白蚊伊蚊经卵传递登革2型病毒的实验研究

目的证明白蚊伊蚊亲代能够经卵传递登革2型病毒给子代,并且在传递过程中病毒毒力呈逐渐增强趋势。方法采用套式PCR分批检测感染雌蚊的子一代至子四代卵内登革病毒结合C6/36细胞培养分离病毒及TCID50法滴定病毒滴度。结果白蚊伊蚊能经卵传递DEN-2,至少可传四代以上;且在传代中病毒毒力有增强的趋势。结论实验证明白蚊伊蚊对登革2型病毒有较大的媒介效能,且在维持登革病毒的自然循环中起重要作用。

两株登革2型病毒感染BALBC小鼠特异性抗体产生动态的比较

目的 :两株登革 2型病毒 (DengueType 2virus ,DV2 )初次和再次感染BALB C小鼠建立动物感染模型 ,对其产生特异性抗体进行动态观察 ,探讨感染DV2 NGC株和DV2 临床分离株 (B株 )引起的体液免疫应答的差异。方法 :两株DV2 毒株模拟自然感染途径 ,经皮下多点注射建立BALB C小鼠感染动物模型 ;采用间接ELISA法检测感染动物血浆中抗DV2 特异性IgM类抗体、IgG类抗体 ,并同时分离病毒观察病毒血症期的变化。结果 :不同DV2 毒株初次、再次感染BALB C小鼠后诱导特异性Ig产生的类别存在差异 ,且DV2 B株再次感染动物后表现为病毒血症期相对延长。结论 :两株DV2 诱导特异性抗体产生的动态与病毒血症期不同。

登革2型病毒全长基因组的长链RT-PCR法扩增

目的采用长链RT-PCR技术扩增登革2型病毒新几内亚株(NGC)全长基因组。方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列设计引物,在上游引物中加入Sp6 RNA聚合酶启动子核心序列,下游引物中加入ClaⅠ内切酶位点。从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA,采用长链RT-PCR技术进行扩增。以获得的PCR产物为模板分别扩增3个NGC株特异的基因片段。结果长链RT-PCR法扩增出约11 kb基因片段,经PCR法证实为登革2型病毒NGC株特异序列。结论通过长链RT-PCR技术,获得了登革2型病毒NGC株全长基因组,为进一步构建感染性克隆打下基础。

我国两株登革2型病毒5′和3′端非编码区序列测定及二级结构分析

为测定我国两株临床症状、乳鼠神经毒力不同的登革 2型病毒流行株 5′和 3′端非编码区序列 (untranslated region,UTR) ,分析二级结构差异与毒力变化的关系 ,分别从 D2 - 0 4、D2 - 44株感染的 C6/ 36细胞及鼠脑中提取总 RNA.以该 RNA为模板 ,利用 RACE法 ,分别扩增了 D2 - 0 4、D2 -44株的 5′和 3′末端 c DNA片段 .将其分别与 p GEM- T载体连接得到重组质粒 ,测定上述 c DNA插入片段的序列 .用 RNAdraw软件预测 D2 - 0 4、D2 - 44株 5′和 3′端非编码区的二级结构 .D2 - 0 4、D2 -44株 5′端和 3′端非编码区分别有 96和 454个核苷酸 .其中 5′非编码区 59位 C(D2 - 0 4 )→T(D2 -44 ) ,使 D2 - 44二级结构稳定性下降 ;3′端非编码区有 1 5个核苷酸不同 ,其中 T(355)→ A,T(32 6)→ G引起了所在位置二级结构自由能变化 ,且分别位于两个保守序列区 (conserved sequence,CS)CS1、CS2 A.这些位点变化可能与毒力有关 .

登革2型病毒PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒作用的研究

将扩增的登革 2型病毒株PrM基因导入pSFV载体的SP6启动子下游 ,筛选出含该基因正、反向插入的重组质粒DNA。用SpeI酶分别将重组的和辅助的质粒DNA线性化 ,并将其体外转录成 5′末端含帽子结构的RNA。再将这两种RNA共转染BHK细胞。然后将转染的宿主细胞用登革 2型病毒株攻击 ,并分别观察含正、反义PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒效果。通过碱基序列测定 ,筛选出含PrM基因正、反向插入的pSFV PrM重组质粒。并获得了经重组RNA与辅助RNA共转染细胞而产生的重组病毒颗粒。含有反义PrM基因的重组病毒RNA ,在宿主细胞中具有抗登革 2型病毒复制的作用 ,而且强于含正义PrM基因的重组病毒RNA。

