自发性癫痫大鼠皮质和海马中GLT-1、EAAC1表达异常

目的探讨自发性癫痫大鼠(SER)皮质和海马中GLT-1、EAAC1 mRNA与蛋白的表达情况。方法应用RT-PCR技术检测GLT-1、EAAC1 mRNA的表达;应用Westernblot方法检测GLT-1、EAAC1蛋白的表达;应用免疫组化方法定位GLT-1、EAAC1蛋白。结果SER皮质中GLT-1蛋白表达低于正常Wistar大鼠(P<0.05);EAAC1 mRNA及蛋白表达均低于正常Wistar大鼠(P<0.01);SER海马中GLT-1蛋白表达高于Wistar大鼠(P<0.01);免疫组化结果显示GLT-1、EAAC1在SER、Wistar大鼠皮质和海马中均有表达,且位于细胞膜上。结论SER皮质中GLT-1、EAAC1表达下调可能促进了癫痫的发生;海马中GLT-1蛋白表达上调可能是一种代偿性神经保护机制。

癫痫清颗粒对海人藻酸癫痫大鼠脑组织氨基酸类神经递质含量及学习记忆能力的影响

目的:建立海人藻酸(KA)大鼠癫痫模型,研究癫痫清颗粒对KA大鼠海马内谷氨酸(Glu)含量的影响和探讨其对学习记忆能力的影响。方法:应用脑立体定位仪,在大鼠单侧海马CA3区注射KA,选取造模成功大鼠连续口服给药28 d,观察其学习记忆能力的改变及海马内氨基酸递质含量变化。结果:癫痫清颗粒能有效地改善KA大鼠的学习记忆能力,减少海马内Glu含量。结论:癫痫清颗粒能降低KA大鼠脑内Glu的含量,保护神经元不受Glu的损害,从而减慢了神经元的凋亡,提高了癫痫大鼠的学习记忆能力。

甘草酸对癫痫大鼠海马神经元损伤的保护作用及其机制

目的探讨甘草酸对癫痫大鼠海马神经元损伤的保护作用及相关机制。方法采用氯化锂-匹鲁卡品点燃制作大鼠癫痫模型,造模成功后大鼠随机分为癫痫组及甘草酸组,另外将不做任何处理的大鼠作为正常对照组,每组12只。利用Nissl法和TUNEL法检测大鼠海马神经元损伤及凋亡情况;JC-1法检测大鼠海马神经元线粒体膜电位;比色法检测天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase 3)和caspase 9的活性;Western blot法检测大鼠海马组织中cleaved-caspase 3、9,B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),细胞色素C(CytC),凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)蛋白表达。结果与正常对照组相比,癫痫组神经元细胞数减少(P<0.01),TUNEL阳性细胞数增加(P<0.01),线粒体膜电位降低(P<0.01),caspase 3、9活性提高(P<0.01),Bcl-2及线粒体中CytC表达量下调(P<0.01),Bax及细胞质中CytC、Apaf-1表达量上调(P<0.01)。与癫痫组比较,甘草酸组神经元细胞数增加(P<0.01),TUNEL阳性细胞数减少(P<0.01),线粒体膜电位提高(P<0.01),caspase 3、9活性降低(P<0.01),Bcl-2及线粒体中CytC表达量上调(P<0.01),Bax及细胞质中CytC、Apaf-1表达量下调(P<0.01)。结论通过阻断线粒体途径,甘草酸能够抑制癫痫大鼠的海马神经元损伤。

