新型登革病毒RNA聚合酶小分子抑制剂Z1降低登革病毒复制和感染的研究

目的 筛选新型的登革病毒RNA聚合酶抑制剂。方法 大肠杆菌原核表达DENV2 RNA聚合酶蛋白NS5RdRp。SPR高通量筛选小分子化合物库,寻找与NS5 RdRp蛋白结合的小分子化合物;CPE、LDH和空斑实验在细胞水平上验证化合物的抗病毒效果;实时荧光定量PCR法检测化合物对病毒RNA合成的影响;免疫荧光法检测病毒复制中间体dsRNA以及病毒蛋白合成;蛋白免疫印迹法检测化合物对病毒蛋白合成量的影响;时间点处理实验判断抗病毒作用阶段。结果 2,5-二氢-1,2-二苯基-4-环己氨基-5-氧代-1H-吡咯-3-甲酸乙酯(Z1)与NS5 RdRp具有结合活性,在细胞水平上具有抗DENV2活性,半数有效浓度(EC50)为4.75μmol·L-1。Z1抑制DENV2 RNA合成,抑制病毒dsRNA的合成,并抑制病毒蛋白的合成,其抑制作用发生在病毒进入后阶段。结论 Z1是新型的登革病毒NS5 RdRp抑制剂,其明显抑制登革病毒RNA的合成,并进一步抑制病毒蛋白的翻译合成,从而抑制子代病毒的复制和释放,其可作为新型的抗登革病毒先导化合物用于进一步的开发。

新型冠状病毒RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂研究进展

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型导致的新型冠状病毒感染席卷全球,寻找广谱抗病毒特效药一直是一项重大任务。RNA病毒的RNA依赖性RNA聚合酶是一类不同病毒间在结构和功能上高度保守的关键非结构蛋白,针对该聚合酶为靶点开发新的小分子抑制剂至关重要。本文作者从新型冠状病毒RNA依赖性RNA聚合酶的结构为出发点,详细阐述了该病毒RNA依赖性RNA聚合酶的作用机制以及不同种类抑制剂的特点。着重从药物化学的角度介绍了核苷类似物和非核苷类似物的作用特点和作用机制,综述了多种小分子聚合酶抑制剂化学结构与生物活性之间的关系。

重要人感染RNA病毒复制机制和靶向聚合酶药物开发研究进展

近年来,拉沙热、埃博拉、新冠和尼帕等多种病毒性传染病在世界范围内频繁暴发,给人类健康和社会经济发展带来了巨大威胁。广谱抗病毒药物是主动应对新发突发病毒性传染病的重要手段之一,而其研发的关键是发现病毒特有的保守药物靶点。病毒聚合酶负责病毒基因组的复制和转录过程,蛋白序列相对保守,是理想的药物靶点。本文以重要人感染RNA病毒聚合酶的工作机制和靶向病毒聚合酶的药物开发展开综述,为未来新发突发传染性疾病防控提供新思路和新策略。

流感病毒RNA碱性聚合酶-2抑制剂研究进展

季节流行性感冒是一种易在人际传播的急性病毒感染,是目前对人类健康构成威胁的主要呼吸道传染病之一。迄今为止,流感的预防和治疗主要采用接种疫苗预防和开发抗病毒药物防治并重的应对手段。目前临床应用的抗流感病毒药物包括基质蛋白-2抑制剂(如金刚烷胺)、神经氨酸酶抑制剂(如奥司他韦)、内切酶抑制剂(如巴洛沙韦酯)和聚合酶抑制剂(如法匹拉韦)等,均已产生广泛耐药性。研究开发机制新颖的、与现有药物没有交叉耐药的抗流感病毒药物是解决季节流行性感冒治疗这一尚未完全解决的医学问题,以及应对流感大规模爆发的有效手段。流感病毒RNA碱性聚合酶-2(PB2),由于其在不同流感病毒间的高度保守性而不易产生耐药性,使其成为一个非常有吸引力的药物靶点。目前PB2抑制剂的研究开发已成为抗流感病毒药物的一个热点,特别是围绕明星分子吡莫地韦及其类似物的研究吸引了极大的关注,虽然吡莫地韦因疗效不理想最终止步于Ⅲ期临床试验,但是在其研究过程中所揭示出的PB2蛋白与小分子结合模式及构效关系,为进一步开发该类药物奠定了扎实的基础。本文主要针对PB2抑制剂近10年相关药物化学的研究进展进行综述,并对该药物研究领域的前景提出展望。

