登革病毒2型E蛋白基因真核表达和DNA免疫的研究

将编码登革病毒2型(DV2)氨基末端80％的E蛋白的DNA片段克隆到真核表达载体pCXN2 AG强启动子下游,构建成DV2E重组真核表达质粒pCXN-E。间接免疫荧光显示其可在COS-7细胞中表达。ELISA法检测pCXN2-E DNA免疫BALB/c鼠血清中的E抗体变化和维持规律,结果显示三次免疫后2周已有抗体产生,15周时仍维持较高的水平;血清空斑减数中和实验显示其中和滴度高于1:640;流式细胞计数仪(FACS)检测DNA免疫鼠CD4^+、CD8^+T淋巴细胞变化情况,与注射空载体pCXN2的阴性鼠相比,CD4^+淋巴细胞水平略有上升。CD8^+细胞水平有较大升高(p<0.01);动物保护性实验结果显示,当用致死剂量登革病毒攻击免疫鼠时,其保护率为60％。以上结果表明:pCXN2-E在实验动物内表达出的DV2E蛋白可以诱导免疫动物的体液免疫和细胞免疫应答,尤其是MHC-I限制性杀伤性CD8^+T淋巴细胞水平的提高对清除病毒是十分有利的。因此,DV2 E DNA免疫为登革病毒DNA疫苗的发展进行了有益的探索。

登革病毒2型感染BALB/c小鼠的IL-4、IFN-γ产生动态观察

目的 :探讨登革病毒 2型 (DEN2 )临床分离株感染BALB/c小鼠后其血浆中IL 4、IFN γ产生动态及相关关系。方法 :用不同剂量DEN2临床分离株经皮下多点注射 ,建立BALB/c小鼠感染模型 ,并用双抗体夹心ELISA法检测感染后不同时间各组动物血浆中IL 4、IFN γ浓度。结果 :DEN2感染可使BALB/c小鼠产生IL 4、IFN γ增加 (P <0 0 5 ) ,且细胞因子浓度与病毒感染剂量有关。初次感染阶段两者水平均有升高 ,而再次感染阶段以IL 4升高为主。结论 :在初次感染阶段TH1/TH2应答均发挥重要作用 ;而再次感染阶段以TH2应答为主。

登革病毒2型NS1蛋白DNA疫苗的构建及其免疫效果观察

目的 以登革病毒 2型 (denguevirus2 ,DV2 )非结构蛋白 (non structrulprotein 1,NS1)为靶基因 ,构建DV2 NS1的候选DNA疫苗 ;并探讨其在小鼠体内诱导特异性体液免疫和细胞免疫的作用。方法 将登革病毒 2型NS1 NS2a基因片段克隆至含AG强启动子的真核表达载体pCXN2上 ,构建成重组体pCXN2 NS1 NS2a。在体外将重组质粒转染Cos 7细胞 ,间接免疫荧光检测其在真核细胞中的表达。大量提取空质粒和重组质粒 ,进行动物免疫实验。结果 重组质粒可在真核细胞中有效地表达NS1蛋白。免疫接种小鼠后可诱发机体产生针对NS1蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫。末次免疫前已有抗体产生 ,4周后达高峰。抗体依赖补体介导的溶细胞作用 (antibody dependentcomple ment mediatedcytolysis,ADCC)试验结果显示产生的抗体在体外具有特异的杀细胞作用。淋巴细胞增殖实验结果显示 ,实验组小鼠的淋巴细胞增殖能力与对照组比较差异有显著性。流式细胞计数仪(FACS)检测DNA免疫鼠CD4 + 、CD8+ T淋巴细胞变化情况 ,与注射空载体pCXN2的阴性鼠相比 ,CD4 + 、CD8+ 细胞水平有较大升高 (P <0 .0 1)。动物保护性实验结果显示 ,当用致死剂量登革病毒攻击免疫鼠时 ,有 6 6 .6 %的免疫鼠受到保护。结论 NS1 NS2a基因重组质粒免疫小鼠可以诱?