中药补脑止痫散对癫痫大鼠海马c-fos和PKCa表达的影响

目的利用戊四氮点燃大鼠模型研究中药补脑止痫散对癫痫大鼠海马神经元c-fos和PKCa表达的影响,探讨补脑止痫散抗痫机制。方法将80只大鼠随机分为8组,分别为空白组、模型组、补脑止痫散低、中、高剂量10天组和低、中、高剂量21天组,在戊四氮点燃大鼠模型后,分别用补脑止痫散低、中、高剂量对相应的组别进行灌胃,在预定时间点处死大鼠并取材,用免疫组化法检测海马神经元c-fos和PKCa的表达情况。结果与模型组相比,补脑止痫散中、高剂量组海马神经元c-fos和PKCa的表达量均明显减少,差异极显著(P<0.01);c-fos表达:高剂量组低于中剂量组,中剂量组低于低剂量组,21天组低于10天组,均差异显著(P<0.05);PKCa表达:高剂量组和中剂量组均显著低于低剂量组(P<0.05),中剂量和高剂量组之间比较无显著差异,10天组和21天组比较无显著差异(P>0.05)。结论补脑止痫散能明显抑制癫痫大鼠海马神经元c-fos和PKCa的表达,中、高剂量组作用强于低剂量组;抑制c-fos和PKCa表达是补脑止痫散的抗痫机制之一。

天冰调督胶囊对点燃法致癫痫大鼠记忆行为学改变的影响

目的观察天冰调督胶囊对印防己毒化学点燃法致癫痫大鼠学习记忆行为学改变的影响。方法用印防己毒点燃法建立癫痫大鼠模型,观察天冰调督胶囊的疗效,并以丙戊酸钠、拉莫三嗪作为对照观察。分别用大鼠Morris水迷宫、交替电刺激Y迷宫评价大鼠学习与记忆。结果天冰调督胶囊可明显改善癫痫模型大鼠水迷宫、交替电刺激Y迷宫空间学习记忆指标,迷宫错误次数明显少于模型组,中药高量组并与拉莫三嗪组无显著差异;中药各组寻找平台时间明显缩短,并与丙戊酸纳组比较有一定优势。结论天冰调督胶囊可提高印防己毒化学点燃法致癫痫大鼠学习记忆行为,对促进患者康复具有积极意义。

自发性癫痫大鼠海马Ⅰ型与Ⅲ型钠通道α亚基表达上调

目的通过对照实验探讨自发性癫痫大鼠(SER)与野生型正常大鼠(WTC)海马Ⅰ型和Ⅲ型电压门控性钠通道α亚基mRNA与蛋白的表达情况。方法发现SER癫痫大发作后即刻提取海马组织总RNA,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)表达α1与α3亚基mRNA;应用免疫荧光与免疫组化定位与表达α1亚基蛋白与α3亚基ⅢN蛋白。结果SER海马Ⅰ型与Ⅲ型钠通道α亚基mRNA表达高于WTC(P<0·01);SER海马Ⅰ型钠通道α亚基蛋白表达高于WTC(P<0·01);α3亚基ⅢN型蛋白在SER成鼠有表达,而WTC成鼠无表达。结论SER脑内海马Ⅰ型与Ⅲ型电压门控性钠通道α亚基表达上调,可能是神经元高兴奋性的原因或癫痫发作的继发表现。

柴胡加龙骨牡蛎汤对PTZ点燃型癫痫大鼠脑内氨基酸含量的影响

为了研究柴胡加龙骨牡蛎汤抗癫痫的作用机理,本实验观察戊四唑(PTZ)点燃型癫痫大鼠,服用柴胡加龙骨牡蛎汤治疗后,脑内氨基酸含量的变化。结果表明:PTZ点燃型癫痫大鼠脑内兴奋性氨基酸谷氨酸(GlU)天冬氨酸(ASP)及抑制性氨基酸甘氨酸(Gly)显著升高;而抑制性氨基酸γ-氨基丁酸(GABA)、丙氨酸(Ala)显著降低。经柴胡加龙骨牡蛎汤治疗后γ-氨基丁酸(GABA)、丙氨酸(Ala)含量明显升高,而Glu、ASP、Gly降低不显著,提示癫痫的发作及柴胡加龙骨牡蛎汤抗癫痫的作用可能与脑内ASP、Gln及Gly、GABA、Ala的变化有关。

