘤胃上皮细胞氧化应激的缓解作用

本试验旨在探究二烯丙基二硫醚(DADS)对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的湖羊瘤胃上皮细胞(RECs)自由基的清除能力及其对瘤胃上皮细胞氧化应激的保护作用。分别使用不同浓度(0、50、100、150、200、250μmol/L)的H_(2)O_(2)和不同浓度(0、25、50、75、100、150、200μmol/L)的DADS处理湖羊瘤胃上皮细胞24 h,使用CCK-8法检测细胞活力,荧光探针法检测细胞内活性氧(ROS)含量,筛选构建湖羊瘤胃上皮细胞氧化应激模型的适宜H_(2)O_(2)浓度和DADS安全浓度范围。随后先用不同浓度(0、25、75、150μmol/L)的DADS预处理湖羊瘤胃上皮细胞2 h,对其进行保护,再使用200μmol/L H_(2)O_(2)处理湖羊瘤胃上皮细胞24 h,检测细胞活力以及细胞内ROS含量,采用试剂盒法检测细胞内总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量及过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测SOD、CAT和GPX的mRNA相对表达量。结果显示:与空白对照组(H_(2)O_(2)浓度为0μmol/L)相比,200μmol/L的H_(2)O_(2)可显著降低湖羊瘤胃上皮细胞活力(P<0.05),显著增加细胞内ROS含量(P<0.05),成功诱导湖羊瘤胃上皮细胞氧化应激。与空白对照组(DADS浓度为0μmol/L)相比,25~150μmol/L的DADS不会对湖羊瘤胃上皮细胞活力产生显著影响(P>0.05)。与空白对照组(H_(2)O_(2)和DADS浓度均为0μmol/L)相比,200μmol/L的H_(2)O_(2)显著降低细胞活力(P<0.05),显著增加细胞内ROS和MDA含量(P<0.05),显著降低T-AOC和SOD活性与mRNA相对表达量(P<0.05);与氧化应激模型组(经200μmol/L H_(2)O_(2)诱导)相比,使用75、150μmol/L DADS预处理湖羊瘤胃上皮细胞可显著降低细胞内ROS和MDA含量(P<0.05),显著增加T-AOC和SOD活性与mRNA相对表达量(P<0.05)。综上所述,适量的DADS可有效缓解H_(2)O_(2)诱导的湖羊瘤胃上皮细胞氧化应激。

反刍动物瘤胃上皮细胞的培养方法及其在炎症反应中的应用

反刍动物主要通过瘤胃进行消化,由于瘤胃内存在一些微生物,因此其能够将动物采食的物质通过发酵转化为其他物质,瘤胃上皮细胞(Rumen Epithelial Cells,RECs)吸收这些物质后,能够为动物机体提供能量,所以动物RECs发育良好才能更好地进行一系列生理活动。体外培养RECs与活体试验相对比,前者的操作技术更简单、可控性更高、成本较低并且能够解决试验个体之间存在差异的问题,为体外研究瘤胃组织生长发育规律、营养机制、瘤胃疾病等提供良好的细胞模型。体外培养RECs时,炎症介质含量增加会使细胞炎症因子表达增强,诱导炎症反应,本综述通过介绍瘤胃上皮的结构功能以及RECs的体外分离培养、纯化、鉴定技术,及RECs在炎症反应中的应用进展,以期为RECs的研究及应用提供参考。

枯草芽孢杆菌培养上清液对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

[目的]探究枯草芽孢杆菌培养上清液对绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)中绵羊β-防御素-1(sheepβ-defesin-1,SBD-1)表达的影响。[方法]采用Cell Counting kit-8(CCK-8)方法筛选对ORECs无明显毒性作用的枯草芽孢杆菌培养上清液刺激浓度范围与刺激时间范围。用筛选出的无明显毒性作用的不同浓度枯草芽孢杆菌对应的培养上清液刺激ORECs 8 h后,采用荧光定量PCR(qPCR)技术和酶联免疫吸附(ELISA)检测方法筛选枯草芽孢杆菌培养上清液诱导SBD-1表达的最佳刺激浓度,以该浓度枯草芽孢杆菌对应的培养上清液刺激ORECs不同时间,采用qPCR技术和ELISA检测方法确定枯草芽孢杆菌培养上清液诱导SBD-1表达的最佳刺激时间。[结果]①对ORECs无明显毒性作用的枯草芽孢杆菌对应的培养上清液浓度范围为10^(7)~10^(11) CFU/mL,刺激时间范围为2~24 h。②利用qPCR技术和ELISA检测方法筛选出最佳刺激浓度为10^(11) CFU/mL枯草芽孢杆菌对应的培养上清液。③以该浓度枯草芽孢杆菌对应的培养上清液刺激ORECs不同时间,采用qPCR技术和ELISA检测方法确定枯草芽孢杆菌培养上清液诱导SBD-1表达的最佳刺激时间为24 h。[结论]枯草芽孢杆菌培养上清液可以诱导ORECs SBD-1的表达。

