小尾寒羊瘦素长型受体基因实时荧光定量PCR标准品质粒和标准曲线的构建

本试验旨在制备用于小尾寒羊瘦素长型受体(leptin receptor long form)基因实时荧光定量PCR的标准品质粒和标准曲线。提取初情期前小尾寒羊下丘脑弓状核组织总RNA,进行反转录合成第1链cDNA,然后进行PCR和目的基因片段的回收;通过T-A克隆将该基因片段插入pMD18-T载体中,构建回收产物的重组质粒;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制作和实时荧光定量PCR。重组质粒经PCR扩增和测序,结果表明,瘦素长型受体基因已成功克隆。提示,所构建的瘦素长型受体基因实时荧光定量标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此方法可作为实时荧光定量PCR检测瘦素长型受体基因的标准方法。

小鼠胚胎附植前后瘦素长型受体在下丘脑及消化器官的表达

目的对长型瘦素受体在雌性昆明鼠生殖周期中的表达情况进行研究。方法采用蛋白免疫印迹实验方法对下丘脑、胃、十二指肠组织中的瘦素受体进行了分析,并用免疫组织化学染色法对雌性KM鼠生殖周期不同阶段的下丘脑、胃、十二指肠组织中表达的瘦素长型受体进行定位分析。结果与结论瘦素受体六个亚型的分子量大约分别为(120、90、77、66.2、54、47)×103;下丘脑神经元胞质中有棕褐色阳性颗粒,且数目随妊娠日龄增加而增加;胃底腺中下部分胞质和细胞核有棕褐色阳性颗粒,且阳性率随妊娠日龄的增加而增加;十二指肠腺中胞质和细胞核有棕褐色阳性颗粒,且阳性率随妊娠日龄的增加而增加。

大豆异黄酮对大鼠肠道上皮内淋巴细胞、杯状细胞及瘦素长型受体的影响

大豆异黄酮具有广泛的生理作用,其对免疫系统的影响近年来成为一个焦点。为了研究大豆异黄酮对肠黏膜屏障结构的重要组成部分(上皮内淋巴细胞、杯状细胞)及免疫调节因子瘦素受体(长型)的影响,本实验采用高脂饲料喂饲大鼠,建立肥胖模型;然后将筛选出的肥胖大鼠分别灌胃剂量为对照(I:0mg/kg)、低(Ⅱ:50mg/kg)、中(Ⅲ:150mg/kg)、高剂量(Ⅳ:450mg/kg)的大豆异黄酮,并设置基础对照组(Ⅴ:溶媒为0.5%羧甲基纤维素钠),连续4周用HE、PAS染色观察小肠上皮内淋巴细胞、杯状细胞数量和分布变化;用免疫组织化学SABC法测定瘦素受体(长型)水平。结果表明:大鼠上皮内淋巴细胞以小型淋巴细胞为主,主要分布于上皮的基底膜附近;大鼠杯状细胞分布在肠黏膜上皮层;瘦素受体(长型)阳性细胞分布于黏膜层。应用大豆异黄酮高剂量组较对照组大鼠的肠黏膜上皮内淋巴细胞数量和杯状细胞的数量明显增加,且有向肠内层移动趋势,同时肠黏膜瘦素受体(长型)水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。表明大豆异黄酮在一定程度上可促进大鼠小肠黏膜屏障结构趋于完整并提高其免疫功能。

单个核细胞内长型和短型瘦素受体的表达

目的:探讨肥胖者和瘦者单个核细胞内长型瘦素受体(OB—RL)和最短的膜结合瘦素受体(OB—Rs)的表达。方法:从50例健康个体(30例肥胖者,BMI 25～18.9 k/m2;20例瘦者,BMI 25～47.2 kg/m2)中获取末稍血,用淋巴细胞分离液从血样中分离单个核细胞,用逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)定量研究OB—Rs和OB—RL的表达水平,所有PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

瘦素及其受体系统在小鼠胚泡着床过程中子宫内膜的表达

目的:探讨瘦素(leptin)及其受体(Ob-Rb)在小鼠胚泡着床过程中子宫内膜的表达规律,以明确其在胚泡着床过程中的可能作用。方法:采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),检测小鼠胚泡着床过程中子宫内膜leptin及其受体(Ob-Rb)的表达。结果:leptin在胚泡着床过程中在小鼠子宫内膜也都有表达,各时期的表达水平差异不明显(P>0.05);Ob-Rb在胚泡着床过程中在小鼠子宫内膜也都有表达,各时期的表达水平差异(P<0.01),且在孕期第4天表达水平最高,在5到7天仍然维持在一定水平。结论:瘦素及其受体(Ob-Rb)可能在胚泡着床过程中发挥作用,同时也可能参与着床后胚胎的生长发育。