遗传性癫痫大鼠海马组织Ca^(2+)/Ca_V1.2/CaM/CaMKⅡ信号通路的异常变化

目的研究遗传性癫痫大鼠(tremor,TRM)海马组织电压门控性L型钙离子通道α1C亚单位(CaV1.2)、钙调蛋白(CaM)、钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)和细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的变化情况。方法应用West-ern blot法与免疫荧光双标法检测TRM海马CA1、CA3和DG区CaV1.2、CaM和磷酸化CaMKⅡ(p-CaMKⅡ)的蛋白表达及分布;激光共聚焦显微镜检测TRM海马组织中[Ca2+]i。结果与正常Wistar大鼠相比,TRM海马组织中CaV1.2和CaM的蛋白表达明显升高(P<0.01),而p-CaMKⅡ的蛋白表达明显下降(P<0.01);免疫荧光双标法结果显示:CaV1.2、CaM、p-CaMKⅡ在CA1、CA3区的锥体细胞和DG区的颗粒细胞群表达丰富,同时CaV1.2与CaM、p-CaMKⅡ与CaM在海马各区域均存在共定位;激光共聚焦显微镜检测TRM海马细胞[Ca2+]i明显增强(P<0.01)。结论Ca2+/CaV1.2/CaM/CaMKⅡ通路的异常变化可能参与遗传性癫痫大鼠的癫痫发生与发展。

氨己烯酸对自发性癫痫大鼠小发作和大发作的作用

目的研究氨己烯酸对自发性癫痫大鼠的小发作和大发作的作用。方法通过在自发性癫痫大鼠大脑海马和皮质部位安插电极,观察口服氨己烯酸后对自发性癫痫大鼠的脑电图的影响。结果口服氨己烯酸(100mg·kg-1)后3、4、5h癫痫小发作的出现频率分别下降到给药前的(54±5)%、(41±9)%和(34±4)%(P<0.01)。氨己烯酸使大发作的出现频率分别下降到给药前的(68±13)%、(39±13)%和(21±6)%(P<0.01)。氨己烯酸的抑制效应能被GABAA受体特异性拮抗剂荷包牡丹碱拮抗。结论氨己烯酸具有明显的对抗自发性癫痫大鼠的小发作和大发作的作用,对癫痫大发作的抑制效应是通过GABAA受体发挥作用的。

耐药癫痫患者和难治性癫痫大鼠脑组织与外周血GST-π蛋白表达

目的考察耐药癫痫患者和难治性癫痫大鼠脑组织与外周血谷胱甘肽S-转移酶π(glutathione S-transferaseπ,GST-π)的表达。方法临床收集2010年1月至2014年3月在我院神经外科行手术治疗的耐药性癫痫患者32例,选择同期因脑血管畸形手术切除的10例正常脑组织为对照;动物试验:收集15只对照组和20只难治性癫痫大鼠组,难治性癫痫依据锂-匹罗卡品癫痫模型制备。检测人与大鼠外周血和脑的GST-π水平表达,并进行组间比较。结果耐药癫痫患者脑组织的颞叶20例,额叶6例,枕叶6例。GST-π在耐药癫痫患者和难治性癫痫大鼠脑的颞叶、额叶、枕叶中均有表达,存在于细胞胞浆,染成浅黄色至棕黄色颗粒,与对照组比,耐药癫痫患者和难治性癫痫大鼠脑和外周血GST-π表达明显增加(P<0.05)。结论 GST-π可能参与耐药癫痫的发病,检测外周血GST-π为耐药性癫痫的治疗提供参考。

中药补脑止痫散对癫痫大鼠海马谷氨酸和γ-氨基丁酸含量的影响

目的研究中药补脑止痫散对戊四氮致痫大鼠海马谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)含量的影响,探讨补脑止痫散的抗痫机制。方法 80只大鼠随机分为空白组、模型组、补脑止痫散低、中、高剂量10 d组和低、中、高剂量21 d组。除空白组外,其余各组腹腔注射戊四氮制作癫痫大鼠模型,分别用低、中、高剂量的补脑止痫散灌胃。在预定时间点处死大鼠,取海马切片,用免疫组化法检测海马Glu和GABA的含量变化情况。结果与模型组相比,补脑止痫散中、高剂量组和低剂量21 d组海马神经元Glu含量均显著或极显著地降低,GABA含量均极显著地升高;治疗时间相同而灌胃剂量不同的各组间比较:高剂量组和中剂量组Glu含量均显著低于低剂量组,高剂量组和中剂量组GABA含量均显著高于低剂量组,而中、高剂量组之间比较则均无显著差异;灌胃剂量相同而治疗时间不同的各组间比较:低剂量10 d和21 d组之间有显著差异,中剂量10 d和21 d组、高剂量10 d和21 d组之间无显著差异。结论补脑止痫散能明显降低癫痫大鼠海马Glu含量,提高GABA含量,调节二者之间的平衡;中、高剂量组效果更明显。

