色素上皮衍生因子通过抑制PI3K/Akt通路降低宫颈癌HeLa细胞活性和侵袭相关蛋白表达

目的:探讨色素上皮衍生因子(PEDF)通过抑制磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路,从而下调人宫颈癌HeLa细胞的活性和侵袭相关蛋白c-Met表达的相关机制。方法:选取本院病理已确诊的40例宫颈癌样本及对应的40例癌旁正常组织样本,通过免疫组织化学法检测PEDF、PI3K和p-Akt蛋白的表达。在细胞水平分为正常宫颈上皮细胞HCerEpiC组、HeLa组、HeLa+PEDF组、HeLa+PEDF+PI3K/Akt激活剂组和HeLa+PI3K/Akt抑制剂组。通过蛋白质印迹(Western blotting)检测各组细胞内PEDF、PI3K、p-Akt、Akt及c-Met蛋白的表达水平,CCK-8法检测各组细胞的活性。结果:宫颈癌样本和HeLa细胞中的PI3K/Akt通路显著激活,且PEDF表达显著下降(P<0.01)。PEDF可以显著抑制HeLa细胞中PI3K/Akt激活和细胞活性以及侵袭相关蛋白水平的增加(P<0.01)。Akt激活剂可以逆转PEDF对HeLa细胞活性和侵袭蛋白表达的影响,而激活PI3K无法改变PEDF的作用。单纯的药物抑制PI3K/Akt通路不足以模拟PEDF对HeLa细胞的作用。结论:PEDF通过PI3K/Akt双重抑制作用降低HeLa细胞活性和侵袭相关蛋白表达,这为临床上PEDF治疗宫颈癌提供了新的思路和理论依据。

全反式维甲酸对兔颈动脉粥样硬化病灶VSMC增殖及AKT1表达影响

目的探讨全反式维甲酸(atRA)对兔颈动脉内膜损伤后内膜增生以及蛋白激酶B(AKT1)、增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响和机制。方法新西兰雄性大白兔36只,随机分为6组:假手术A、B组,手术A、B组,手术并予atRA治疗A、B组(治疗A、B组),每组各6只。各组均给予高脂饮食14d后,手术组作颈动脉内膜损伤模型。治疗组于术前3d开始每天给予atRA灌胃,其余操作同手术组。假手术组手术但不损伤内膜。于术后7d处死A组动物,28d处死B组动物。采取颈动脉标本,对血管粥样硬化病变进行大体形态学观察,用免疫组化法检测粥样硬化病灶中AKT1、PCNA的表达水平。结果手术组术后7d内膜开始增生,28d时增生明显,粥样斑块形成,管腔狭窄,AKT1、PCNA阳性表达明显。治疗组内膜增生较轻,28d时,内膜面积及斑块厚度低于手术组(t=3.797、3.704,P<0.01),AKT1、PCNA阳性表达指数亦低于手术组(t=4.741、2.890,P<0.05)。结论atRA能抑制兔颈动脉内皮损伤后AKT1、PCNA的表达,抑制平滑肌细胞增殖,从而抑制内膜增生及动脉粥样硬化病变进程。

EBP50、AKT2在乳腺癌中的表达及意义

目的:研究乳腺癌组织中EBP50、AKT2蛋白的表达与临床病理指标的关系及其预后意义。方法:应用免疫组化SP法检测56例乳腺癌组织、30例癌旁正常乳腺组织石蜡切片中EBP50、AKT2的表达情况,并分析2种蛋白分子的表达与临床病理学指标之间的关系。结果:EPB50、AKT2阳性表达于细胞浆和细胞膜,呈棕黄色颗粒。EBP50在乳腺癌组织中的阳性表达率(37.50%)低于其在正常乳腺组织中的阳性表达率(93.33%,χ2=24.843,P<0.05)。AKT2在乳腺癌组织中的阳性表达率(76.79%)高于其在正常乳腺组织中的阳性表达率(23.33%,χ2=22.933,P<0.05)。不同组织学分级和临床TNM分期之间的EBP50表达差异有统计学意义(P<0.05),有腋淋巴结转移者的乳腺癌EBP50阳性表达率低于无腋淋巴结转移者,而AKT2阳性表达率高于无腋淋巴结转移者。乳腺癌中EBP50的表达AKT2呈负相关(rs=-0.273,P<0.05)。结论:EBP50、AKT2的异常表达与乳腺癌的发生、发展及浸润转移有关,可作为判断乳腺癌生物学行为和预后的重要指标。