云南省西南边境登革2型病毒全基因组序列特征研究

为阐明云南省西南边境地区登革2型病毒(DENV-2)流行株的全基因组序列特征及流行病学特点,采用C6/36细胞培养法分离病毒,用RT-PCR法扩增新分离DENV-2的全基因组序列,采用Clastal X1.83和MEGA6等生物信息学软件进行核苷酸同源性及系统进化分析。结果从登革热患者血清中分离到10株DENV-2,其中德宏州瑞丽市6株(2013年3株和2015年3株),西双版纳州景洪市2015年4株。经RTPCR和序列测定,获得这10株DENV-2的全基因组序列。基于结构蛋白和非结构蛋白基因的系统进化和同源性分析表明,这10株病毒中5株为亚洲基因Ⅰ型(AsianⅠGenotype,AG-Ⅰ),5株为全球基因型(Cosmopolitan genotype,CG)。其中2013和2015年瑞丽流行株均为AG-Ⅰ,景洪市2015年流行株均属CG,它们均与东南亚相同基因型流行株具有较高的同源性和较近的亲缘关系。云南株与DENV-2原型株(New Guinea-C)的E和NS5基因核苷酸同源性分别为93.38%~93.77%和92.80%~94.74%。所有云南株和东南亚参考株与New Guinea-C株在结构蛋白或非结构蛋白的氨基酸位点均存在一定程度的改变。本研究证实,云南省西南边境地区存在DENV-2两种基因型流行,瑞丽和景洪流行株分别为AG-Ⅰ和CG,但它们的输入来源均为相邻东南亚国家。云南株与DENV-2原型株New Guinea-C株间存在明显差异,但决定病毒抗原、致病性和毒力的关键位点未发现明显变化。

登革2型病毒在C6/36细胞上受体蛋白的鉴定

应用VOPBA (病毒辅覆蛋白结合分析 )技术 ,结合免疫印迹化学发光的方法在C6 36细胞上鉴定出了登革 2型病毒唯一的大小约为 35kDa的受体蛋白成分。为研究病毒对白纹伊蚊的感染机理打下了良好的基础。

登革2型病毒在经口感染的白纹伊蚊不同个体体内分布的比较研究

本研究用石蜡切片和免疫组织化学技术 ,对白纹伊蚊经口感染登革 2型病毒的分布定位进行了研究。白纹伊蚊感染登革 2型病毒 1 4天后 ,切片染色可直观地定位出病毒在蚊虫组织中的分布 ,比较不同蚊虫之间的染色可分为 3种类型 :1 白纹伊蚊的中肠 ,唾液腺 ,复眼 ,神经节等较多组织呈阳性着色 ;2 白纹伊蚊的中肠呈阳性 ,其它组织无阳性着色 ;3 白纹伊蚊的中肠及其它组织均无阳性着色。以不同病毒滴度经口接种白纹伊蚊时 ,白纹伊蚊中肠 ,唾液腺的感染率和感染病毒滴度呈正相关。以上结果提示白纹伊蚊部分个体对登革 2型病毒的感染存在中肠感染和中肠释放屏障 。

登革2型病毒NS3基因的酵母表达及其免疫反应性的测定

目的克隆登革2型病毒(DEN2)NS3基因并用酵母真核表达,获得全长的重组NS3蛋白质,为其结构与功能的研究提供条件。方法从感染DEN2(NGC株)后病变的C6/36细胞上清液中提取RNA,通过RTPCR扩增NS3基因片段,与载体pPICZαB连接筛选得到重组质粒,电穿孔法将重组体整合入酵母菌P.pastoris,经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定,取Mut+菌诱导表达,SDSPAGE检测表达产物。结果RTPCR得到1.85kb的NS3基因片段,酶切鉴定与测序显示重组质粒含DEN2全长NS3基因;Mut+酵母转化菌可分泌表达Mr约78000的蛋白质,与DEN2多抗和登革2型病毒患者恢复期血清的免疫印迹证实它为型特异的重组NS3蛋白质。结论成功将克隆的全长DEN2NS3基因在酵母菌中表达,获得的重组NS3蛋白质具有免疫反应性。

