重组融合人血清白蛋白-人白介素-2 C125A突变体在毕赤酵母中的表达

构建编码人血清白蛋白-人白介素-2 C125A的重组表达质粒,在Pichia pastorisGS115中表达,获得具有较高IL-2活性的融合蛋白。设计并合成符合P.pastoris密码子偏好,且含有C125A突变的IL-2编码基因IL-2m,通过酶切连接方法将其与人血清白蛋白(HSA)的编码基因连接为融合蛋白HSA-IL2m的编码基因。克隆到表达质粒pPIC9K中,电击转化P.pastorisGS115感受态细胞,获得重组P.pastorisGS115/pPHIm基因工程菌。摇瓶发酵获得分泌表达产物。结果:Western blot鉴定结果显示该融合蛋白与IL-2、HSA的抗体都能发生免疫反应。经脱盐、冻干制备的粗蛋白的IL-2生物学活性为1.51×106IU/mg。结论:在P.pastorisGS115中成功表达了具有人白介素-2生物学活性的HSA-IL2m融合蛋白。

人白介素-12(P40)亚基在巴斯德毕赤酵母中的表达

运用PCR技术特异性地扩增了人IL 1 2p4 0亚基cDNA的编码区序列 ,得到 94 0bp的扩增片段 ,将其克隆于毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达载体pPICZαC的ClaⅠ ,XbaⅠ位点 ,构建成重组表达质粒pPICZαC p4 0 .经LiCl2 转化 ,Zeocin抗性筛选 ,得到含多拷贝p4 0基因的酵母工程菌PichiapastorisX 3 3 /p4 0 ,在 φ =0 5%甲醇诱导下 ,p4 0基因得到了分泌型表达 ,培养上清的SDS PAGE及Western blot均显示表达产物相对分子质量约 4 40 0 0 ,与预计大小相符 ,薄层凝胶扫描结果表明 ,分泌型表达蛋白占培养上清总蛋白量质量的 4 7% .

人白介素-2／人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达

目的:构建编码人白介素-2/人血清白蛋白的重组表达质粒pPIH,在毕赤酵母(Pichiapastria)中进行表达,获得具有白介素-2(IL-2)活性的融合蛋白。方法:通过逆转录方法从人外周血单核细胞得到人IL-2的cDNA,再通过重叠PCR方法,将编码人IL-2的cDNA和编码人白蛋白的cDNA拼接起来,克隆至T载体获得含有融合基因IH的质粒pMD19/IH。用EcoRI和NotI双酶切pMD19/IH和pPIC9K两种质粒,通过琼脂糖凝胶电泳分离,试剂盒纯化,将IH片段和pPIC9K连接获得表达型pPIH的重组质粒,利用电转化方法转化毕赤酵母KM71获得重组表达质粒pPIH;CTLL-2/MTT法测定融合蛋白中人IL-2活性。结果:成功构建了人白介素-2/人血清白蛋白的重组表达质粒pPIH,融合蛋白得到了较理想的表达;重组菌经甲醇诱导表达后含有融合蛋白IL-2-HSA发酵上清液表现100U/mL的生物学活性。结论:成功获得具有人IL-2生物活性的重组人白介素-2/血清白蛋白融合蛋白,该研究结果未见文献报道。

重组人白介素1受体Ⅰ型细胞外基因在毕赤酵母的表达

目的构建白介素1受体Ⅰ型细胞外基因(可溶性白介素1受体Ⅰ型,sIL-1RⅠ)的pPICZαA-sIL-1RⅠ重组表达载体,利用毕赤酵母表达技术表达sIL-1RⅠ蛋白。方法采用RT-PCR技术扩增基因sIL-1RⅠ,经酶切连接构建重组质粒pPICZαA-sIL-1RⅠ,转化E.coliStb13;阳性克隆经测序成功后,把pPICZαA-sIL-1RⅠ重组质粒电转入毕赤酵母菌株GS115,PCR对阳性克隆进行鉴定,以及对GS115转化子表型筛选。确定表型后,对重组菌株进行甲醇诱导蛋白表达。提取菌体蛋白和上清液进行Westernblotting检测以鉴定蛋白表达属于菌内表达还是分泌表达。结果 pPICZαA-sIL-1RⅠ重组质粒构建成功;pPICZαA-sIL-1RⅠ成功电转入酵母菌GS115;转化子表型筛选结果为甲醇诱导缓慢型Muts;对培养上清和菌体蛋白进行Westernblotting检测结果:上清没有检测到蛋白,在菌体内检测到蛋白。结论成功运用毕赤酵母表达体系表达sIL-1RⅠ蛋白,为sIL-1RⅠ的研究和应用提供实验基础。