葡萄糖对HTR8/SVneo细胞Akt2基因甲基化的影响及妊娠早期外周血Akt2 mRNA水平与妊娠前BMI和GDM的关系

目的探索葡萄糖对滋养层细胞系HTR8/SVneo细胞Akt2基因甲基化和mRNA水平的影响及早孕期外周血Akt2 mRNA水平与孕前体质指数(BMI)和妊娠期糖尿病(GDM)的关系。方法(1)构建GDM孕妇子宫内高血糖环境细胞模型,按培养液的葡萄糖浓度分为2.5、5.0、10.0、25.0、40.0 mmol/L 5组;使用实时荧光定量PCR技术检测Akt2 mRNA水平,质谱检测Akt2基因启动子区域的甲基化水平。(2)收集2014年12月至2016年7月在北京大学第一医院分娩的60例孕妇的早孕期外周血,根据其孕前BMI及有无GDM分为4组:超重非GDM组、超重GDM组、肥胖非GDM组和肥胖GDM组。实时荧光定量PCR技术检测4组孕妇早孕期外周血中Akt2 mRNA水平。结果(1)随培养液中葡萄糖浓度的升高,Akt2 mRNA水平显著升高,呈浓度依赖性(P均<0.05)。与25.0 mmol/L组相比,5.0 mmol/L组Akt2基因启动子区域的甲基化位点胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)10、CpG23、CpG24.5,2.5 mmol/L组Akt2基因启动子区域CpG23、CpG24.5位点,10.0 mmol/L组Akt2基因启动子区域CpG10位点,均出现显著的甲基化水平的改变(P均<0.05);与5.0 mmol/L组相比,40.0 mmol/L组Akt2基因启动子区域CpG10位点出现显著的甲基化水平的改变(P<0.05)。(2)与超重非GDM组[1.04(0.90~1.26)]比较,超重GDM组[2.10(1.85~2.28)]和肥胖GDM组[1.68(0.82~2.43)]Akt2 mRNA水平均升高,差异均有统计学意义(P均<0.05)。与肥胖GDM组[1.68(0.82~2.43)]比较,超重GDM组[2.10(1.85~2.28)]Akt2 mRNA水平较高,肥胖非GDM组[1.00(0.71~2.17)]Akt2 mRNA水平较低,但差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论葡萄糖可能通过改变Akt2基因启动子区域的甲基化状态,从而影响Akt2 mRNA水平,且这种变化可能在GDM孕妇的早孕期已经出现,特别是在孕前BMI较低的孕妇中。

