白介素-24通过干扰CXCL12/CXCR4轴抑制宫颈癌细胞迁移和侵袭的机制研究

目的探究白介素-24(IL-24)靶向CXCL12/CXCR4轴抑制宫颈癌细胞迁移及侵袭的作用机制。方法体外培养正常子宫颈上皮细胞HcerEpic及宫颈癌细胞系Hela、Siha、Caski、C-33A,应用RT-PCR与Western blot检测上述细胞中CXCR4的mRNA和蛋白表达水平。将Hela细胞分为Control组(细胞正常培养,无任何特殊处理)、CXCL12组(细胞用100 ng/mL CXCL12处理)、CXCL12+LV-NC组(细胞感染LV-NC后使用100 ng/mL CXCL12处理)、CXCL12+LV-IL-24组(细胞感染LV-IL-24后使用100 ng/mL CXCL12处理)、CXCL12+AMD3100组(联合使用100 ng/mL CXCL12及1μg/mL AMD3100处理细胞)、CXCL12+AMD3100+LV-IL-24组(细胞经LV-IL-24感染后联合100 ng/mL CXCL12与1μg/mL AMD3100处理)。划痕实验、Transwell侵袭实验分别检测各组宫颈癌细胞的迁移、侵袭能力;Western blot检测CXCR4蛋白表达及Akt/mTOR信号通路中p-AKT、p-mTOR蛋白表达。结果与HcerEpic细胞相比,宫颈癌细胞系中CXCR4的mRNA和蛋白的表达水平均显著增加(P<0.05),其中以Hela细胞最为明显(P<0.01)。与细胞正常培养组相比,CXCL12能够显著提高宫颈癌细胞的迁移与侵袭能力(P<0.05),而过表达IL-24和(或)联合AMD3100能明显抑制CXCL12的上述促进作用(P<0.05),其中以过表达IL-24联合AMD3100效果最为显著(P<0.01)。Western blot检测结果显示,与细胞正常培养组相比,CXCL12能明显促进Hela细胞中CXCR4、p-Akt及p-mTOR蛋白的表达水平(P<0.05),而过表达IL-24和(或)联合AMD3100能明显抑制CXCL12诱导的p-Akt及p-mTOR蛋白表达升高现象(P<0.05),但过表达IL-24不影响CXCL12诱导的CXCR4表达增加(P>0.05),而联合AMD3100能抑制这一现象(P<0.05)。结论在宫颈癌Hela细胞中,过表达IL-24能够通过Akt/mTOR信号途径破坏CXCL12/CXCR4轴诱导的肿瘤细胞侵袭与迁移促进的作用,且联合CXCR4抑制剂AMD3100效果更为显著。

白介素-24抑制胶质瘤细胞生长的体内外实验研究

目的探讨白介素-24基因转染对胶质瘤生长的影响。方法将载有人白介素-24cDNA的新型重组腺病毒(Ad5F35-IL24)感染人胶质瘤细胞系U251,体外观察Ad5F35-IL24对该细胞系生长的影响;建立人胶质瘤动物模型,瘤内注射Ad5F35-IL24,观察肿瘤生长情况;用流式细胞仪检测其凋亡和Bax/Bcl-2的表达情况。结果Ad5F35-IL24感染U251细胞和肿瘤组织后,IL-24蛋白高表达,U251细胞和组织的生长受到明显抑制,其凋亡率明显升高,Bax/Bcl-2也明显升高。结论白介素-24具有抑制人胶质瘤细胞系U251生长和诱导凋亡作用。Ad5F35-IL24转导白介素-24基因可能是一种有效的胶质瘤基因治疗途径。

重组人白介素-24蛋白对荷人A375细胞黑素瘤裸鼠的抑瘤作用

目的研究原核表达及纯化、复性的重组人白介素24蛋白（recombined human interlukin 24，rhIL-24）对荷人A375细胞黑素瘤裸鼠的抑制肿瘤生长的作用。方法将人A375黑素瘤细胞注射至裸鼠体内，待肿瘤生长到一定体积后，向裸鼠的肿瘤内注射rhIL-24，2周后切取肿瘤称重、量体积，进行病理检查及免疫组化检测。结果经rhIL-24注射的肿瘤体积及重量与对照组相比明显减小、减轻；Bax基因表达上调、Bcl-2、CD34及VEGF基因表达下调，显示肿瘤细胞生长受到抑制，凋亡率增加。结论rhIL-24对荷人A375细胞黑素瘤裸鼠的肿瘤有显著抑制生长的功能，可促进A375细胞凋亡，而对裸鼠则无明显的不良反应。