登革病毒2型感染BALB/c小鼠的IL-4、IFN-γ产生动态观察

目的 探讨登革病毒 2型 (DEN2 )临床分离株感染BALB c小鼠后其血浆中IL 4、IFN γ产生动态及相关关系。方法 用不同剂量DEN2临床分离株经皮下多点注射 ,建立BALB c小鼠感染模型 ,并用双抗体夹心ELISA法检测感染后不同时间各组动物血浆中IL 4、IFN γ浓度。结果 DEN2感染可使BALB c小鼠产生IL 4、IFN γ增加 (P <0 .0 5 ) ,且细胞因子浓度与病毒感染剂量有关。初次感染阶段两者水平均有升高 ,而再次感染阶段以IL 4升高为主。结论 在初次感染阶段TH1 TH2应答均发挥重要作用 ;而再次感染阶段以TH2应答为主。

U937和K562细胞株对登革病毒2型感染性的研究

运用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、酶抗体染色法结合电镜观察和病毒滴定。初步研究了Ｕ９３７和Ｋ５６２细胞株对登革病毒２型感染性。结果显示两株细胞均可被感染，Ｕ９３７和Ｋ５６２细胞的感染率分别为１２％和３３．３％。

登革病毒2型prM蛋白的表达及其抗体的ADE作用研究

目的建立登革病毒2型(DENV-2)前膜蛋白(prM)的原核稳定表达系统,并制备prM多克隆抗体,研究登革病毒特异性prM抗体的中和作用及抗体依赖性感染增强作用(ADE)。方法应用大肠杆菌表达系统表达全长DENV-2 prM蛋白,经电洗脱法纯化重组蛋白,免疫家兔,制备兔抗prM蛋白多抗;应用空斑减数中和试验(PRNT)和流式细胞术(FCM)分别检测prM兔多克隆抗体的中和作用和ADE效应。结果重组prM蛋白在原核系统可获得高效表达,prM蛋白的表达量占大肠杆菌全菌蛋白的15%左右;其免疫血清经Western blotting法证实为登革病毒特异性prM多克隆抗体,用ELISA法检测效价为1:800 000。PRNT表明,prM抗体对成熟和不成熟DENV-2感染C6/36细胞中和作用有限,最大中和程度分别为49.84%和50.22%;FCM结果表明,prM抗体能在较大的抗体稀释度范围(10-2～10-6)增强成熟和不成熟DENV-2感染,且在10-3稀释度时达到最高峰。结论重组DENV-2 prM蛋白有很强的免疫原性,其诱生的prM抗体对登革病毒仅有较弱的中和活性,但却呈现出较强的ADE作用,揭示prM抗体是一种感染增强性抗体。

西双版纳傣族自治州登革病毒2型109例临床特征分析

目的探讨西双版纳傣族自治州登革病毒2型（dengue virus type2，DENV-2）感染患者临床特征，为制订当地登革热有效诊疗方案提供依据。方法对2015年西双版纳傣族自治州人民医院收治的109例DENV-2感染患者临床资料和相关生物化学指标进行回顾性分析。结果109例感染DENV-2患者发热比例为100．0％，全身疼痛为97．2％，皮疹为32．1％，出血为11．0％；白细胞计数减少为80．7％，血小板计数减少为89．0％，凝血功能异常为78．9％，肝功能异常为79．8％，心肌酶谱异常为45．9％，。肾功能异常为4．6％。109例患者中重症13例（11．9％），其余为普通登革热患者。结论2015年西双版纳傣族自治州DENV-2流行出现重症病例倾向比例较高，且合并凝血功能异常、肝损伤、心肌损伤多见，提示一旦登革热患者出现上述指征时，医疗部门应引起高度重视，防止重症或死亡发生。

2型登革病毒检测基因芯片的研制

利用长片断PCR扩增含几乎全长的2型登革病毒cDNA,酶切PCR扩增产物,通过建立2型登革病毒cDNA文库获取芯片探针.用点样仪将探针制备成2型登革病毒检测基因芯片.杂交时采用限制性显示(Re strictionDisplayRD)技术标记样品,ScanArray芯片扫描仪检测杂交信号.杂交结果显示,样品和2型登革病毒基因芯片杂交的敏感性强、特异性高.

登革病毒2型型特异性抗原片段的鉴定及其抗体ELISA检测方法的建立

目的筛选、鉴定登革病毒(Dengue virus,DENV)2型(DV2)型特异性抗原片段;建立优化检测DV2抗体的ELISA方法,并进行临床应用验证。方法采用生物信息学方法分析1~4型(DV1~DV4)及其相近虫媒病毒基因组序列,选择预测得分较高且在不同DV2流行株中高度保守的表位;利用pMal-c2x表达系统制备其原核表达抗原,Western blot法分析其免疫原性;建立优化检测DV2抗体的ELISA方法,并验证方法的特异性及灵敏性;应用优化的方法检测33份各型登革热(Dengue fever,DF)确诊患者及30份健康体检人群血清样本。结果经生物信息学分析,预测获得DV2特异性抗原表位12段,预测得分值较高的8段(E123~128、E131~135、E143~149、E223~229、E286~294、E340~347、E383~387及E391~398)重组表达载体经双向测序证实读码框架准确,经Western blot分析,包含抗原位点E143~149区域的融合表达片段D2Ag3仅与DV2多克隆抗体发生免疫反应。ELISA优化条件为抗原包被浓度2μg/mL,4℃包被24 h,37℃封闭2 h;经该方法分析,D2Ag3原核表达抗原与DV2多克隆抗体反应的A450≥1.37,与其他20种多克隆抗体反应的A450均≤0.04,DV2多克隆抗体在40~20480倍稀释范围内,均可获得阳性检测结果。63份临床阳性样本A450>0.32,阴性样本A450<0.12,检测样本/阴性对照比值(sample/negative,S/N)>2.1。结论成功筛选鉴定了DV2型特异性抗原片段,初步建立了DV2 IgG抗体的ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性及灵敏性,为DF的鉴别诊断提供了技术手段。