Akt2特异性siRNA对人肺癌细胞化疗敏感性及耐药性的影响

目的探讨癌基因蛋白质v-akt（Akt2）特异性siRNA对人肺癌细胞株NCI—H446细胞顺铂化疗敏感性的影响及对耐药蛋白的调控作用。方法构建针对Akt2基因mRNA的siRNA，利用脂质体转染肺癌细胞NCI-H446，反转录-PCR检测Akt2-mRNA的表达，免疫细胞化学法检测肺耐药相关蛋白（LRP）及P糖蛋白（P-gP）的表达。以顺铂分别作用于对照组、未转染组、阴性质粒组及转染组细胞24h后，噻唑蓝（MTr）比色法检测细胞的增殖，流式细胞仪检测细胞的凋亡。结果转染Akt2-siRNA后，NCI-H446细胞Akt2-mRNA表达明显降低，转染组肺癌细胞LRP及P-gP表达水平显著低于未转染组（P〈0．01）。细胞的增殖率从（60．2±2．8）％下降到（34．7±2．6）％（P〈0．01），凋亡率从（19．3±1．6）％上升到（38．8±1．2）％（P〈0．01）。结论Akt2特异性siRNA可明显下调Akt2的表达，提高NCI—H446细胞对化疗的敏感性；它可能是通过下调LRP和P—gp蛋白的表达，部分逆转NCI-H446细胞对顺铂的耐药性。

AKT通过C-myc通路调控肝癌HepG2细胞中PTEN蛋白的表达

目的:探讨C-myc是否参与肝肿瘤HepG2细胞内蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称AKT)对第10号染色体同源丢失性磷酸酶基因和张力蛋白(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)表达的调控。方法:HepG2细胞经不同浓度的AKT抑制剂Capivasertib(5、10及20nmol/L)处理后,采用蛋白质印迹法检测AKT、C-myc和Bad及其磷酸化蛋白的表达情况;实时荧光定量PCR法检测对C-myc下游真核细胞翻译起始因子4E(eukaryotic initiation factor-4E,eIF-4E)、支链氨基酸氨基转移酉每1(branched-chain amino acid aminotransferase 1,BCAT1)及WW结构域E3泛素连接酶1(WW domain-containing E3 ubiquitin protein ligase 1,WWP1)基因转录活性的影响。采用siRNA法沉默HepG2细胞中eIF-4E、BCAT1及WWP1基因的表达,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测沉默eIF-4E、BCAT1及WWP1基因表达对PTEN转录和蛋白表达水平的影响;细胞荧光免疫法检测Capivasertib或沉默WWP1基因表达对PTEN在HepG-2细胞中表达和定位的影响。结果:HepG2细胞经不同浓度的Capivasertib处理8 h后,磷酸化-AKT(phospho-AKT,p-AKT)、p-C-myc和p-Bad蛋白的表达水平均较对照组明显下调(P值均<0.01),C-myc调控的下游基因eIF-4E、BCAT1及WWP1 mRNA的表达水平均明显下调(P值均<0.01)。沉默eIF-4E、BCAT1及WWP1基因表达,对PTEN mRNA的表达均没有明显影响(P值均>0.05),但沉默WWP1基因表达可使PTEN蛋白的表达水平明显上调(P<0.01)。细胞荧光免疫实验进一步证实,沉默WWP1基因表达与Capivasertib作用均可增强PTEN在HepG2细胞中的表达水平并使其在细胞膜上聚集。结论:AKT能通过C-myc信号途径影响WWP1基因的转录水平,进而实现对HepG2细胞中PTEN表达的调控。

PTEN/PI3K突变对肺癌细胞基因表达谱的影响

目的:探讨第10号染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)和磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)基因突变对肺癌细胞基因表达谱的影响。方法:采用蛋白质印迹法检测19株非小细胞肺癌细胞中PTEN表达情况,测序验证PTEN基因是否发生突变,检测该突变对于PTEN下游分子AKT和mTOR通路产生的影响。利用基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)方法对19株肺癌细胞的基因表达谱数据进行PTEN/PI3K突变的功能分析。结果:19株非小细胞肺癌细胞中有5株PTEN蛋白表达缺失,通过测序发现这5株均存在PTEN突变;文献检索另有2株存在PIK3CA突变。PTEN突变后其下游分子AKT和mTOR通路处于持续活化状态。借助GSEA法对肺癌细胞基因表达谱数据进行分析,发现PTEN(或PI3K)突变对肺癌细胞的线粒体-能量代谢的基因集产生了重要影响。结论:PTEN/PI3K突变对其下游分子AKT和mTOR通路产生明显影响,对肺癌细胞基因表达谱的影响主要体现在线粒体-能量代谢方面的基因集。这一发现提示,有必要重视线粒体-能量代谢在肺癌发生中的作用。