热应激对奶山羊瘤胃上皮细胞屏障通透性的影响

【目的】研究热应激对奶山羊瘤胃上皮细胞屏障通透性的影响,为动物在炎热环境中能够维持正常生理机能以及探索促进动物抗热应激的方法提供理论基础和试验依据。【方法】选用泌乳中后期奶山羊,采用逐渐加热的方式建立奶山羊热应激模型,研究热应激对奶山羊血浆中D-乳酸、DAO、内毒素及炎性细胞因子等异常代谢产物的浓度,瘤胃上皮细胞间紧密连接的变化及紧密连接蛋白Occludin表达的影响。【结果】①热应激显著提高了血浆中D-乳酸和DAO浓度;②热应激显著提高了血浆中内毒素及炎性细胞因子TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-1β、干扰素-γ的浓度;③热应激破坏了瘤胃上皮间紧密连接的结构,并显著降低了紧密连接蛋白Occludin蛋白表达和mRNA表达。【结论】热应激可导致奶山羊瘤胃黏膜屏障功能受损、通透性增加、菌群移位,其机制可能与瘤胃上皮细胞紧密连接蛋白Occludin表达下降有关。

热应激对奶山羊生产性能及瘤胃上皮细胞形态结构的影响

【目的】研究热应激对奶山羊生产性能及瘤胃上皮细胞形态结构的影响,为动物在炎热环境中能够维持正常生理机能以及探索促进动物抗热应激的方法提供理论基础和试验依据。【方法】本项目以泌乳中后期奶山羊为动物模型,采用逐渐加热的方式使奶山羊产生热应激,用温湿指数计算当连续1周早、中、晚THI>72时,动物模型建立;采用动物营养学方法,研究热应激对瘤胃内发酵指标、营养物质消化率、生产性能、瘤胃上皮细胞形态结构和超微结构的影响。【结果】①试验期间试验羊THI主要在72和87之间,处于轻度和高度热应激;②热应激极显著地提高了奶山羊直肠温度和呼吸频率(P<0.01),显著地降低了DM、CP、OM、NDF和ADF消化率(P<0.01),干物质采食量和奶产量(P<0.01),以及乳中乳蛋白和乳脂含量(P<0.05),但对乳糖含量影响不显著(P>0.05);③热应激显著降低了一天中各时间点的pH(P<0.05)、NH3-N浓度(P<0.05)、TVFA浓度(P<0.05);④与对照组相比,在热应激30 d时,发现瘤胃液呈稀粥状,酸臭味较浓,且奶山羊瘤胃黏膜乳头呈现大面积的坏死、脱落;当在热应激45 d时,黏膜乳头坏死、脱落情况更为严重;⑤在热应激30和45 d时,瘤胃背囊和腹囊绒毛长度和宽度分别要短于对照组(P<0.05),且随着热应激时间的延长,瘤胃背囊和腹囊的绒毛长度和宽度缩短的也越短(P<0.05)。【结论】①热应激通过显著提高奶山羊的直肠温度和呼吸频率,显著降低日粮各营养物质消化率、瘤胃液发酵参数等,进而显著降低日粮干物质采食量、乳品质及其生产性能;②热应激通过破坏瘤胃上皮组织结构,致使瘤胃黏膜绒毛大面积萎缩、脱落、甚至坏死,进而导致瘤胃黏膜屏障通透性增加。