白介素-24与肺癌

白介素-24(IL-24)即是黑色素瘤分化相关基因-7(mda-7),属于IL-10家族成员,除具免疫刺激应答功能外,还被认为是一抑癌基因。IL-24可以抑制多种肺癌细胞的生长,其主要机制是提高肿瘤抑制基因表达,减少原癌基因的表达,促进凋亡,以及抑制肿瘤血管生成。IL-24还具有增加肺癌细胞对射线敏感性的作用。IL-24有望成为肿瘤临床综合治疗的有效手段之一。

Mimecan基因、核因子-κB和白介素-24与子痫前期相关性研究

目的探讨Mimecan基因、核因子-κB(NF-κB)和白介素-24(IL-24)在子痫前期(preeclampsia,PE)中的表达及其相关性。方法根据子痫前期临床表现将98例子痫前期分为轻度子痫前期组(轻度PE组,53例)、重度子痫前期组(重度PE组,45例);选择正常健康孕妇48例作为对照组。采用酶联免疫法(ELISA)检测孕妇血清中Mimecan基因、NF-κB和IL-24的表达。结果子痫前期组患者Mimecan基因、NF-κB和IL-24的表达水平分别为(10.98±0.82)mg/L、(21.97±3.87)mg/L和(0.79±0.26)mg/L,对照组分别为(4.78±0.63)mg/L、(16.73±4.31)mg/L和(0.38±0.13)mg/L,两组比较,差异有统计学意义(P均<0.05);Mimecan基因、NF-κB和IL-24与子痫前期严重程度呈正相关(r分别为0.687、0.733和0.821,P均<0.05)。结论子痫前期的发生发展可能与Mimecan基因、NF-κB和IL-24有关。

IL-24对肺癌A549细胞恶性生物学行为及CXCL12∕CXCR4信号轴的影响

探究白介素-24(IL-24)对肺癌A549细胞侵袭、迁移等恶性生物学行为以及CXCL12/CXCR4信号轴的影响,并探索其机制。方法 体外培养正常肺上皮细胞及肺癌A549细胞,通过RT-PCR与Western blot法检测正常肺上皮细胞及肺癌A549细胞中CXCR4 mRNA和蛋白表达。结果 与正常肺上皮细胞相比,肺癌A549细胞中CXCR4 mRNA和蛋白的表达均明显升高(P<0.05)。与Control 组细胞相比,CXCL12能够明显升高A549细胞的侵袭、迁移能力(P<0.05),过表达IL-24联合AMD3100可显著降低A549细胞CXCL12对其侵袭、迁移能力的促进作用(P<0.05)。与正常肺上皮细胞相比,CXCL12可显著提高肺癌A549细胞CXCR4和Akt/mTOR 信号通路相关蛋白(p-Akt、p-mTOR)表达水平(P<0.05),过表达IL-24联合AMD3100可显著降低CXCL12促进p-Akt、p-mTOR蛋白表达的作用(P<0.05),但是过表达的IL-24则不影响CXCL12对CXCR4表达的促进作用(P>0.05),而过表达的IL-24联合AMD3100则能够显著抑制CXCL12对CXCR4表达的促进作用(P<0.05)。结论 在肺癌A549细胞中,过表达IL-24可能够通过破坏CXCL12/CXCR4信号轴而抑制A549细胞侵袭、迁移等恶性生物学行为,可能与Akt/mTOR信号通路有关。

腺病毒介导IL-24基因诱导人脑胶质瘤U87MG细胞的凋亡

目的:研究腺病毒介导IL-24基因表达载体(Ad-IL-24)对人脑胶质瘤U87MG细胞的抑制作用,初步探讨其作用机制。方法:将本科室构建的Ad-IL-24感染U87MG细胞,RT-PCR法检测IL-24基因的表达,MTT法和流式细胞术检测U87MG细胞的生长和凋亡,激光共聚焦显微镜观察U87MG细胞凋亡的形态学变化,RT-PCR法检测Bax、Bcl-2基因mRNA的表达,Western blotting检测caspase-3的活化。结果:Ad-IL-24感染U87MG细胞后,IL-24在U87MG细胞中有明显表达,并抑制U87MG细胞生长、诱导其凋亡、出现典型的凋亡细胞核形态学改变。Ad-IL-24可上调U87MG细胞中Bax基因、下调Bcl-2基因的表达,并诱导caspase-3蛋白的活化。结论:Ad-IL-24可诱导U87MG细胞凋亡,其机制可能与上调Bax基因、下调Bcl-2基因表达,并活化caspase-3有关。