GPER在雌激素激活的子宫内膜癌细胞内PI3K／Akt信号通路中的作用

目的探讨G蛋白偶联ER（GPER）在1713雌二醇（1713-E2）激活的子宫内膜癌细胞内磷脂酰肌醇3激酶（P13K）／蛋白激酶B（Akt）信号通路中的作用。方法应用免疫组化sP法检测子宫内膜癌细胞系HEC-1A和Ishikawa细胞中GPER、ERa、ERl3、Akt和磷酸化Akt（p-Akt）蛋白的表达部位。应用蛋白印迹法检测1×10μmol／L的17β-E2，处理不同时间（分别为0、15、30、60、120min）后HEC-1A和Ishikawa细胞中Akt蛋白活化水平及GPER、ERa和ER[3蛋白表达水平的变化。结果免疫组化SP法检测显示，在HEC-1A细胞中，GPER、Akt、p-Akt蛋白在细胞质呈棕黄色阳性表达，ERa蛋白在细胞核呈棕黄色阳性表达，ER13蛋白呈阴性表达；在Ishikawa细胞中，GPER、Akt、p-Akt蛋白在细胞质中均呈棕黄色阳性表达，ERa、ER[3蛋白在细胞核呈棕黄色阳性表达。蛋白印迹法检测显示，1×10μmol／L的1713-E2处理后，Ishikawa和HEC—1A细胞中GPER蛋白的表达水平从处理15min开始即明显升高（P〈0．05），其中Ishikawa细胞在处理30min时达最高（为0．192±0．004），HEC-1A细胞在处理15min时达最高（为0．184±0．006）；lshikawa和HEC-1A细胞中Akt蛋白的活化水平从处理15min开始即明显升高（P〈0．05），其中Ishikawa细胞在处理30min时达最高（为0．666±0．021），HEC-1A细胞在处理15min时达最高（0．7884-0．035）；而Ishikawa和HEC．1A细胞中ERd和ER13蛋白的表达水平无明显变化（P〉0．05）。结论GPER可能介导了P13K／Akt信号通路的活化，参与了子宫内膜癌的非基因转录效应。

双氢青蒿素对前列腺癌PC-3细胞中UCHL1基因表达的调控机制研究

目的 :研究双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)对人前列腺癌PC-3细胞株中抑癌基因泛素羧基末端水解酶L1(ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1,UCHL1)表达的影响,并探讨其可能的调节机制。方法 :PC-3细胞株经不同浓度(25、50和100μmol/L)的DHA处理48 h,并设空白对照组。采用FCM法检测各组细胞凋亡率和细胞周期的变化。采用免疫荧光染色法检测UCHL1和DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)在细胞内的蛋白定位及表达量。蛋白质印迹法检测UCHL1、DNMT1、磷酸化Akt(phospho-Akt,p-Akt)和Akt蛋白的表达;并且以1μmol/L磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)家族抑制剂Wortmanin作为阳性对照,比较分析DHA处理组p-Akt蛋白的表达量。结果 :DHA能明显诱导PC-3细胞凋亡,并使细胞停滞在G2/M期,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。DHA处理组中DNMT1蛋白由细胞核转移到细胞质,与空白对照组比较,DNMT1蛋白在细胞核与细胞质中总的表达水平明显下调(P<0.05);而UCHL1蛋白表达在细胞质内明显上调(P<0.05)。与空白对照组比较,DHA处理组与阳性对照组的UCHL1蛋白表达均上调(P<0.05),DNMT1表达水平均下调(P<0.05),p-Akt蛋白表达水平下调(P<0.05),而Akt蛋白表达量无明显变化(P>0.05);其中,高浓度DHA处理组的p-Akt蛋白表达下调更为显著,更接近于阳性对照组。结论 :DHA能够抑制DNMT1的表达,恢复抑癌基因UCHL1的表达,从而诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡,阻滞细胞周期进程;推测其作用机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路的活性有关。