槲皮素对脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮细胞抗氧化和抗炎的影响

为研究槲皮素对脂多糖(LPS)刺激下山羊瘤胃上皮细胞抗氧化和抗炎的影响,先将山羊瘤胃上皮细胞在添加0、5、10、20、40、60、80、120、160和320μg·mL^(−1)槲皮素的基础培养基中培养6 h后,通过检测细胞活性,确定80μg·mL^(−1)为槲皮素后续试验浓度。然后分成4组,山羊瘤胃上皮细胞在基础培养基(对照组,Con)和基础培养基[分别加入1μg·mL^(−1)的LPS(L)、80μg·mL^(−1)槲皮素(Q)以及1μg·mL^(−1) LPS和80μg·mL^(−1)槲皮素(L+Q)]中培养6 h后,测定相关指标。结果显示:1)与Con组相比,L组瘤胃上皮细胞的过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性显著降低(P<0.05),而丙二醛(MDA)浓度显著升高(P<0.05);Q组瘤胃上皮细胞的CAT、SOD、总抗氧化力(T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性极显著升高(P<0.01),而MDA浓度显著降低(P<0.05)。与L组相比,L+Q组瘤胃上皮细胞的CAT、SOD、T-AOC和GSH-PX活性显著升高(P<0.05)。2)与Con组相比,L组瘤胃上皮细胞因子IK、趋化因子配体5(CCL5)、CXC趋化因子配体6(CXCL6)、CXCL8、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-1β的mRNA相对表达量极显著升高(P<0.01)。与L组相比,L+Q组瘤胃上皮细胞IK、CCL5、CXCL6、CXCL8、IL-6、TNF-α和IL-1β的mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01)。3)与Con组相比,L组瘤胃上皮细胞Toll样受体2(TLR2)、核转录因子κB(NF-κB)、髓样分化因子88(MyD88)和转录因子3(IRF3)的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05),Q组瘤胃上皮细胞Toll样衔接蛋白(TOLLIR)和TLR 4的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。与L组相比,L+Q组瘤胃上皮细胞TLR 2、NF-κB、MyD 88、TOLLIR和TLR 4的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。综上所述,槲皮素能够提高山羊瘤胃上皮细胞的抗氧化和抗炎症性能,促进细胞增殖。

枯草芽孢杆菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

选用益生枯草芽孢杆菌研究其对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素表达的调节作用。首先,在体外成功培养绵羊瘤胃上皮细胞,然后用枯草芽孢杆菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞进行不同浓度、不同时间的刺激,利用荧光定量PCR技术(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-PCR)从mRNA水平检测刺激后上皮细胞中绵羊β-防御素-1(Sheep beta-defensin-1,SBD-1)基因表达水平的差异。结果表明:当菌液浓度为1010 cfu·mL-1刺激上皮细胞8h后,SBD-1的表达量达到最高;不同的菌液浓度诱导下SBD-1的表达量均有显著增加,109、1010、1011 cfu·mL-1菌液浓度刺激下,SBD-1的表达量与空白相比差异极显著(P<0.01)。结果表明,枯草芽孢杆菌能够诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1基因的表达。

丁酸对瘤胃上皮细胞生长和凋亡的影响

采用体外法探讨不同浓度丁酸对瘤胃上皮细胞生长及凋亡的影响。不同浓度丁酸(0,20,40,60,80,100,120,140 mmol/L)处理瘤胃上皮细胞不同时间(4,6,8,10 h)后,MTT法检测各处理组的细胞活力,再选择适宜处理用于TUNEL法、DNA ladder法、流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果表明:随着丁酸添加浓度的升高,瘤胃上皮细胞的相对细胞活力先增加后降低,20 mmol/L丁酸能促进瘤胃上皮细胞的生长,40~140 mmol/L丁酸则降低了瘤胃上皮细胞的细胞活力。添加120 mmol/L丁酸培养6 h诱导了瘤胃上皮细胞发生凋亡,总凋亡指数为28.4%,显著(P<0.05)高于对照组(24.1%)。低浓度丁酸可促进瘤胃上皮细胞生长,而高浓度丁酸则促进细胞发生凋亡。

酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)基因表达的影响

【目的】探索益生性酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(sheep beta-defensin-1,SBD-1)表达的调节作用,为在分子水平上揭示益生菌对防御素的调控机理提供一定的理论基础及依据。【方法】首先将新鲜的绵羊瘤胃组织用PBS和抗生素处理后进行瘤胃上皮细胞原代培养,当原代细胞数量长到细胞培养瓶的85%以上时,将细胞传于12孔板用于细胞刺激试验。同时将活化并纯化后的酿酒酵母菌25℃、180 r/min有氧培养48 h后,进行5次平行平板计数试验,根据平板计数的数据处理方法,得到浓度为5.2×108CFU·m L-1的酿酒酵母菌液,再通过倍比稀释把所得菌液依次稀释成浓度为5.2×107、5.2×106、5.2×105、5.2×104CFU·m L-1的菌液,用以上不同浓度(5.2×104—5.2×108CFU·m L-1)的酿酒酵母菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞分别进行不同时间(2、4、8、12、24 h)的刺激,并设置对照组用DMEM/F12培养基代替酿酒酵母菌。然后提取总RNA,逆转录为c DNA后,利用实时荧光定量PCR技术和酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测瘤胃上皮细胞中SBD-1表达差异。最后用SAS 9.2软件对数据进行相关差异性分析。【结果】荧光定量PCR结果表明,在各时间组内SBD-1 m RNA的表达量随着菌液浓度的增加均呈先升高后降低的趋势,当菌液浓度为5.2×107CFU·m L-1时表达量达到最大,并与对照组和其他浓度组相比差异极显著(P<0.01)。当菌液浓度一定时,SBD-1 m RNA的表达量先是随着刺激时间的延长而呈上升趋势,刺激时间为12 h时SBD-1 m RNA表达量达到峰值,之后呈下降趋势。因此,当浓度为5.2×107CFU·m L-1的菌液刺激瘤胃上皮细胞12 h后,SBD-1基因的表达量达到最高,且与此浓度下其他时间组的表达量相比差异极显著(P<0.01)。ELISA检测结果显示,SBD-1蛋白表达趋势与SBD-1 m RNA检测结果基本一致。不同浓度的菌液分别刺激绵羊瘤胃上皮细胞2、4、8、12、24 h后均能提高共培养上清中SBD-1蛋白的表达,且与对照组相比存在极显著差异(P<0.01)。在菌液浓度为5.2×107CFU·m L-1刺激瘤胃上皮细胞12 h后SBD-1蛋白分泌水平达到最高,与此浓度下各时间组相比差异极显著(P<0.01)。【结论】酿酒酵母菌能够提高绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达,且菌液浓度为5.2×107CFU·m L-1刺激瘤胃上皮细胞12 h后,SBD-1的表达量达到最高。

酿酒酵母甘露聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(S BD-1)表达的影响

为探究酿酒酵母菌细胞壁成分甘露聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞(RECs)β-防御素-1(SBD-1)表达的影响,本研究用不同浓度的甘露聚糖刺激RECs 8 h后,利用荧光定量PCR (qPCR)和ELISA方法分别检测RECsSBD-1 mRNA的转录水平和蛋白表达变化,确定甘露聚糖诱导SBD-1表达量最高的刺激浓度。然后用该浓度甘露聚糖对RECs进行不同时间的刺激,同样利用qPCR和ELISA方法对SBD-1 mRNA转录水平和蛋白的表达变化进行检测,确定甘露聚糖诱导SBD-1表达的最佳时间。qPCR和ELISA结果显示:不同浓度甘露聚糖刺激RECs8 h后,SBD-1 mRNA转录水平和蛋白的表达量均有所增加,但随着甘露聚糖浓度的增加,SBD-1表达量呈现先升高后降低的趋势,且当甘露聚糖浓度为50μg/mL时SBD-1表达量达到最大,并与对照组相比差异极显著(p<0.01)。当用50μg/mL的甘露聚糖分别刺激RECs不同时间后,SBD-1 mRNA转录水平和蛋白的表达量先是随着刺激时间的延长而呈上升趋势,刺激时间为4 h时SBD-1表达量达到峰值,且极显著高于对照组(p<0.01),之后呈下降趋势。结果表明甘露聚糖能够提高绵羊RECs SBD-1的表达,且甘露聚糖浓度为50μg/mL刺激RECs 4h时,SBD-1 mRNA转录水平和蛋白表达量达到最高。本研究为甘露聚糖在体内如何发挥先天性免疫提供了一种新解释,也为更好的开发利用甘露聚糖制剂提供实践指导。