奶牛乳腺中瘦素及其受体的表达与定位

为探讨瘦素在奶牛乳腺发育、泌乳及退化各时期的表达变化规律及在乳腺组织中的具体位置,采用免疫印迹(western blot-ting)技术及激光共聚焦技术检测奶牛乳腺组织中瘦素及瘦素受体(OB-Rb)的表达变化及其定位。结果表明,瘦素在青春期表达量较高,在泌乳期表达量最低。瘦素受体在青春期和妊娠期表达量较高,泌乳期表达量相对较低,退化期逐渐恢复到妊娠期水平。

瘦素对IL-1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞MMP-13 mRNA表达的影响

目的:探讨瘦素对IL-1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞基质金属蛋白酶-13(MMP-13)mRNA表达的影响及其机制。方法:体外培养大鼠膝关节软骨细胞,取第3代细胞采用免疫细胞化学方法及甲苯胺蓝染色法鉴定Ⅱ型胶原及蛋白多糖表达;MTT法检测不同质量浓度瘦素环境下正常及IL-1β诱导软骨细胞的增殖活力;实时定量PCR法检测不同质量浓度瘦素处理后IL-1β诱导软骨细胞MMP-13 mRNA的表达,ELISA法检测培养基上清肿瘤坏死因子α(TNFα)的水平;通过小RNA干扰(siRNA)抑制瘦素长型受体(OB-Rb)表达,观察瘦素对MMP-13 mRNA表达的影响。结果:所有细胞均能分泌Ⅱ型胶原及蛋白多糖。MTT结果显示,低质量浓度瘦素对细胞增殖无明显影响,瘦素质量浓度大于等于10 ng·ml-1后可显著促进细胞增殖;而10 ng·ml-1的IL-1β可显著抑制细胞增殖,同时给予100 ng·ml-1及1μg·ml-1瘦素则可进一步抑制细胞增殖,差异均有统计学意义(P<0.05)。实时定量PCR结果显示,IL-1β可增加软骨细胞MMP-13 mRNA表达及TNFα分泌,而加入瘦素(100 ng·ml-1)后可进一步刺激MMP-13 mRNA的表达及TNFα的分泌,差异具有统计学意义(P<0.05)。转染OB-Rb siRNA的软骨细胞OB-Rb mRNA的表达显著下降(P<0.05),MMP-13 mRNA的表达则不受影响;IL-1β处理对转染组OB-Rb的mRNA表达无明显影响,但可显著诱导MMP-13 mRNA的表达增加(P<0.05),进一步加入瘦素后,OB-Rb mRNA的表达有所增加,但表达量远远低于siRNA未处理组,差异具有统计学意义(P<0.05),MMP-13 mRNA的表达则未见增加。结论:一定浓度的瘦素可通过与OB-Rb结合促进IL-1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞MMP-13 mRNA表达,具有降解软骨作用。

运动、膳食干预下细胞信号抑制因子3对肥胖大鼠外周瘦素抵抗作用机制的研究

目的:观察运动、膳食干预下肥胖大鼠肝脏细胞信号抑制因子3(SOCS3)、长型瘦素受体(LP-Rb)蛋白水平的变化,探讨SOCS3在肥胖大鼠外周瘦素抵抗发生及改善过程的作用。方法:以高脂饮食制备肥胖瘦素抵抗大鼠动物模型,随机分组为高脂膳食对照组(H16)、高脂膳食运动组(HHE)、普通膳食运动组(HNE)、普通膳食组(HN)及原有的空白对照组(N16)。运动、膳食干预8周后,采用Western blot法检测大鼠肝脏中SOCS3、LP-Rb水平,放射免疫法测定血清胰岛素水平,用酶联接免疫吸附法测定血清瘦素水平。结果:1)8周干预措施后,各组血清瘦素水平仍显著性高于与N16组(P<0.05),但HNE、HHE组已显著性低于H16组(P<0.05),且HNE显著性低于HHE及HN组(P<0.01);2)运动、膳食干预并未造成各干预组大鼠肝脏LP-Rb蛋白水平与H16组的显著性差异(P>0.05)3)H16组与N16组大鼠肝脏SOCS3蛋白水平无显著性差异,只有HNE组大鼠肝脏SOCS3蛋白较H16组及N16组有显著性下降(P<0.01),且显著性低与HHE及HN组(P<0.01)。结论:1)高脂膳食导致大鼠肝脏LP-Rb蛋白水平显著下降可能是外周瘦素抵抗的发生机制之一。但运动、膳食干预并不能提高大鼠肝脏LP-Rb蛋白水平,提示肥胖大鼠瘦素抵抗的改善可能与肝脏LP-Rb蛋白水平无关。2)运动联合膳食干预可以显著性下调大鼠肝脏SOCS3蛋白水平,但却对LP-Rb无任何影响作用,提示SOCS3可能是通过影响瘦素受体后信号水平调节体内物质能量代谢,而改善外周瘦素抵抗状态。