慢性鼻-鼻窦炎鼻黏膜中糖原合成酶激酶3β与PI3K／Akt及白细胞介素6间的相关性

目的研究慢性鼻-鼻窦炎鼻黏膜中糖原合成酶激酶3B（glycogensynthasekinase313，GSK3p）与P13K／Akt信号通路以及细胞因子白细胞介素（intedeukin，IL）6之间的相关性及其意义。方法分别用半定量反转录聚合酶链反应（RT—PCR）、免疫组化法检测30例慢性鼻一鼻窦炎伴鼻息肉（chronicrhinosinusitiswithnasalpolyps，CRSwNP）患者、20例慢性鼻-鼻窦炎不伴鼻息肉（chronicrhinosinusitiswithoutnasalpolyps，CRSsNP）患者的组织标本以及20例鼻中隔偏曲患者的鼻黏膜标本中GSK313、P13K、Akt的mRNA和蛋白质的表达，并用半定量RT—PCR检测细胞因子IL-6在CRSwNP组、CRSsNP组和对照组鼻黏膜中的表达。采用SPSS16．0软件进行统计学分析。结果GSK313、P13K、Akt、IL-6mRNA在CRSwNP组中的相对表达量分别为0．6254±0．0584、0．8239±0．7186、0．9369±0．0823、0．8973±0．0680，在对照组分别为0．2684±0．0726、0．3578±0．0994、0．6721±0．0590、0．5898±0．0891，差异有统计学意义（t值分别为2．358、3．071、2．764、2．239，P值均〈0．05）。以上四项指标在CRSwNP组和CRSsNP组之间的表达差异无统计学意义（t值分别为1．597、1．842、1．468、0．926，P值均〉0．05）。GSK3B、P13K、Akt蛋白主要表达在黏膜上皮细胞、黏膜下腺体细胞及炎性细胞中，阳性染色主要定位于胞质，其在CRS鼻黏膜中的阳性表达率明显高于对照组中的阳性表达率，差异有统计学意义（x。值分别为16．42、16．25、15．57，P值均〈0．01）。GSK313、P13K、Akt蛋白在CRSwNP组和CRSsNP组的阳性表达率差异无统计学意义（x2值分别为3．27、2．85、2．46，P值均〉0．05）。GSK3B与P13K、Akt以及IL-6在CRS患者中的表达呈正相关趋势（r值分别为0．645、0．617、0．583，P值均〈0．01）。结论IL-6、P13K、Akt、GSK3B在CRS鼻黏膜中的异常表达可能在CRS的发生、发展过程中发挥着一定的作用。

抑制酰基-辅酶A去饱和酶1表达对食管鳞癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制探讨

目的:检测酰基-辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase-1,SCD-1)在食管鳞癌组织和细胞中的表达,分析其表达下调对食管鳞癌EC1细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其相关的分子机制。方法:采用免疫组织化学和原位杂交法检测60例食管鳞癌组织及其相应癌旁正常食管黏膜组织中SCD-1mRNA和蛋白的表达,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测正常食管组织(作为阴性对照)和食管鳞癌细胞株中SCD-1mRNA和蛋白的表达。不同浓度SCD-1小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染食管鳞癌EC1细胞后,采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测SCD-1mRNA和蛋白的表达,应用CCK-8法检测转染前后EC1细胞增殖的变化,FCM检测转染前后EC1细胞凋亡的改变,蛋白质印迹法检测总Akt、p-Akt、bcl-2和bax蛋白的表达。结果:食管鳞癌组织中SCD-1mRNA和蛋白表达的阳性率显著高于正常食管黏膜组织(P<0.05),其表达上调与肿瘤组织分级、TNM分期和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。此外,与正常食管组织相比,食管鳞癌EC9706、Eca109和EC1细胞中SCD-1mRNA和蛋白表达均显著上调(P<0.05),其中EC1细胞中SCD-1的表达水平最高。50nmol/LSCD-1siRNA能显著下调EC1细胞中SCD-1mRNA和蛋白的表达。SCD-1表达下调可显著抑制EC1细胞的增殖,诱导细胞凋亡;同时,显著上调bax蛋白的表达,并下调p-Akt和bcl-2蛋白的表达,但不改变总Akt的表达水平。结论:SCD-1可能在食管鳞癌的发生和发展中具有重要作用,抑制SCD-1的表达有望成为食管鳞癌重要的分子治疗策略之一。