酿酒酵母β-葡聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

为了探索β-葡聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞(ruminal epithelial cells,RECs)β-防御素-1(sheepβ-defensin-1,SBD-1)表达的影响。本研究首先建立绵羊RECs培养体系作为体外试验模型,用不同浓度(0、5、10、20、50和100μg·mL^(-1))的β-葡聚糖刺激RECs 8h后,利用qPCR和ELISA方法检测RECs中SBD-1的表达变化,选出诱导SBD-1表达最高的β-葡聚糖浓度。然后用β-葡聚糖的最佳刺激浓度对RECs分别刺激0、2、4、8、12和24h,同样利用qPCR和ELISA方法对RECs SBD-1的表达变化进行检测,从而筛选出诱导SBD-1表达最高的刺激时间。qPCR和ELISA结果显示,β-葡聚糖(5～100μg·mL^(-1))刺激RECs 8h后,SBD-1mRNA和蛋白的表达随着β-葡聚糖浓度的升高均呈现先升高后降低趋势,且当β-葡聚糖浓度为10μg·mL^(-1)时SBD-1mRNA和蛋白的表达量极显著高于对照组(P<0.01)。当用10μg·mL^(-1)的β-葡聚糖刺激RECs 0～24h后,qPCR结果显示,10μg·mL^(-1)的β-葡聚糖刺激RECs 2h时SBD-1mRNA的表达量最高(P<0.01),之后呈下降趋势,而ELISA结果显示,在β-葡聚糖浓度为10μg·mL^(-1)刺激RECs 4h后SBD-1蛋白分泌水平达到最高(P<0.01)。MTT测定结果显示,100μg·mL^(-1)β-葡聚糖会对绵羊RECs活力产生显著的影响(P<0.05)。本研究结果表明,β-葡聚糖能够提高绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达,且用浓度为10μg·mL^(-1)的β-葡聚糖分别刺激RECs 2和4h后SBD-1的mRNA和蛋白表达达到最高。

短链脂肪酸对奶牛瘤胃上皮细胞促炎因子、趋化因子和紧密连接蛋白表达量的影响

【目的】探究不同时间点短链脂肪酸(SCFAs)对奶牛瘤胃上皮细胞促炎因子、趋化因子和紧密连接蛋白表达量的影响.【方法】试验分4组,每组设3个重复,分别在各组瘤胃上皮细胞中添加20 mmol/L的短链脂肪酸,在添加短链脂肪酸0、2、5、8 h后收集细胞提取细胞总RNA.【结果】在添加SCFAs 8 h时,G-蛋白偶联受体41(GPR41)的表达量显著高于其它各组(P<0.05).添加SCFAs 2 h后IL-1β的表达量显著高于0 h组(P<0.05),8 h时IL-1β的表达量最高.添加SCFAs 5、8 h时,CXCL2的表达量显著高于0 h组(P<0.05);在培养2 h后CXCL8的表达量显著高于0 h组(P<0.05).添加SCFAs 2 h后,Claudin-1和Occludin的表达量显著高于0 h组,并且在2 h时表达量最高(P<0.05).【结论】短链脂肪酸能够提高瘤胃上皮细胞促炎因子、免疫趋化因子、紧密连接蛋白以及GPR41的表达量,从而证明短链脂肪酸可以增强瘤胃上皮的免疫机能.

酿酒酵母β-葡聚糖通过膜受体Dectin-1和TLR-2诱导绵羊瘤胃上皮细胞表达SBD-1的机制研究

为了探索酿酒酵母β-葡聚糖诱导绵羊瘤胃上皮细胞(ovine ruminal epithelial cells,ORECs)β-防御素-1(sheepβ-defensin-1,SBD-1)表达过程中膜受体Dectin-1和TLR-2可能存在的作用。本研究首先利用免疫组化、RT-PCR、免疫荧光和Western blot等方法检测Dectin-1是否在ORECs内表达,并且采用qPCR和Western blot方法对β-葡聚糖刺激ORECs后细胞膜受体Dectin-1和TLR-2的表达变化进行检测。而后用不同浓度的Dectin-1阻断剂昆布多糖或TLR-2特异性封闭抗体分别预处理ORECs后,采用qPCR和ELISA方法检测SBD-1的表达变化,以确定β-葡聚糖诱导SBD-1表达过程中Dectin-1和TLR-2的参与情况。结果显示:1)绵羊瘤胃组织及ORECs内存在Dectin-1表达,且β-葡聚糖刺激ORECs后Dectin-1和TLR-2的表达水平显著增加(P<0.05);2)不同浓度的昆布多糖和TLR-2封闭抗体均可以极显著降低β-葡聚糖诱导SBD-1的表达(P<0.01),且随着阻断剂和封闭抗体浓度的增加,其抑制SBD-1表达的作用越明显。结果表明,Dectin-1在绵羊瘤胃组织及ORECs内均表达,并且酿酒酵母β-葡聚糖在ORECs中诱导SBD-1的表达是由Dectin-1和TLR-2介导产生的。