耐热嗜酸β-甘露聚糖酶TaMan5A在毕赤酵母中高效表达及酶学性质研究

甘露聚糖酶是一类将甘露聚糖降解为短链甘露寡糖及甘露糖的水解酶。为了开发耐酸耐高温的工程酶,从棘孢木霉(Trichodema asperellum)ND-1中克隆甘露聚糖酶基因TaMan5A并在毕赤酵母(Komagataella phaffii)X-33中成功表达。结果显示,该酶的蛋白质分子质量约为67 kDa。最适pH值和温度分别为4.0和65℃,在pH 2.0~6.0具有较强的稳定性,孵育1 h后仍具有80%的活性,且在20~65℃时,残留酶活力均能达到90%以上。1 mmol/L Co^(2+)、脲和5 mmol/L SDS、Zn^(2+)、Fe^(2+)、Mn^(2+)、Ni^(2+)对TaMan5A的活力都有不同程度的激活作用。由于玉米秸秆富含纤维素与半纤维素,因此进一步确定了TaMan5A水解秸秆的最佳组合条件(玉米秸秆用量0.5 g,TaMan5A用量0.5 g,pH 4.0,水解2 d),并得到玉米秸秆用量和TaMan5A用量对玉米秸秆降解效率影响最大。该研究首次从棘孢木霉ND-1中克隆出TaMan5A基因,实验结果表明,TaMan5A是一种嗜酸、耐高温、热稳定性强的酶,具有较大的应用前景,值得进一步研究。

β-葡萄糖苷酶催化活性改造及在毕赤酵母中的高效表达

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)能催化底物非还原末端的β-D-葡萄糖苷键水解释放葡萄糖和相应配基,是纤维素糖化过程中的关键酶之一。篮状菌(Talaromyces leycettanus JCM12802)来源的β-葡萄糖苷酶bgl3A热稳定性较好,但催化活性还亟待提高。该研究中,通过Discovery Studio 2022柔性对接模块构建了bgl3A和底物pNPG的复合物结构;基于结合能预测模块对bgl3A催化活性位点6以内的氨基酸残基进行虚拟突变,计算突变前后酶对pNPG的结合能变化;对结合能变化小于-0.7 kcal/mol的20个突变体进行表达、纯化和酶学性质分析。与bgl3A相比,突变体bgl3A-N237Y的比酶活和k_(cat)/K_(m)分别提升了22%和25%。将bgl3A-N237Y在毕赤酵母中表达,通过信号肽替换和共表达分子伴侣使其摇瓶发酵酶活力达106.6 U/mL,较优化前提高75%。研究得到高活性bgl3A突变体及其生产菌将有助于提高其工业化应用效果。

白细胞介素-10基因多拷贝表达盒的构建及在毕赤酵母中的表达

目的构建白细胞介素-10(IL-10)基因多拷贝表达盒,提高IL-10在毕赤酵母中的表达水平。方法体外构建重组表达载体αIL-10/pAO815,BamHⅠ和BglⅡ双酶切获得目的基因表达盒(AOX-αIL-10),再连接到BglⅡ酶切位点处,依次构建多拷贝重组载体n(AOX-αIL-10)/pAO815。从质粒pPIC9K上用NdeⅠ和SalⅠ双酶切获得Kan抗性基因,重组到多拷贝表达载体n(AOX-αIL-10)/pAO815上。重组载体n(AOX-αIL-10)/pAO815电转化毕赤酵母,PCR筛选含有IL-10基因的酵母转化子,甲醇诱导表达,对表达量高的转化子再次经重组载体n(AOX-αIL-10)/pAO815-Kan电转化,高浓度G418抗性筛选二次酵母转化子,使用甲醇诱导表达。ELISA测定IL-10含量,MC/9细胞测定IL-10活性。结果所构建的8拷贝表达盒的重组载体8(AOX-αIL-10)/pAO815和4拷贝表达盒4(AOX-αIL-10)/pAO815-Kan,转化子分泌表达IL-10水平最高,为(8.25±1.65)mg/L,比活性为1.465×105U/mg。结论已成功构建了高拷贝表达盒,并提高了IL-10在毕赤酵母中的表达水平。