大熊猫胃肠道神经肽Y和长型瘦素受体的表达

为了观察神经肽Y(NPY)和瘦素长型受体(OB-Rb)在大熊猫胃肠道的表达分布,并探讨其功能。本实验选用中国保护大熊猫研究中心濒危动物繁殖与保护遗传四川省重点实验室提供的3例大熊猫胃肠组织样品,采用HE和免疫组化SABC法进行组织学、NPY及OB-Rb蛋白的表达研究。HE染色结果显示3例大熊猫胃肠道组织学结构完整,主要表现在单细胞和多细胞黏液腺丰富、小肠绒毛较长,肠道黏膜肌层与肌肉层较厚等。免疫组化方法观察到NPY和OB-Rb阳性产物广泛分布于大熊猫的胃肠道中。NPY阳性神经纤维呈串珠状或点状排列,主要位于黏膜下神经丛和肌间神经丛内,前者阳性神经纤维数量较多。NPY阳性细胞主要分布于黏膜层和肠腺,多呈椭圆形、多边形等。OB-Rb阳性产物主要分布在黏膜层,且在固有层内有大量阳性细胞分布。表明NPY和OB-Rb在大熊猫肠道中的广泛表达,为研究NPY和OB-Rb影响肠道的生长发育、消化吸收、免疫等多种功能奠定了基础。

孕激素对人绒毛滋养层细胞表达ADAM10、Ob-R及分泌SLR、LEP的影响

目的探讨不同浓度孕激素对早孕人绒毛滋养层细胞表达基质金属蛋白酶10(ADAM10)、长型瘦素受体(Ob-R)及分泌可溶性的瘦素受体(SLR)、瘦素(LEP)的影响。方法培养原代人绒毛滋养层细胞,分别给予含有不同浓度的孕激素(0、100、150、200 ng/m L)培养24 h,检测细胞内ADAM10和Ob-R的相对表达量及上清液中SLR及LEP的含量。结果随着孕激素浓度的增加,早孕人绒毛滋养层细胞表达ADAM10的含量逐渐降低,组间两两比较有统计学差异(P<0.05)。随着孕激素浓度的增加,早孕人绒毛滋养层细胞表达Ob-R的含量逐渐增加,组间比较无统计学差异(P>0.05)。各组细胞上清液中SLR含量随着孕激素的浓度增高而逐渐降低,组间两两比较有统计学差异(P<0.05)。各组细胞上清液中LEP浓度随着孕激素浓度的增高而逐渐增高,组间两两比较有统计学差异(P<0.05)。采用Pearson检验发现SLR的表达与LEP的表达存在显著性负相关(R=-0.949,P<0.01)。结论孕激素可能通过影响ADAM10、SLR、LEP的表达而调控瘦素功能的发挥,参与妊娠期糖尿病(GDM)发生。

天疱疮患者外周血单个核细胞瘦素受体mRNA的表达研究

瘦素受体主要分为长型瘦素受体（OB-ab）和短型瘦素受体（OB-Ra）。我们曾发现天疱疮患者血清瘦素水平增高及可溶性瘦素受体水平下降。为进一步探讨瘦素受体在转录水平上是否存在异常，采用RT-PCR方法对天疱疮患者外周血单个核细胞（PBMC）OB-Ra和OB-Rb mRNA表达进行了检测，现将结果报告如下。

大鼠重组瘦素对成熟脂肪细胞细胞因子信号转导抑制因子3表达的影响

目的模拟肥胖者体内高瘦素环境,探讨瘦素处理脂肪细胞细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS-3)mRNA及蛋白表达变化。方法分离SD雄性大鼠附睾成熟脂肪细胞,RT-PCR法检测瘦素长型受体(OB-Rb)mRNA表达,并采用0.5～500nmol/L重组大鼠瘦素处理分离的成熟脂肪细胞0、0.5、2和6h,RT-PCR法检测SOCS-3 mRNA表达。免疫沉淀及Western blot检测SOCS-3蛋白表达。结果成熟脂肪细胞可表达少量的OB-Rb;未经瘦素处理的脂肪细胞SOCS-3 mRNA和蛋白只有少量表达,瘦素浓度0.5nmol/L时SOCS-3表达无明显变化,当瘦素浓度在5、50及500nmol/L时,SOCS-3表达量随时间延长而增加。结论瘦素可对脂肪细胞产生直接作用,并且可以诱导SOCS-3的表达增加。