反复双侧颈总动脉闭塞小鼠海马Akt和糖原合成酶激酶-3β表达

目的探讨反复双侧颈总动脉闭塞所致血管性痴呆（vasculardementia，VaD）小鼠海马Akt和糖原合成酶激酶-3β（gtycogensynthasekinase-3β，GSK3β）蛋白表达。方法48只健康雄性C5781／6小鼠随机分为正常组、假手术组和模型组，每组16只。模型组采用反复3次间断阻断双侧颈总动脉建立小鼠VaD模型，假手术组只分离双侧颈总动脉但不阻断，正常组不接受任何处理。术后4周利用水迷宫实验和跳台实验观测各组小鼠行为学改变，采用HE染色观察海马组织病理学变化，采用蛋白质印迹法检测海马Akt、P．Akt（Ser473）、GSK3p、p-GSK3p（Set9）蛋白表达。结果水迷宫实验中，模型组学习阶段和记忆阶段游完全程时间延长（学习阶段：F=19．389，P〈0．05；记忆阶段：F=27．929，P〈0．05），错误次数增加（学习阶段：F=7．228，P〈0．05；记忆阶段：F=21．189，P〈0．05）；跳台实验中，模型组小鼠学习阶段反应时间延长（F=19．162，P〈0．05）、错误次数增加（F=6．562，P〈0．05），记忆阶段潜伏时间缩短（F=10．634，P〈0．05）、错误次数增加（F=12．890，P〈0．05）。同时，HE染色显示模型组海马CA1区神经元减少，神经胶质细胞增生；p-Akt（Ser473）（F=37．849，P〈0．05）和P—GSK3β（Set9）（F=67．725，P〈0．05）蛋白表达在术后4周较假手术组显著上调，而各组间Akt（F=1．004，P〉0．05）和GSK3β（F=0．329，P〉0．05）总蛋白表达无显著差异。结论反复双侧颈总动脉闭塞可造成小鼠学习记忆障碍，海马组织受损严重。磷酸化Akt和GSK3β表达可能参与了VaD的机制。

P13K／Akt信号转导通路与脑缺血后细胞凋亡

细胞凋亡为脑缺血时细胞死亡的重要形式之一.磷脂酰肌醇-3激酶（phosphoinositide-3 kinase,PI3K）/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase,Akt）为重要的细胞存活信号通路,c-Jun氨基端激酶（c-jun N-terminal kinase,JNK）为重要的促进细胞凋亡信号通路.这两大通路转导信号的动态平衡维持着生理状态下的细胞生存与凋亡.脑缺血刺激打破了这一生理平衡,导致大量神经细胞凋亡.多种确切的神经保护因素都与增强细胞存活信号的放大或抑制凋亡信号的放大有关,从而维持这2个通路信号的平衡.