自发性癫痫大鼠海马电压门控性钠通道β_1亚基表达与基因突变分析

目的与正常Wistar大鼠作对比,探讨自发性癫痫大鼠(SER)海马中电压门控性钠通道β1亚基mRNA与蛋白的表达情况及基因突变分析。方法应用RT-PCR技术检测β1亚基mRNA的表达;免疫组化方法定位β1亚基蛋白;免疫印迹方法检测β1亚基蛋白的表达;直接测序技术筛查β1亚基全部外显子基因突变位点。结果SER海马β1亚基mRNA表达高于Wistar大鼠(P<0.05);免疫组化结果显示β1亚基蛋白在SER大鼠海马各区中均有表达,且位于细胞膜上;β1亚基蛋白的表达高于Wistar大鼠(P<0.01);直接测序法筛查了β1亚基全部外显子的突变位点,结果未见任何突变。结论SER海马β1亚基表达异常可能会促进癫痫样兴奋活动的产生,进而构成SER癫痫表型的发作基础。

颅痫宁对癫痫大鼠海马内Glu及GABA的影响

目的:观察颅痫宁对癫痫大鼠模型的海马内Glu和GABA的影响。方法:将64只健康SD大鼠随机选取8只做空白对照组、余下动物进行造模,成功后随机分为模型组、西药组(丙戊酸钠组)、颅痫宁高剂量组(2倍常规剂量)、常规剂量组及低剂量组(0.5倍常规剂量)。通过免疫组化法检测海马神经递质Glu和GABA的表达情况。结果:与模型组相比,西药组(丙戊酸钠组)、颅痫宁高剂量组(2倍常规剂量)、常规剂量组及低剂量组(0.5倍常规剂量)均能降低癫痫模型大鼠海马中Glu的含量,增加GABA的含量。结论:颅痫宁能降低癫痫大鼠海马中Glu的含量,增加GABA的含量。

补脑止痫散对戊四氮慢性点燃癫痫大鼠模型GABA及其受体GABAα表达的影响

目的:探讨补脑止痫散对戊四氮(PTZ)慢性点燃癫痫大鼠模型γ-氨基丁酸(GABA)及其受体亚单位α(GABAα)表达的影响。方法:选取60只健康SD大鼠,随机分成6组(空白对照组、癫痫模型组、丙戊酸钠组、补脑止痫散低剂量组、补脑止痫散中剂量组、补脑止痫散高剂量组)。采用连续小剂量腹腔注射戊四氮(PTZ)的方法,建立癫痫大鼠模型(慢性点燃)。获得Ⅲ级以上发作后,停止给药。采用免疫组织化学法,检测各组大鼠海马区GABA及其GABAα的表达。结果:除空白对照组无癫痫样发作外,其余各组都出现Racine分级中的Ⅲ-Ⅴ痫样发作表现。丙戊酸钠组、补脑止痫散高剂量组GABA及GABAα表达明显上调,与模型组比较,有显著性差异(P<0.05)。结论:补脑止痫散对戊四氮慢性点燃癫痫大鼠模型海马区内抑制性递质及受体有明显的上调作用,从而起到保护脑组织、缓解癫痫症状,进而减轻由癫痫导致的脑损伤的作用。