2018年湖南省登革病毒2型分离株非结构蛋白1基因的鉴定及分析

目的鉴定并分析2018年湖南省登革病毒2型(dengue virus 2,DENV-2)分离株的非结构蛋白1(non-structural protein 1,NS1)基因。方法利用试剂盒提取登革热患者血清RNA,RT-PCR法鉴定病毒类型及扩增11株分离株NS1基因,并进行基因测序。应用MEGA 7.0软件分析分离株与DENV-2标准株(KM204118)的NS1基因核苷酸及氨基酸序列,利用最大似然法(1000 Boot strap replicate)构建NS1基因的系统进化树。结果共获得11株分离株的NS1基因,经比对发现,除分离株HNNS201804和HNNS201810外,其余分离株在NS1基因第585位碱基由T变为C(无义突变);HNNS201806的NS1基因第936位碱基由C变为T(无义突变)。11株分离株NS1基因其他突变位点均相同,共68处发生碱基突变,其中9个为有义突变。11株分离株与China-ZJ(2017-MH110594)、China-GZ(2018-MK564485、2015-KX621245、2017-MK564483)、Thailand(2017-LC410191)、Singapore(2016-MF314189)、Philippines(2015-KU517847)有较近的亲缘关系。结论2018年湖南省11株分离株均为DENV-2,可能是浙江或广州输入株,也可能是泰国、新加坡和菲律宾等东南亚国家的输入株。

巨噬细胞迁移抑制因子调节登革病毒2型感染诱导人脐静脉内皮细胞自噬的研究

目的:研究原代人脐静脉内皮细胞(primary human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)被登革病毒2型(dengue virus type 2,DENV2)感染后,巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)对腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)自噬信号途径的影响。方法:TCID 50检测DENV2对C6/36细胞的毒力,RT-PCR检测DENV2感染后HUVEC内病毒NS1基因部分片段;透射电子显微镜观察自噬体结构,Western blot检测不同剂量病毒感染HUVEC后对微管关联蛋白Ⅱ(microtubule-associated proteinsⅡ,LC3-Ⅱ)表达的影响和不同时间MIF的蛋白质水平变化,分析MIF与自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的相关性;MIF抑制剂和通路抑制剂分别预处理DENV2感染的HUVEC,Western blot检测MIF、AMPK、ERK、mTOR和LC3-Ⅱ蛋白变化,分析MIF与AMPK自噬通路的关联。结果:实验用毒株对C6/36细胞的TCID 50为10-9.09/ml,被感染的HUVEC内可检测病毒NS1基因部分片段序列。不同剂量病毒感染后,在HUVEC内可形成自噬小体或自噬溶酶体,自噬水平有差异。DENV2感染HUVEC引起MIF和LC3-ⅡmRNA水平的变化呈正相关,MIF抑制剂的处理影响通路蛋白AMPK、ERK和LC3-Ⅱ的表达,但几乎不影响MIF的蛋白质水平。结论:DENV2感染HUVEC引起的MIF变化可影响自噬水平,MIF通过调控AMPK/ERK/mTOR途径影响自噬。

从贵州白纹伊蚊体内分离到一株2型登革病毒

从贵州省独山县麻尾镇白纹伊蚊标本中分离到一株病毒 ,用抗DEN1 4型单克隆抗体经间接免疫荧光法和RT PCR产物酶切分型鉴定为DEN 2 ,并对其NS1和E基因RT PCR产物进行部分基因序列测定 ,与DEN 2NGC株比较 ,麻尾株的NS1基因区有 7个碱基发生点突变 ,E基因区有 1个碱基的插入 ,两个序列被GenBank收录 ,编号分别为AY2 774 0 2、AY2 782 2 6 ;麻尾分离株与其他 9株DEN 2型病毒进行系统发育关系的分析 ,结果显示与D2 - 4 3株系统进化关系最近 ;证明贵州省存在DEN感染的自然循环。