永久性大脑中动脉闭塞大鼠梗死周围组织p-Akt(Ser473)、p-Bad(Ser136)表达与细胞凋亡

目的探讨永久性大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠脑梗死周围组织P—Akt（Ser473）、p-Bad（Serl36）表达的变化及其与细胞凋亡关系。方法60只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术、MCAO3h、MCAO12h、LY294002干预MCAO3h和LY294002干预MCAO12h组，每组12只。改良线栓法制作永久性MCAO模型，LY294002干预组在模型制作前15n血经侧脑室给药。采用Longa法进行神经功能评分，氯化三苯基四氮唑（2,3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）法检测梗死体积，免疫组织化学染色法检测梗死周围组织p-Akt（Ser473）和p-Bad（Serl36）表达，TUNEL法检测梗死周围组织凋亡细胞。结果模型制作后3h，所有实验大鼠均从麻醉中清醒。假手术组神经功能缺损评分为0分，MCAO3h组、MCAO12h组、LY294002干预MCAO3h组和LY294002干预MCAO12h组分别为（2．25±0．45）、（2．92±0．99）、（3．00±0．95）和（3．02±0．36）分，各组间存在显著性差异（F=26．520，P=0．000）。其中，LY294002干预MCAO3h组显著性高于MCAO3h组（P=0．009），LY294002干预MCAO12h组与MCAO12h组无显著性差异（P=0．354）。TTC染色显示，假手术组未见梗死灶，MCAO3h组、MCAO12h组、LY294002干预MCAO3h组和LY294002干预MCAO12h组梗死体积分别为（23．4±1．4）、（40．3±1．1）、（31．9±6．0）和（44．4±3．8）mm2，各组间存在显著性差异（F=30．440，P=0．000）。其中，LY294002干预MCAO3h组显著性大于MCAO3h组（P=0．002），LY294002干预MCAO12h组与MCAO12h组无显著性差异（P=0．113）。与假手术组相比，MCAO3h组梗死周围组织p-Akt（Ser473）表达显著性增高，MCAO12h组显著性下降；p-Bad（Ser136）表达水平随着MCAO时间的推移呈现进行性下降，同时凋亡细胞数量进行性增多。LY294002干预后，MCAO3h时梗死周围组织p-Akt（Ser473）和p-Bad（Ser136）表达水平均显著性下降，凋亡细胞数量显著性增多（P〈0．05），但对MCAO后12h时的各指标无显著性影响。结论脑梗死早期P13K／Akt信号转导通路的激活以及该通路关键蛋白p-Akt（Ser473）的应激性升高具有脑保护作用，而脑梗死后期该通路活性的衰竭及其关键蛋白的急剧降低则与脑损伤有关。

滋养细胞自噬在子痫前期胎盘中的形成及调控机制

目的探讨自噬在子痫前期患者胎盘滋养细胞中的形成及调控机制。方法选择2016年8月至2016年11月在南京医科大学附属常州妇幼保健院产科剖宫产的20例重度子痫前期患者为子痫前期组，随机选取同期剖宫产的血压正常、无蛋白尿的20例正常孕妇为对照组。同时收集2组孕妇胎盘组织，采用透射电镜观察胎盘滋养细胞的超微结构及自噬体形成情况，实时定量聚合酶链反应和Western印迹法检测胎盘组织中微管相关蛋白1轻链3B（microtubule associated protein 1 light chain 3B，MAP1LC3B，亦称LC3B）和Beclin 1的表达情况，以及Western印迹法检测胎盘组织中蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，亦称Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路的活性。采用两独立样本t检验或Mann-Whitney U检验对数据进行统计学分析。 结果透射电镜可观察到重度子痫前期患者胎盘滋养细胞胞膜微绒毛稀少、排列紊乱，胞质中可见典型的自噬体形成增加。子痫前期组孕妇胎盘组织中LC3B mRNA和蛋白的表达水平及LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值均高于对照组[分别为3.37（2.37~6.11）与0.62（0.25~4.15）、1.40±0.17与1.00±0.13及1.57±0.25与1.00±0.31，Z或t值分别为－4.440、3.274及3.113，P值均〈0.05]。而2组孕妇胎盘组织中Beclin 1 mRNA和蛋白的表达差异无统计学意义（P值均〉0.05）。与对照组相比，子痫前期组孕妇胎盘组织中Akt和mTOR蛋白的磷酸化修饰水平明显下降（分别为1.00±0.29与0.64±0.21、1.00±0.32与0.60±0.22，t值分别为－3.672及－2.895，P值均〈0.05）；但2组胎盘组织中Akt及mTOR蛋白表达差异均无统计学意义（P值均〉0.05）。结论重度子痫前期患者胎盘中Akt/mTOR通路活性下降，滋养细胞自噬过度激活，提示Akt/mTOR通路活性下降致使滋养细胞自噬过度激活可能是子痫前期发病的重要机制。