MDA-7/IL-24对Burkitt淋巴瘤细胞的诱导分化作用

目的:研究黑色素瘤分化相关基因-7(melanoma differentiation associated gene 7,MDA-7)/IL-24对Burkitt淋巴瘤细胞的促分化作用并探讨其作用机制。方法:构建稳定过表达MDA-7/IL-24的人Burkitt淋巴瘤Raji和Daudi细胞株,MTS法检测稳定转染MDA-7/IL-24对Raji和Daudi细胞活力的影响;Transwell小室实验检测转染MDA-7/IL-24对Raji和Daudi细胞侵袭和迁移能力的影响;流式细胞术检测细胞凋亡水平及免疫表型;Western blotting技术检测转染MDA-7/IL-24对Raji和Daudi细胞表达分化相关蛋白Myb、BLIMP1及BCL-6的影响;建立裸鼠Raji细胞移植瘤模型,检测在体内环境中稳定转染MDA-7/IL-24对Raji细胞生物活性的影响。结果:过表达MDA-7/IL-24的Raji和Daudi细胞其增殖(P<0.05)、侵袭(P<0.01)及迁移(P<0.01)能力均明显下降,但凋亡细胞无明显增加(P>0.05),表达CD45及CD138的水平均明显增加(P<0.01),而表达CD10的水平明显下降(P<0.01)。过表达MDA-7/IL-24的Raji和Daudi细胞表达BLIMP1的水平明显增加(P<0.01),而表达Myb及BCL-6的水平均明显减低(P<0.01)。MDA-7/IL-24过表达组裸鼠模型Raji细胞移植瘤质量明显低于对照组[(1.23±0.21)vs(1.96±0.24)g,P<0.01]。结论:转染MDA-7/IL-24可能通过诱导分化作用抑制Burkitt淋巴瘤细胞的生物活性。

腺病毒介导IL-24基因对U251胶质瘤细胞p38MAPK及bcl-2表达的影响

目的:探讨腺病毒介导的IL-24基因(Ad5F35-hIL-24)对人胶质瘤细胞(U251细胞)的杀伤作用,以及对p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和bcl-2蛋白表达的影响.方法:应用MTT方法和双荧光染色方法测定Ad5F35-hIL-24对U251细胞的抑制作用;蛋白质印迹法检测p38MAPK,p-p38MAPK和bcl-2的表达变化.结果:MTT和双荧光染色方法检测表明,与空载体Ad5F35-VEC组及空白对照组相比,Ad5F35-hIL-24对U251细胞有明显抑制作用.蛋白质印迹检测显示,Ad5F35-hIL-24组的p-p38MAPK蛋白表达水平增加,bcl-2蛋白表达减少.结论:腺病毒介导的IL-24基因对胶质瘤U251细胞杀伤作用明显,提示p38MAPK信号转导通路及bcl-2基因表达是Ad5F35-hIL-24重要作用靶点,该结果对于临床治疗胶质瘤有一定参考意义.

腺病毒介导的IL-24基因转移对脂多糖诱导的系膜细胞增生的抑制作用

目的探讨腺病毒介导的白介素-24（IL-24）基因转移对脂多糖（LPS）诱导的大鼠肾小球系膜细胞（GMC）增生的抑制作用。方法构建携带IL-24基因的复制缺陷型腺病毒载体（Ad．IL-24）和携带绿色荧光蛋白的对照载体（Ad．GFP），在293细胞中扩增，5％FCS／DMEM中分组培养GMC，转染Ad．IL-24或Ad．GFP，加或不加LPS（10mg／L），分别用RT-PCR和ELISA检测IL-24mRNA和蛋白的表达；MTT（四甲基偶氮唑蓝法）和流式细胞术检测系膜细胞增生活性。结果培养GMC及LPS激活的GMC均未见IL-24表达。AdIL-24感染GMC后4～48hIL-24mRNA有稳定表达，培养上清IL-24含量在24和48h分别为（79．00±3．61）μg／L和（98．00±2．00）μg／L。感染AdIL-24对系膜细胞增生无影响，但可显著抑制LPS诱导的GMC增生。结论外源性IL-24基因转移可有效抑制LPS诱导的系膜细胞增生，Ad．IL-24有可能成为一种针对GMC增生的基因治疗方法。