虫媒登革病毒的研究——Ⅰ.Den 2病毒非结构蛋白NS1从感染细胞膜中的分离

应用Con-A亲和层析方法从两株Den2病毒(New Guinea C株和从中国海南省分离的H-87株)感染的C6/36细胞膜中分离的糖蛋白,发现了一种感染细胞中特有的蛋白质。经SDS-PAGE证明该蛋白分子量约46000D,分析其为Den 2病毒的非结构蛋白NS1。并利用Western blot筛选出针对该蛋白4种单克隆抗体。

登革2型病毒NS1基因真核表达载体的构建及意义

目的构建登革2型病毒(DENV2)NS1基因的真核表达载体,为筛选与NS1相互作用的蛋白以及研究机体抵抗登革病毒感染的作用机制奠定基础。方法以DENV2感染THP1细胞的c DNA为模板,采用RT-PCR法扩增具有Flag标签的NS1全长基因,并将其克隆至p SG5质粒中,构建p SG5-NS1-Flag真核表达载体。筛选阳性克隆,分别进行酶切及测序鉴定。采用脂质体转染法将真核表达载体分别转染293T细胞和A549细胞,Western blotting法检测细胞NS1蛋白表达。结果扩增后具有Flag标签的NS1全长基因片段大小为1 089 bp,与预期目的片段大小相符。载体和目的基因NS1都含1个ECORⅠ位点,单酶切片段大小分别为463、4 722 bp,NS1扩增片段和p SG5质粒的双酶切片段大小分别为1 089、4 100 bp;6个阳性克隆中,5、6号克隆酶切片段符合预期大小,并经序列鉴定证实。293T细胞和A549细胞转染空载体后,NS1融合蛋白表达极低,转染真核表达载体后均有NS1融合蛋白表达。结论本研究成功构建了p SG5-NS1-Flag真核表达载体,为与NS1相互作用的免疫调控蛋白、NS1蛋白翻译后修饰以及机体免疫系统抵御登革病毒感染机制的相关研究奠定了基础。

新型登革病毒RNA聚合酶小分子抑制剂Z1降低登革病毒复制和感染的研究

目的 筛选新型的登革病毒RNA聚合酶抑制剂。方法 大肠杆菌原核表达DENV2 RNA聚合酶蛋白NS5RdRp。SPR高通量筛选小分子化合物库,寻找与NS5 RdRp蛋白结合的小分子化合物;CPE、LDH和空斑实验在细胞水平上验证化合物的抗病毒效果;实时荧光定量PCR法检测化合物对病毒RNA合成的影响;免疫荧光法检测病毒复制中间体dsRNA以及病毒蛋白合成;蛋白免疫印迹法检测化合物对病毒蛋白合成量的影响;时间点处理实验判断抗病毒作用阶段。结果 2,5-二氢-1,2-二苯基-4-环己氨基-5-氧代-1H-吡咯-3-甲酸乙酯(Z1)与NS5 RdRp具有结合活性,在细胞水平上具有抗DENV2活性,半数有效浓度(EC50)为4.75μmol·L-1。Z1抑制DENV2 RNA合成,抑制病毒dsRNA的合成,并抑制病毒蛋白的合成,其抑制作用发生在病毒进入后阶段。结论 Z1是新型的登革病毒NS5 RdRp抑制剂,其明显抑制登革病毒RNA的合成,并进一步抑制病毒蛋白的翻译合成,从而抑制子代病毒的复制和释放,其可作为新型的抗登革病毒先导化合物用于进一步的开发。

Hu-TLC-SCID小鼠的建立及其对2型登革病毒的免疫应答

利用２型登革病毒（ＤＶ２）体外免疫人扁桃腺淋巴细胞（Ｈｕ－ＴＬＣ）移植给ＳＣＩＤ小鼠，以建立Ｈｕ－ＴＬＣ－ＳＣＩＤ小鼠。并用不同剂量灭活ＤＶ２加强免疫，观察小鼠对ＤＶ２的免疫应答。结果表明，移植Ｈｕ－ＴＬＣ后第２周起，可在Ｈｕ－ＴＬＣ－ＳＣＩＤ小鼠血清中检出入ＩｇＧ，最高达４１２．８６μｇ／ｍｌ。移植后次日用不同剂量灭活ＤＶ２加强免疫，每２周加强１次，首次加强免疫后第２周，Ｈｕ－ＴＬＣ－ＳＣＩＤ小鼠血清中出现抗ＤＶ２特异性人ＩｇＭ；第４周起有特异性人ＩｇＧ产生，最高达１：６４００。其含量和产生动态与抗原量有关。