抑制可溶性环氧物酶对局灶性脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用

目的探讨可溶性环氧物酶（soluble epoxide hydrolase，sEH）抑制剂12-（3-金刚烷-1-基脲基）-十二烷酸[12—（3-adamantan-1-yl—ureido）-dodec—anoicacid，AUDA]对局灶性脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用和机制。方法60只雄性Sprague—Dawley大鼠随机分为假手术组、生理盐水对照组以及小剂量（0．157ml／kg）、中剂量（0．235ml／kg）和大剂量（0．314ml／kg）AUDA处理组（每组12只），各组随机取4只大鼠分别用于梗死体积、细胞凋亡和p-Akt免疫组织化学检测。线栓法建立大脑中动脉闭塞再灌注模型。各AUDA处理组和生理盐水对照组均在再灌注前分别经腹腔给予相应剂量的AUDA或等体积生理盐水。再灌注24h时进行神经功能缺损评分。2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色法检测脑梗死体积。原位缺口末端标记法（TdT—mediated dUTP nick end labeling,TUNEL）检测梗死周围区脑组织细胞凋亡。免疫组织化学法检测梗死周围区脑组织p-Akt表达。结果TTC染色显示，假手术组未见梗死。生理盐水对照组以及小剂量、中剂量和大剂量AUDA组梗死体积分别为（254．146±25．481）、（212．679±7．514）、（150．188±33．997）和（99．563±3．415）mm3，存在显著性差异（F=39．637，P=0．000）。各剂量AUDA组均显著性小于对照组（P均=0．000）。中剂量AUDA组显著性小于小剂量AUDA组（P=0．002），而大剂量AUDA也显著性小于小剂量AUDA组（P=0．000）和中剂量AUDA组（P=0．006）。TUNEL染色法显示，假手术组仅可见少量凋亡细胞[（6．400±1．477）个／高倍视野]。生理盐水对照组以及小剂量、中剂量和大剂量AUDA组凋亡细胞数量分别为（57．550±13．067）、（47．030±8．423）、（34．530±4．393）和（26．400±2．683）个／N倍视野，各剂量AUDA组显著性少于生理盐水对照组（P均〈0．01），中剂量和大剂量AUDA组显著性少于小剂量AUDA组（P均〈0．01），大剂量AUDA组也显著性少于中剂量AUDA组（P〈0．01）。免疫组织化学显示，假手术组仅可见少量p-Akt阳性细胞[（3．325±1．438）个／高倍视野]，生理盐水对照组以及小剂量、中剂量和大剂量AUDA组p-Akt阳性细胞数量分别为（9．450±2．531）、（16．400±3．865）、（22．875±7．974）和（29．300±3．203）个腐倍视野，各剂量AUDA组显著性多于生理盐水对照组（P均〈0．01），中剂量和大剂量AUDA组显著性多于小剂量AUDA组（P均〈0．01），大剂量AUDA组也显著性多于中剂量AUDA组（P〈0．01）。结论抑制sEH可能通过上调P13K／Akt通路减少梗死周围区神经元凋亡和缩小梗死体积，对局灶性脑缺血再灌注大鼠具有神经保护作用。