RNA依赖性RNA聚合酶作为抗戊型肝炎病毒药物作用靶点的研究进展

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)是造成急性肝炎最常见的原因之一。HEV基因组由5′非编码区、3个开放阅读框(ORF1、ORF2、ORF3)和3′非编码区组成,仅在HEV-1中发现了ORF4,并与ORF1重叠。各种编码蛋白在HEV的复制和感染中发挥着不同的作用,而HEV的复制是由ORF1编码的RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)所介导的。HEV RdRp是由多个蛋白亚基组成的复合酶,具有7个保守基序,这些保守基序在RNA合成过程中发挥核苷酸识别、合成、延伸、修饰和稳定等作用,保证了RdRp的功能,在HEV的复制和转录中起到关键作用。因此,以RdRp作为抗HEV药物作用靶点的治疗方案具有很好的应用前景,是目前药物开发的一种主流思路。目前,已发现利巴韦林、索非布韦、2′-C-甲基胞苷(2CMC)等核苷类RdRp抑制剂和锌、GPC-N114等非核苷类RdRp抑制剂对HEV有较强的抑制作用,可作为潜在的抗HEV药物进行深入研究。笔者对HEV编码蛋白和HEV RdRp的结构与功能进行阐述,总结目前发现的对HEV有抑制作用的RdRp抑制剂,以期为HEV的药物开发提供一种新的思路。

新型抗病毒RNA聚合酶PA亚基抑制剂临床研究进展

流行性感冒(简称流感)是流感病毒引起的对人类健康危害较重的呼吸道传染病。目前抗流感药物的应用主要面临病毒耐药性和对高致病性流感病毒的效价低的问题,如M2离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂存在药效低、时间窗口窄和耐药性等缺点。近来的抗流感药物研发的靶点聚焦于病毒RNA聚合酶。流感病毒RNA聚合酶是病毒在宿主细胞内完成复制和转录过程的关键酶,其中PA亚基通过内切酶活性为流感病毒的转录过程提供引物,成为潜在抗流感药物靶点。本文总结了以PA亚基内切酶为靶点的抗流感药物研究进展,旨在为开发安全有效的新型抗病毒RNA聚合酶抑制剂提供参考。

用逆转录-聚合酶链反应检测海南岛登革热流行区蝙蝠体内登革病毒基因RNA的研究

采用1-4型登革病毒通用引物，用逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）检测海南岛登革热流行区蝙蝠脑细胞登革病毒基因RNA。在35例中，20例阳性；检测18例蝙蝠血清，3例阳性；检测三组埃及伊蛟，1组阳性。用单克隆荧光抗体技术检测20例登革病毒基因RNA阳性的蝙蝠脑细胞压印片，16例阳性，与RT-PCR检测登革热流行区登革病毒基因RNA阳性蝙蝠脑细胞的阳性符合率为80.00%。用PT-PCR检测非流行区蝙蝠脑细胞登革病毒基因RNA，均为阴性。本研究首次证实蝙蝠是登革病毒的贮存宿主，为登革热流行的有效控制提供了一定的科学依据。

基于分子对接筛选宣肺败毒方和血必净注射液中抑制新型冠状病毒RNA依赖的RNA聚合酶的活性物质

目的:筛选宣肺败毒方和血必净注射液中抑制新型冠状病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RNA Dependent RNA Polymerase,RdRp)的活性物质。方法:以新型冠状病毒RdRp作为分子对接的靶蛋白,使用AutoDockTools软件对其去水加氢。利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)检索出宣肺败毒方和血必净注射液中的有效活性小分子化合物,将其导入Chem 3D中进行能量最小化,用AutoDockTools加氢、调节化学键,然后与处理后的RdRp在AutoDock Vina中进行分子对接。最后通过Pymol、Discovery Studio、Ligplot进行可视化处理。结果:从TCMSP中分别检索出宣肺败毒方活性成分230个、血必净注射液活性成分125个。通过分子对接技术筛选出19个与RdRp结合能低于-8.0 kcal/mol的化合物。经可视化处理发现,宣肺败毒方中的大黄素甲醚二葡萄糖苷和埃沃生物苷、血必净注射液中的丹参酚酸j可很好地作用于RdRp的活性口袋,且与RdRp形成传统氢键、碳氢键及疏水键等相互作用。结论:本研究从宣肺败毒方和血必净注射液中筛选出与核苷酸竞争性结合新型冠状病毒RdRp的小分子,为研发抗新型冠状病毒感染的特效药提供理论依据。

TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测登革病毒

目的建立一种敏感、特异、重复性好的登革病毒(Dengue Virus, DV)鉴定方法.方法根据DV 3'端非编码区基因保守序列,设计一套特异性引物和TaqMan MGB探针.利用1998～2004年收集的26份登革热病人临床血清标本,15例乙脑病人血清,DV 4个血清型标准毒株及23株1978～1997年DV 地方流行株和相关西尼罗病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、基孔肯亚病毒等毒株,同时用克隆了1型DV 基因组3'端非编码区序列片段的质粒DNA作为阳性对照,检测所建立方法的特异性、敏感性.结果所建立方法的最低检测限约为每反应5个基因拷贝.用该方法检测4个血清型DV 标准毒株、23株DV 地方流行株和26例分离到DV 的阳性血清标本,检出率为100 %;用该方法检测15例乙脑病人血清、10例麻疹病人血清和西尼罗病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、基孔肯亚病毒,结果均为阴性.结论新建的TaqMan MGB探针检测DV 方法是实验室早期诊断登革热较理想的方法.

polo样激酶1、RNA聚合酶Ⅱ亚基A在人脑胶质瘤中的表达及与预后的关系

目的 探讨polo样激酶1(PLK1)、RNA聚合酶Ⅱ亚基A(POLR2A)在人脑胶质瘤(BG)中的表达及与预后的关系。方法 选取86例BG患者作为观察组,另选取30例非肿瘤脑疾病患者作为参照组,收集观察组患者的BG组织和参照组患者的非肿瘤脑组织。比较两组患者PLK1、POLR2A表达情况和不同临床特征BG患者的BG组织中PLK1、POLR2A的阳性表达情况;比较不同PLK1、POLR2A表达情况BG患者的生存情况;采用Cox回归模型分析BG患者预后的影响因素。结果 观察组患者PLK1、POLR2A阳性表达率分别高于参照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。低分化BG患者的BG组织中PLK1、POLR2A阳性表达率均高于中高分化患者,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。PLK1、POLR2A阳性表达患者的中位生存时间均明显短于PLK1、POLR2A阴性表达患者,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。Cox多因素回归分析结果显示,低分化、PLK1阳性表达、POLR2A阳性表达均为BG患者预后的独立危险因素(P﹤0.05)。结论 BG患者PLK1、POLR2A呈高表达,PLK1、POLR2A高表达BG患者中位生存时间缩短,低分化、PLK1阳性表达、POLR2A阳性表达均为BG患者预后的独立危险因素。

逆转录-聚合酶链式反应检测果树RNA病毒

为调查主要果树携带苹果褪绿叶斑病毒 (ACLSV)、苹果茎沟病毒 (ASGV)、苹果茎痘病毒 (ASPV)和李属坏死环斑病毒 (PNRSV)的情况 ,以指示植物为试材 ,优化了四种病毒的逆转录 -聚合酶链式反应 (RT—PCR)检测体系。使用该优化体系检测了苹果树、樱桃树、桃树中携带上述四种病毒的情况。结果 :建立了特异性强、灵敏度高、成本低的RT—PCR检测体系 ;同时又证明主要果树被这几种病毒单独感染和复合感染的程度均较高。

互补引物/模板评价毕加酵母表达的丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶

构建含有感染性克隆HCV非结构基因 5b区序列的酵母表达质粒 ,转化毕加酵母 ,获得持续、可溶性HCVRNA依赖的RNA聚合酶 (RdRp)的表达 ,纯化蛋白在SDS -PAGE及Westernblot中显示出特异性的 6 4 2kDHCVRdRp蛋白带 ,同聚引物 /模板测定显示RdRp的活性极低 ,延长反应时间 ,RNA聚合活性仅轻度升高。采用合成的杂聚互补引物 /模板 ,未发现核苷酸在毕加酵母表达的RdRp作用下掺入模板 ,随时间延长 ,杂聚互补引物 /模板降解。

流感病毒RNA聚合酶的分离与纯化(英文)

目的 建立分离、纯化流感病毒RNA聚合酶PB1、PB2和PA 3P蛋白的有效方法 ,为进一步研究 3P蛋白的结构和功能奠定基础。方法 用甘油、CsCl1及CsTFA不同介质的密度梯度超速离心法进行分离 ,用SDS -PAGE电泳及Westernblot法检测 3P蛋白 ,用尿素变性PAGE检测vRNA。结果 用甘油密度梯度离心 ,可从病毒粒子中分离由NP、3P和RNA组成的RNP。将纯化的RNP用CsCl和甘油双组分不连续密度梯度离心 ,可形成NP和 3P -RNA两部分 ,使NP与 3P -RNA分离。进一步将 3P -RNA在CsTFA -甘油双组分不连续密度梯度介质中进行超速离心 ,可有效地将 3P与RNA分离 ,获得较纯的 3P蛋白。 3P位于离心管的上半部分 ,而RNA则位于离心管的近底端部分。结论 用甘油、CsCl-甘油和CsTFA