hTERT启动子特异驱动IL-24重组腺病毒的包装及鉴定

目的包装并鉴定人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子特异驱动白介素-24(IL-24)的重组复制缺陷型腺病毒。方法全基因合成优化后的hTERT启动子,插入质粒pGL3-basic的多克隆位点(pGL3-phTERT);从人外周血单核细胞扩增IL-24,插入pGL3-phTERT质粒的hTERT启动子下游获得pGL3-phTERT-IL24;随后将phTERT-IL24插入pShuttle中间质粒,使用AdEasyTMAdenoviral Vector System包装Ad-phTERT-IL24重组腺病毒;同时包装CMV启动子驱动IL-24的腺病毒载体为阴性对照(Ad-CMV-IL24),以空载腺病毒Ad作为空白对照。用20 MOI重组腺病毒感染SGC-7901、MKN-45、HF细胞,采用PCR及Western blot检测IL-24在RNA及蛋白水平的表达。结果成功包装Ad-hTERT-IL24重组腺病毒。感染Ad-hTERT-IL24后,hTERT阳性肿瘤细胞内IL-24表达显著上调,但hTERT阴性的HF细胞则无IL-24表达;感染阴性对照Ad-CMV-IL24后,hTERT阳性或阴性细胞内均有IL-24表达,感染空白对照Ad后,hTERT阳性或阴性细胞内均无IL-24表达。结论 AdhTERT-IL24腺病毒载体可有效介导IL-24特异表达于hTERT阳性肿瘤细胞内。

IL-24-TRAIL基因载体的构建及其对乳腺癌干细胞迁移和凋亡的影响

目的构建真核表达载体pIRES-IL-24-TRAIL,探讨其对乳腺癌干细胞迁移和凋亡的影响。方法以人胎盘组织总RNA为模板,采用RT-PCR二步法,扩增TRAIL的cDNA序列,将其克隆入pIRES载体,扩增IL-24的cDNA序列,将其克隆入pIRES-TRAIL载体,构建重组真核表达载体pIRESIL-24-TRAIL,以Lipofectamine2000转染技术,将质粒pIRES-IL-24-TRAIL导入乳腺癌干细胞MCF-7和MDA-MB-231,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,划痕实验比较不同组间细胞迁移情况。结果(1)克隆到TRAIL、IL-24基因的cDNA序列,成功构建其真核表达载体。(2)流式细胞仪发现,实验组比对照组细胞凋亡率高(P<0.05)。(3)细胞划痕实验显示实验组细胞迁移能力明显低于对照组(P<0.05)。结论 pIRES-IL-24-TRAIL构建成功,并能诱导乳腺癌干细胞凋亡、降低其迁移能力。

靶向性抗肿瘤融合基因RGD-IL-24重组腺病毒的构建及鉴定

目的:构建靶向性抗肿瘤融合基因RGD-IL-24的重组腺病毒载体,转染乳腺癌MCF-7细胞观察其感染,并对其体外抗肿瘤效应和肿瘤靶向性进行初步研究。方法:利用PCR技术将GRGDS序列融合至IL-24的N端,克隆至pAdTrack-CMV质粒上。经PmeI线性化后与腺病毒骨架pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒载体pAdEasy/RGD-IL-24。重组腺病毒载体经PacI线性化后转染293细胞,包装出重组腺病毒Ad.RGD-IL-24。PCR方法鉴定重组腺病毒,TCID50测定病毒滴度,MTT法和形态学分析Ad.RGD-IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡的活性,细胞黏附实验评价其肿瘤靶向性。结果:成功构建腺病毒载体,腺病毒滴度达1.3×109pfu/mL。Ad.RGD-IL-24诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡,显著抑制其生长,并具有肿瘤靶向性。结论:成功构建了有较强感染能力和肿瘤靶向性的重组RGD-IL-24腺病毒载体。