人可溶性白介素-1受体真核表达载体pcDNA3/sIL-1R的构建

目的 本研究旨在构建人可溶性白介素_1受体 (sIL_1R)真核表达载体pcDNA3 sIL_1R ,为研究骨关节病的基因治疗奠定实验基础。方法 将人sIL_1R基因的RT_PCR纯化产物及质粒pcDNA3 1(+)DNA经KpnI和XhoI双酶切、胶回收纯化酶切片段后 ,体外连接酶切片段 ,使其定向重组 ,再将重组DNA转化E .coliCompetentCellsJM10 9,经复苏后 ,在含Ampr 的LB固体培养基上筛选出阳性克隆。结果 挑取的LB固体培养基上的 6个单菌落经酶切及测序鉴定 ,证实均为阳性克隆 ,即sIL_1R与pcDNA3 1(+)体外重组成功。结论 采用体外重组技术 ,成功地将人sIL_1RcDNA插入了真核表达载体pcDNA3 1(+)

土茯苓抑制白介素-1诱导的血管内皮细胞细胞间黏附分子-1的表达

目的 :探讨中药土茯苓对白介素 1 (IL 1 )诱导的血管内皮细胞表面的细胞间黏附分子 1 (ICAM 1 )表达升高的保护作用。方法 :以原代培养的人脐静脉内皮细胞 (HU VEC)为研究对象 ,采用细胞培养、免疫荧光染色、中药血清药理学方法、流式细胞仪等技术 ,观察IL 1对培养的HUVECICAM 1表达的影响并研究不同时间点及不同浓度的含药血清的抑制作用。结果 :IL 1使HUVEC的ICAM 1的表达明显升高 ,同时含药血清组的ICAM 1的表达比空白血清组低。结论 :土茯苓含药血清能拮抗IL 1致内皮细胞ICAM 1表达升高。

白介素-1β及黏附分子在急性髓性白血病中的表达及意义

目的 为探讨白介素 1β及黏附分子CD11a和CD11b在白血病细胞淤滞及向组织浸润中的作用 ,并为临床防治白血病细胞髓外浸润的发生提供实验依据。方法 用酶联免疫吸附试验 (ELISA)测定 5 1例初治和复发 ,且未开始化疗的急性髓性白血病 (AML)患者和 15例正常献血员血清中IL 1β的含量 ,采用免疫细胞化学法SABC -AP测定 4 0例AML的骨髓单个核细胞膜或浆中CD11a和CD11b表达百分率。结果 AML组血清中IL 1β的含量显著高于正常对照血清 (P <0 .0 1) ;AML浸润组血清中IL 1β的量显著高于非浸润组。IL 1β与外周血白细胞呈直线相关关系 (r =0 .796 ,P <0 .0 1)。在CD11a和CD11b的表达中 ,CD11b在M4 M5的表达百分率明显高于M1 M2 及M3 (P <0 .0 1)。CD11a阳性者临床特征中外周血白细胞明显高于CD11a阴性者 (P <0 .0 1) ,且容易出现浸润征。而CD11b阳性者与年龄、血小板、浸润有关。IL 1β、CD11a和CD11b之间存在两两直线相关关系 (P <0 .0 5 )。结论 黏附分子整合素包括CD11a、CD11b参与了白血病细胞组织浸润的机制 ,白血病细胞产生的细胞因子IL 1β可上调CD11a、CD11b在白血病细胞上的表达。

转染人肿瘤坏死因子-α、白介素-2基因对肺癌细胞耐药基因MDR1、LRP表达的影响

目的 研究转染人体肿瘤坏死因子 α(huTNF α)、白介素 2 (hIL 2 )基因对肺癌细胞耐药基因MDR1、LRP表达的影响 ,探讨基因治疗逆转肺癌多药耐药的可行性。方法 通过阳离子脂质体将克隆的huTNF α和hIL 2基因导入肺癌细胞系A5 49、GLC 82、H44 6、H460 ,经筛选阳性单克隆 ,用半定量RT PCR方法检测转染目的基因前后肺癌细胞系MDR1、LRP基因在mRNA水平的表达情况。结果 MDR1在A5 49、GLC 82、H44 6、H460 ,LRP在A5 49、GLC 82、H 460中均呈阳性表达 ;转染huTNF α目的基因后各肺癌细胞系MDR1、LRP基因的表达无影响 ,而转染hIL 2目的基因能够明显抑制A5 49、H44 6、H 460细胞系MDR1的表达。结论 MDR1、LRP基因在肺癌细胞系中的阳性表达与肺癌的固有耐药性有关 ;huTNF α、hIL 2目的基因能够在被转染细胞中获得表达 ,而且转染hIL 2目的基因能够明显抑制MDR1在A5 49、H44 6、H460的表达。该结果不仅为探讨肺癌多药耐药性的病理机制提供了一个新的线索 ,而且为基因治疗逆转肺癌的多药耐药性提供了一个新的实验依据。