白纹伊蚊感染登革2型病毒后基因表达变化的研究

白纹伊蚊感染登革 2型病毒 2 4h后 ,和对照蚊虫一起提取RNA ,用差异显示PCR (DDRT PCR)技术对蚊虫感染病毒后基因表达的变化进行研究。白纹伊蚊感染登革 2型病毒后 ,经过 8条随机引物和 3条 3′端锚定引物配对扩增 ,发现了 6条表达有差异的片段 ,其中 5条为感染后表达量增加的片段 ,1条为感染后表达量减少的片段 ,并对这些片段进行了克隆和测序 ,通过GenBank查询 ,其中 5条为未知序列 ,1条表达量增高的片段和果蝇核糖体蛋白S5基因有较高的同源性。

不同地理株埃及伊蚊经口接种登革2型病毒的感染性研究

目的 研究海南、广东、台湾和印尼Baro等 4个地理株埃及伊蚊对登革 2型病毒的感染情况。方法 分别用鼠血和猪血配制不同病毒滴度的病毒混悬液经口接种埃及伊蚊 ,间接免疫荧光检测蚊脑液病毒抗原。结果 用鼠血病毒混悬液时 ,印尼Baro株对登革 2型病毒的感染率与海南株、台湾株的感染率差异有显著性 (海南株 :P =0 .0 0 79<0 .0 1;台湾株 :P =0 .0 116<0 .0 5 ) ,与广东株的感染率差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,随着病毒滴度的下降 ,各株埃及伊蚊对病毒的感染率呈明显下降趋势 ;鼠血和猪血各株饱血雌蚊经口接种登革 2型病毒的感染率差异无统计学意义 (χ2 =1.63 2 0 ,P =0 .2 0 14 >0 .0 5 )。结论 不同地理株埃及伊蚊对登革 2型病毒易感性存在差异。

登革2型病毒E蛋白在酵母菌中的分泌表达

以 pPICZαB为载体 ,应用RT PCR从感染D2V的C6 / 36病变细胞中克隆全长E基因 ,电转化法将重组质粒整合入巴斯德毕赤氏酵母菌 ,经抗生素筛选、表型鉴定和PCR分析得到Mut+ 型的多拷贝整合菌 ,经甲醇诱导培养可产生 6 9kD的融合蛋白 ,与含组氨酸尾的D2V包膜糖蛋白分子量理论值相符 ;免疫印迹证实该表达产物可与D2VE特异性单抗和D2V多抗进行反应 ;表达产物经金属螯合亲和层析可获得纯化的含组氨酸尾的E融合蛋白并保留其免疫反应性。研究显示克隆的全长D2VE基因可在毕赤氏酵母菌中高效分泌表达 ,E融合蛋白最大表达量 0 .1g/L。

登革2型病毒浙江分离株的鉴定与分子流行病学研究

目的为了对2004年浙江省报告的输入性疑似登革热病例查明病因,从分子水平分析流行毒株的生物学特征,追踪传染源,为疾病的预防控制提供实验室依据。方法对疑似患者血清标本采用ELISA、IFA和荧光RT-PCR方法分别检测登革病毒IgMI、gG抗体和病毒核酸,并用C6/36和BHK-21细胞分离登革病毒。采用RT-PCR方法扩增病毒E基因和NS1基因后分别进行序列测定,并与不同国家和地区的登革热毒株进行同源性和进化树分析。结果从患者血清中检测到登革病毒IgM、IgG抗体和登革2型病毒核酸,并分离到登革2型病毒;浙江省登革2型病毒分离株(ZJ/01/04)与登革2型国际标准株Jamaica、国内Fujian/10/99株和Saudi/92株在E基因上氨基酸的同源性分别为97.1%、99.2%和99.6%,而与登革1、3、4型毒株相同区域氨基酸同源性分别为68.7%、66.9%和63.6%。基因进化树显示ZJ/01/04分离株与Saudi/92株亲缘关系最近,在进化树的同一分支上。结论从病原学、血清学和分子生物学特征上均证实该输入病例是由登革2型病毒引起,该毒株最有可能来源于沙特阿拉伯。