逆转录-半套式聚合酶链反应检测汉坦病毒RNA及其临床初步应用

目的：建立可用于汉坦病毒检测的ＲＴ－ＰＣＲ方法，并对其临床应用进行初步研究．方法：比较７６－１１８株和ＳＲ－１１株Ｓ基因序列，选择其保守区设计半套式引物，通过病毒培养上清及患者血清的扩增检测进行ＰＣＲ方法的敏感性、特异性及临床应用研究．结果：所建立的ＲＴ－ＰＣＲ方法可检出１．２５ＰＦＵ的病毒量；对照组（正常细胞培养上清和正常人血清）经扩增检测均为阴性；８６份经ＩＦＡ检测抗ＨＶ－ＩｇＭ阳性的肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）患者血清，其阳性检出率按发病时间分别为：１ｗｋ内１００％；１ｗｋ～２ｗｋ６１．２９％；２ｗｋ～３ｗｋ３．３％；＞３ｗｋ为２８．５％．另外２０份ＩＦＡ（－）但疑诊ＨＦＲＳ的初入院患者血清的检出率为３０％，经进一步跟踪观察，确认为ＨＦＲＳ．结论：ＲＴ－ＰＣＲ是一种敏感、特异的ＨＦＲＳ诊断方法，可弥补血清学检测的不足，值得进一步完善、推广和应用．

以T7 RNA聚合酶为基础的病毒拯救系统研究进展

文章界定了与病毒拯救相关的一些概念,对T7RNA聚合酶(RNAP)为基础的病毒拯救系统研究进行概述。介绍了体外拯救方法及其缺点,并以最常用的痘病毒载体表达T7RNAP为基础的体内拯救方法为例,介绍了该方法对病毒拯救的研究进展及缺点,进一步介绍了无痘病毒表达T7RNAP细胞系的RNA病毒拯救体系的建立和研究,为病毒拯救,特别是以T7RNAP为基础的病毒拯救试验方案提供参考。

流感病毒RNA聚合酶PB1-1亚基片段的克隆及表达

目的 将流感病毒RNA聚合酶PB1 1亚基进行亚克隆、表达 ,获得重组的亚克隆多肽 ,为进一步研究PB1亚基功能奠定基础。方法 以PB1亚基cDNA为模板 ,用PCR方法扩增出PB1 1片段 ,应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pQE30重组 ,阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定 ,IPTG诱导各亚克隆系高效表达 ;优化表达条件。结果 PCR法扩增出 4 87bp的片段 ,酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒 ,在E .coliM1 5中表达得到相对分子量约为 2 0KD的重组蛋白 ,获得重组多肽。结论 成功地亚克隆及表达了流感病毒RNA聚合酶PB1

用表达T7RNA聚合酶细胞系拯救麻疹病毒微复制子

构建稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系,用于提高拯救麻疹病毒微复制子效率。PCR扩增T7RNA聚合酶基因,克隆到真核表达载体,转染Vero细胞,用G418筛选到稳定表达的细胞株Vero/pcDNA3-T7。用Westernblotting证明了T7RNA聚合酶在细胞中的表达。将T7启动子控制绿色荧光蛋白表达的质粒转染该细胞后,绿色荧光蛋白在细胞株中得到表达。反向插入报告基因的微复制子转染感染麻疹病毒的Vero/pcDNA3-T7细胞后,细胞中能够检测到报告基因的表达。用细胞系取代痘苗病毒系统,可以提高拯救效率。

金欣口服液有效单体对呼吸道合胞病毒RNA聚合酶转录活性的影响

目的:探讨金欣口服液有效单体对呼吸道合胞病毒(RSV)RNA聚合酶转录活性的影响。方法:通过RSV感染体外培养的细胞并用药物干预、提取病毒核糖核蛋白复合体(RNP),体外转录,同位素检测RSV的mRNA全长转录本,检测金欣口服液及其主要有效成分对RSV的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性的影响。结果:与正常细胞组比较,病毒感染细胞模型组(病毒组)放射性核苷酸辐射强度明显增加;与病毒组比较,单体联合(黄芩苷+白藜芦醇)组辐射强度显著降低;而各血清组差异不显著。结论:金欣口服液有效单体黄芩苷+白藜芦醇联合作用能够降低RSV的RNA依赖的RNA聚合酶的活性,其可能是金欣口服液治疗呼吸道合胞病毒性肺炎的机制之一。