人可溶性白介素-4受体(sIL-4R)在甲醇酵母中的表达

白细胞介素 4(IL 4)作为一种多功能的细胞因子在哮喘等变态性炎症反应中具有关键作用。IL 4通过结合细胞表面的白介素 4受体 (IL 4R)发挥其生物学效应。sIL 4R缺少跨膜和胞内结构域 ,结合IL 4后不能产生信号传递来介导IL 4的生物学活性 ,但sIL 4R与IL 4结合的高度特异性和极高的亲和力使它非常适合作为理想的IL 4拮抗剂应用于哮喘等疾病的治疗。采用RT PCR方法以人的单核细胞总RNA为模板扩增得到编码sIL 4R的基因片段 ,经测序证实后插入到甲醇酵母分泌表达质粒pPIC9K中 ,得到重组质粒pPIC9K sIL 4R ,利用限制性内切酶BglⅡ将其线性化后用电穿孔法导入PichiapastorisGS115。分别用SDS PAGE、Westernblot和Ligandbindingblot对重组菌发酵上清中的sIL 4R进行鉴定。结果表明 ,在分子量约为 3 0kD处有sIL 4R特异条带出现 ,并具有结合其配基IL

中耳胆脂瘤上皮中白介素-1α的表达

目的研究白介素-1α(interleukin-1α,IL-1α)在中耳胆脂瘤上皮的表达,并分析与基质金属蛋白酶-9(metalloproteinase-9,MMP-9)以及增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)表达的关系。方法采用免疫组织化学SP法检测了IL-1α、MMP-9及PCNA在21例继发性胆脂瘤上皮标本与10例胆脂瘤患者外耳道皮肤表皮中的表达。结果IL-1α、MMP-9及PCNA在胆脂瘤上皮的表达,与外耳道皮肤上皮相比明显增强,差异均具显著性(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。IL-1α与MMP-9表达存在正相关性(P<0.05),IL-1α与PCNA表达无显著相关性。结论IL-1α与MMP-9表达密切相关,表明IL-1α可通过上调MMP-9的表达在介导胆脂瘤骨质破坏行为中扮演着重要角色。在体内IL-1α可能不是影响胆脂瘤上皮增殖的主要因素。

白介素-1和血小板源性生长因子对血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶-1表达的影响

目的 :观察白介素 1(IL 1)和血小板源性生长因子 (PDGF)对血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶 1(MMP 1)表达的影响。方法 :用RT PCR法检测MMP 1的mRNA水平 ,用Western蛋白印迹法 (Westernblot)检测MMP 1蛋白水平 ,采用电泳迁移率变动分析 (EMSA)法测AP 1结合活性。结果 :白介素 1( 2 0 μg/L)和PDGF( 2 0 μg/L)联合使用使MMP 1的mRNA水平明显增高 ,显著增加MMP 1蛋白表达 ,提高AP 1结合活性。结论 :白介素 1和血小板源性生长因子联合使用可刺激MMP 1生成。

苯妥英钠对腹腔巨噬细胞白介素-1基因表达及白介素-1活性的影响

为研究苯妥因钠（ＰＨＴ－Ｎａ）促进创伤愈合的机理，本文收集并培养大鼠腹腔巨噬细胞，应用原位杂交技术和小鼠胸腺细胞增殖法分别测定白介素－１（ＩＬ－１）基因表达和白介素－１活性，直接研究ＰＨＴ－Ｎａ对巨噬细胞的作用。结果表明，ＰＨＴ－Ｎａ明显刺激巨噬细胞ＩＬ－１ｍＲＮＡ表达，增加巨噬细胞培养上清中ＩＬ－１的活性，并随剂量的增加作用增强。这说明ＰＨＴ－Ｎａ直接刺激巨噬细胞ＩＬ－１基因表达，增加ＩＬ－１的活性是其促进创伤愈合的主要机理之一。