宁痫颗粒联合卡马西平对难治性癫痫大鼠脑组织MDR1基因表达影响的相关性研究

目的:采用宁痫颗粒联合卡马西平治疗难治性癫痫大鼠,观察其对大鼠脑组织MDR1基因表达的影响。方法:Wistar雄性大鼠42只,按体质量随机分为假手术组、模型组、卡马西平+宁痫颗粒高(0.03+4.80 g/kg/d)、中(0.03+2.40 g/kg/d)、低剂量组(0.03+1.20 g/kg/d)、宁痫颗粒组(2.40 g/kg/d)和卡马西平组(0.03 g/kg/d),每组6只。采用海马CA3局部注射海人酸制作大鼠癫痫模型,术后第二天予苯妥英钠药物筛选14 d后成功制作难治性癫痫模型。采用荧光定量PCR法检测MDR1。结果:中药组、西药组及中西药联合组与模型组比较,各组的大鼠脑组织的MDR1含量均降低,差异有统计学意义(P<0.01),与卡马西平组比较,中剂量、高剂量宁痫颗粒联合卡马西平组大鼠脑组织MDR1mRNA含量显著降低(P<0.05)。结论:提示卡马西平组、宁痫颗粒及宁痫颗粒联合卡马西平高、中、低剂量组均可以降低MDR1在难治性癫痫大鼠脑组织中的表达;与单纯卡马西平组比较,宁痫颗粒联合卡马西平中、高剂量组能更明显的促使难治性癫痫大鼠脑组织的MDR1mRNA下调。另从实验大鼠症状、行为观察中发现中、高剂量宁痫颗粒联合卡马西平组可明显抑制痫性发作,而宁痫颗粒组和卡马西平组均未能控制癫痫临床发作。

自发性癫痫大鼠皮质和海马中GLT-1、EAAC-1表达

目的:研究自发性癫痫大鼠皮质、海马中谷氨酸转运体-1(GLT-1)、兴奋性氨基酸载体-1(EAAC-1)的转录、表达水平及其意义。方法:选取自发性癫痫Wistar大鼠(癫痫组)和正常Wistar大鼠(正常组)各10只,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测2组大鼠皮质、海马中GLT-1、EAAC1 m RNA转录水平,采用蛋白质印迹技术检测2组大鼠皮质、海马中GLT-1、EAAC-1蛋白的表达水平。结果:癫痫组大鼠皮质中EAAC-1 m RNA相对灰度值为(0.67±0.21),明显低于正常组大鼠的(1.54±0.38)(P<0.01);2组大鼠皮质中GLT-1 m RNA和海马中GLT-1 m RNA、EAAC-1 m RNA相对灰度值差异无统计学意义(P>0.05)。癫痫组大鼠皮质中EAAC-1、GLT-1蛋白表达水平的相对灰度值分别为(72.6±8.7)和(103.7±12.6),显著低于正常组大鼠的(116.5±15.1)和(139.5±14.2)(P<0.01);癫痫组大鼠海马中GLT-1蛋白表达水平的相对灰度值(196.7±23.5)明显的高于正常组大鼠的(145.5±19.7)(P<0.01);2组大鼠海马中EAAC-1蛋白表达水平的相对灰度值差异无统计学意义(P>0.05)。结论:自发性癫痫大鼠皮质中GLT-1、EAAC-1表达水平下调可能与癫痫发生有关。

miR-7靶向IGF-1R信号通路对癫痫大鼠海马组织的保护作用

目的探讨微小RNA-7(miR-7)靶向胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)信号通路对癫痫大鼠海马组织的保护作用。方法选择雄性SD大鼠40只,随机选择10只为正常大鼠,剩余30只为癫痫模型大鼠,癫痫模型大鼠腹腔注射戊四氮(40 mg·kg^(-1)·d^(-1)),28 d后记录两组大鼠Racine等级评分。造模成功后将30只癫痫模型大鼠随机分为模型组、阴性对照组(转染agomir NC)、miR-7过表达组(转染miR-7 agomir),采用苏木精-伊红染色观察各组大鼠脑海马组织病理形态学改变,qRT-PCR检测各组大鼠脑组织miR-7和IGF-1R mRNA表达水平,双荧光素酶报告实验验证miR-7与IGF-1R的靶向关系,TUNEL法检测各组大鼠脑海马神经元细胞凋亡数,Western blot检测各组大鼠脑组织IGF-1R、磷酸化胰岛素样生长因子-1受体(p-IGF-1R)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平。结果癫痫模型大鼠Racine等级评分显著高于正常大鼠,证明癫痫模型建立成功。正常对照组大鼠海马组织神经元细胞结构形态正常,排列整齐,细胞核饱满,与正常对照组比,模型组和阴性对照组大鼠海马组织神经元细胞减少,排列紊乱松散,细胞核破裂,细胞呈空泡状,miR-7表达水平下降,IGF-1R mRNA表达水平升高,细胞凋亡数目增多,Bax、IGF-1R、p-IGF-1R蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与阴性对照组比,miR-7过表达组大鼠海马组织神经元细胞增多,排列较为整齐,细胞核破裂缓解,细胞结构形态趋于正常,miR-7表达水平升高,IGF-1R mRNA表达水平下降,细胞凋亡数目减少,Bax、IGF-1R、p-IGF-1R蛋白表达水平下降(P<0.05),双荧光素酶实验结果表明IGF-1R是miR-7的靶基因。结论miR-7可能通过靶向IGF-1R信号通路抑制癫痫大鼠海马组织神经元细胞凋亡,从而对癫痫大鼠起到保护作用。