昆虫杆状病毒系统表达登革2型病毒prM/E蛋白

目的:构建表达登革2型病毒prM/E蛋白的真核细胞系。方法:应用聚合酶链反应(PCR)方法从含有登革2型病毒prM/E基因的质粒中扩增得到prM/E基因。将该片段亚克隆到pGEM-T Easy载体上,用XhoⅠ和NheⅠ双酶切将其与同样双酶切的pFastBac Dual质粒连接,构建转移载体pFBD-prM/E。将转移载体转化的同时,含有杆状病毒穿梭载体Bacmid和Helper质粒的感受态DH10 Bac得到重组Bacmid;用后者转染Sf 9细胞获得重组杆状病毒。双酶切鉴定构建的重组杆状病毒转移载体pFBD-prM/E,间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达。结果:通过间接免疫荧光法可观察到特异性绿色荧光,即检测到prM/E蛋白的表达。结论:利用昆虫杆状病毒系统成功表达了登革2型病毒prM/E蛋白,为登革病毒prM和E蛋白的功能研究、登革病毒感染的诊断以及登革病毒样颗粒疫苗的研制奠定了基础。

我国登革2型/4型病毒株嵌合E基因免疫原性的研究

目的构建含有我国登革2型/4型病毒株嵌合E基因片段的真核表达质粒,观察重组质粒DNA的免疫原性,为登革多价疫苗的研究提供依据。方法首先将包含我国登革2型病毒43株E蛋白I/II抗原区和4型病毒B5株E蛋白III抗原区的嵌合E基因片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,通过测序确定嵌合基因序列的正确性。然后将重组质粒以肌肉注射途径,免疫Balb/C小鼠。通过间接免疫荧光法对采集的鼠血清中的病毒特异抗体进行检测。结果构建的含有我国登革2型/4型病毒株嵌合E基因的真核表达质粒pcDNA-D2/4,经序列测定表明,导入的嵌合E基因片段的序列是正确的。将重组质粒DNA免疫小鼠,在初次免疫后的第3周,可同时检测到针对登革2型和4型病毒的特异荧光。结论所构建的含有不同血清型的我国登革病毒株嵌合E基因片段的真核重组质粒,可诱导小鼠同时产生针对两个血清型病毒的特异抗体,该研究为新型登革多价疫苗的研制提供了依据。

登革2型型内嵌合病毒全长cDNA克隆的构建

运用OL PCR(OverlapPCR)方法 ,扩增出D2 0 4和D2 MON5 0 1结构蛋白区、5′非编码区等区域的嵌合片段 ,以此片段替换 pDVWS5 0 1质粒中的相应部分后 ,转化DH5α菌。测序结果表明 ,已成功构建含有D2 0 4株完整的PrM和E基因、一部分C基因 ,及D2 MON5 0 1株非编码区、非结构蛋白区和大部分C基因的嵌合病毒全长cD NA(QH 0 4/MON5 0 1)克隆。为进一步研究登革

登革2型病毒NGC株基因组亚克隆的构建及其鉴定

目的构建登革2型病毒NGC株基因组全序列的亚cDNA克隆,为进一步构建全长感染性cDNA克隆奠定基础。方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列中的酶切位点设计2对引物,从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA,采用长链RT-PCR技术扩增出覆盖病毒基因组全长的2个cDNA片段,并克隆至pCR-XL-TOPO载体后测序。结果经酶切鉴定和序列测定表明,获得的cDNA克隆为登革2型病毒NGC株特异的。结论已成功构建出登革2型病毒NGC株基因组的2个cDNA亚克隆。

用标记分析法对我国海南地区登革2型病毒株的抗原表位分析

用标记分析(signature analysis)法了解我国海南地区3年(1985—1987)来流行的登革2型(DEN-2)病毒株的抗原性变化。用3种单克隆抗体(McAb),包括黄病毒属特异、亚属特异和登革2型型特异,分析了8个DEN-2病毒流行株,并与标准株新几内亚B株进行比较。通过统计分析和微机处理,发现8株中有5株与株准株类似,有3株显示出明显差异。株记分析法为病毒抗原性分析提供了一个高度敏感的方法,并可用于监测一个地区病毒株群的变化及新株的引入。

登革2型病毒非结构蛋白NS4B的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:原核表达、纯化登革2型病毒非结构蛋白NS4B,并制备其多克隆抗体,以研究其结构与功能。方法:扩增编码登革2型病毒NS4B的24～238位氨基酸残基的基因序列,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;采用蛋白浸提方法从SDS-PAGE胶中回收融合蛋白;用纯化后的融合蛋白免疫BALB/c鼠制备多克隆抗体,采用间接免疫荧光法检测抗体效价。结果:原核表达了NS4B-GST融合蛋白,并获得了其多克隆抗体,抗体效价为1∶800。结论:登革2型病毒NS4B的24～238位氨基酸残基可诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,这为研究NS4B的结构与功能奠定了基础。