脑缺血再灌注后脑组织白介素-1β转化酶基因的表达

为探讨白介素 -1 β转化酶mRNA在前脑缺血再灌注后 1～ 4d被诱导表达及定位的情况 ,应用逆转录PCR方法检测沙土鼠前脑缺血再灌注模型白介素 -1 β转化酶mRNA的诱导情况 ;同时应用免疫组化方法对白介素 -1 β转化酶定位表达进行观察。结果白介素 -1 β转化酶mRNA在脑缺血再灌注后的 1～ 4d被诱导表达 ;非缺血海马区及皮层仅见锥体细胞及中间神经元白介素 -1 β转化酶的轻度表达 ;而白介素 -1 β转化酶在胶质细胞的表达在缺血后的 1～ 4d均可观察到 ,且逐渐增加 ,以第 3d最明显。结果证实了白介素 -1 β转化酶基因在脑缺血再灌注后的表达和定位 ,说明白介素 -1 β转化酶可能参与脑组织因缺血而发生的凋亡的发生过程。

白介素-10对大鼠肝星状细胞核因子-κB、细胞因子及细胞间黏附分子-1表达的影响

目的:探讨白介素-10对大鼠肝星状细胞的干预作用和作用机制. 方法:分离大鼠肝星状细胞(HSC),采用不同浓度的白介素-10处理后,分别应用ELISA法和Northern blot检测大鼠HSC中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、肿瘤坏死因子- α和白介素-1β蛋白和mRNA的表达,采用凝胶迁移率法检测核因子κB(NF-κB)活性. 结果:白介素-10可明显下调大鼠HSC ICAM-1、TNF-α及IL-1β表达,并且抑制NF-κB活性,其效应呈浓度依赖性. 结论:白介素-10可能通过下调HSC ICAM-1、TNF-α及IL-1β表达和抑制NF-κB活性来发挥其抗炎和抗纤维化作用的.

人白介素-6表达质粒的构建及在酿酒酵母中的表达

将带有哺乳动物细胞信号肽的人白细胞介素-6(hIL-6)基因片段构建到大肠杆菌-酵母细胞穿梭型质粒pYES2中,获得表达质粒pYES2-hIL-6.另外,将表达质粒pYES2-hIL-6转化到酿酒酵母细胞DBY747中,并将获得的转化子在含2％乳糖的YP培养基中培养到OD_(600)=1.0左右,后用2％的半乳糖进行了诱导表达.结果发现,在培养上清中发现人白介素-6的分泌.

血清组织中白介素-1在胃癌及胃溃疡患者中的表达水平及意义

目的通过测定胃癌及胃溃疡患者中血清组织中白介素-1的表达水平,探讨在治疗中的临床价值。方法将我院治疗的24例胃癌患者、24例胃溃疡患者及24例健康体检者,采用酶联免疫吸附法测定血清中IL-1的表达水平,并进行分析比较。结果与胃溃疡组、健康对照组相比,胃癌组患者血清及组织中白介素-1水平较低,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论胃癌组中患者血清白介素-1呈现出低表达状态,对评价肿瘤的发展进程等方面具有临床意义。

白介素-1β对膀胱癌MMP9表达的影响及其信号传导通路的研究

目的 :研究白介素 -1β(IL -1β)对膀胱癌细胞基质金属蛋白酶9(MMP9)表达的影响及其信号传导途径。方法 :明胶电泳酶谱分析法检测IL -1β对膀胱癌T24细胞MMP9表达的影响 ;蛋白印迹分析T24细胞丝裂原激活蛋白激酶 (MAPK)和磷酸肌醇3羟基激酶 (PI3K)传导通路在IL -1β作用下的磷酸化状态 ;用MAPK和PI3K传导通路的特异性抑制剂 ,对IL -1β 调控膀胱癌细胞MMP9表达的阻断研究。结果 :IL -1β 对膀胱癌T24细胞的MMP9表达有剂量依赖性调节作用 ;IL -1β 介导PI3K下游转录因子NF -κB时间依赖性激活 ;PI3K传导通路抑制剂Wortmannin阻断IL -1β 对MMP9表达上调作用。结论 :PI3K传导通路的激活介导IL -1β对膀胱癌T24细胞MMP9表达的上调作用。