宁痫颗粒联合卡马西平对耐药性癫痫大鼠c-fos基因表达的影响

目的:观察宁痫颗粒联合卡马西平对耐药性癫痫大鼠即早基因c-fos表达的影响,并探讨其作用机制。方法:Wistar雄性大鼠42只,按体质量随机分为假手术组,模型组,卡马西平+宁痫颗粒高[(0.03+4.80)g.kg-1.d-1]、中[(0.03+2.40)g.kg-1.d-1]、低剂量组[(0.03+1.20)g.kg-1.d-1],宁痫颗粒组(2.40 g.kg-1.d-1)和卡马西平组(0.03.g.kg-1.d-1),每组6只。采用海人酸海马CA3局部注射制作大鼠癫痫模型,术后第2天予苯妥英钠药物筛选14 d后制作耐药性癫痫模型。各组灌胃2周后免疫组织化学法检测大鼠即早基因c-fos表达的影响。结果:免疫组化实验显示:各治疗组大鼠耐药性癫痫模型颞叶皮层、海马CA3区c-fos阳性细胞较假手术组表达增强,密集分布,染色较深,同时又低于模型组;宁痫颗粒联合卡马西平各组均抑制c-fos蛋白的表达,作用优于卡马西平组(P<0.05)。各组间比较无显著差异性,宁痫颗粒组与卡马西平组无统计学差异。结论:宁痫颗粒联合卡马西平能抑制即早基因c-fos表达,两者联合疗效明显增强,以联合宁痫颗粒高剂量组疗效最佳,但治疗组指标均完全恢复到假手术组水平。

穴位埋线对癫痫大鼠认知及PI3K-AKT信号通路的影响

目的观察穴位埋线对癫痫大鼠认知及PI3K-AKT信号通路的影响。方法80只SD雄鼠随机分为空白组、模型组、西药组及埋线组,每组20只。模型制造成功后分别进行相应干预共28 d,预定时间行水迷宫实验及处死取海马行TUNNEL、Western Blot法检测PI3K-AKT信号通路相关因子PI3K及Akt的蛋白表达的情况。结果Morris水迷宫实验:模型组大鼠潜伏期明显增多,空间探索实验中模型组的穿越平台数明显少于空白组(P<0.05);西药组及埋线组大鼠的潜伏期时间较模型组均明显缩短,穿越平台数均明显增多(P<0.05)。TUNNEL染色:模型组大鼠海马TUNNEL染色阳性细胞数目明显增多(P<0.05);西药组及穴位埋线组海马TUNNEL染色阳性细胞数目均较模型组明显减少(P<0.05)。Western Blot PI3K、Akt蛋白表达:大鼠癫痫发作后模型组、埋线组和西药组的PI3K及Akt蛋白表达均快速上升,经西药及穴位埋线干预后PI3K、Akt蛋白表达均有不同程度的下降,其中以埋线组蛋白表达下降最多。结论穴位埋线可以通过激活癫痫大鼠PI3K-AKT信号通路来抗神经元细胞凋亡,减少海马神经元损伤及改善认知。