pIRES-IL-24-TRAIL基因载体的构建及其对肝癌细胞迁移和凋亡的影响

目的构建真核表达载体pIRES-IL-24-TRAIL,探讨其对肝癌细胞迁移和凋亡的影响。方法以人胎盘组织总RNA为模板,采用RT-PCR二步法,扩增TRAIL的cDNA序列,将其克隆入pIRES载体,扩增IL-24的cDNA序列,将其克隆入pIRES-TRAIL载体,构建其真核瞬时表达载体pIRES-IL-24-TRAIL,以Lipofectamine2000转染技术,将TRAIL、IL-24基因导入肝癌细胞Bel-7402和PLC,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,划痕实验比较不同组间细胞迁移情况。结果①克隆到TRAIL、IL-24基因的cDNA序列,成功构建其真核表达载体;②流式细胞仪发现,实验组比对照组凋亡率高(P<0.05);③细胞划痕实验显示实验组细胞迁移能力明显低于对照组(P<0.05)。结论 pIRES-IL-24-TRAIL构建成功,并能诱导肝癌细胞凋亡、降低其迁移能力。

Ad-hIL-24体外诱导喉癌细胞Hep-2的凋亡作用

目的研究腺病毒介导的人白细胞介素-24(hIL-24)基因选择性诱导喉癌细胞Hep-2凋亡的作用。方法将携带有hIL-24基因的重组复制缺陷型腺病毒(Ad-hIL-24)感染喉癌细胞Hep-2,并以人胚肺成纤维细胞WI-38为对照,采用RT-PCR法检测Hep-2、WI-38细胞中外源性hIL-24基因表达;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)及流式细胞术等方法检测细胞的生长和凋亡情况。结果腺病毒介导的hIL-24基因能在Hep-2细胞和WI-38细胞中表达;MTT法显示Ad-hIL-24能明显抑制喉癌细胞Hep-2的生长,LSCM观察结果表明Ad-hIL-24能促进喉癌细胞Hep-2凋亡,流式细胞术显示Hep-2细胞经Ad-hIL-24感染48h后凋亡率为18.47%,G2/M期细胞百分比为38.9%,显著高于PBS组、Ad-GFP组和WI-38细胞,差异有高度统计学意义(P<0.01)。结论Ad-hIL-24能抑制喉癌细胞Hep-2生长和诱导Hep-2细胞凋亡,但对正常细胞无毒性作用。

Ad-IL-24对人胶质瘤细胞生长抑制效应的体外实验

研究携带人白介素24(IL-24)的腺病毒表达载体(Ad-IL-24)对人U251胶质瘤细胞生长的影响和抗肿瘤分子机制。将不同MOI Ad-IL-24感染U251人胶质瘤细胞后,MTT法检测Ad-IL-24对U251细胞生长的抑制作用,流式细胞仪和Hochest染色法检测细胞的凋亡率。RT-PCR检测bcl-2、bax、ICE、C-myc、HIF-1α和p53等基因的转录表达水平,Western blotting检测Cleaved Caspase-3的表达。结果表明100 MOI Ad-IL-24感染U251细胞后能明显抑制细胞生长,并能明显诱导细胞凋亡,感染72 h后细胞凋亡率可达42%,感染4 d后细胞生长抑制率可达50%。RT-PCR检测发现Ad-IL-24能引起与细胞凋亡和血管形成相关基因bax/bcl-2、ICE、C-myc、p53的上调和HIF-1α的下调,并促进Caspase-3的活化。本研究结果显示Ad-IL-24能明显抑制人胶质瘤细胞U251生长和诱导细胞凋亡,其抗肿瘤机制可能与通过bax/bcl-2、ICE、c-myc、p53的上调和HIF-1α的下调,进而导致Caspase-3的活化而诱导肿瘤细胞发生凋亡有关。

Ad-IL-24对SGC-7901胃癌细胞生长抑制的体外实验

旨在研究携带人IL-24基因的腺病毒表达载体(Ad-IL-24)对SGC-7901人胃癌细胞的生长抑制作用并分析其分子机制。以不同MOI(感染复数)的Ad空载体腺病毒感染SGC-7901人胃癌细胞,筛选出最佳感染剂量;Ad-IL-24以最佳感染剂量感染SGC-7901胃癌细胞,RT-PCR法和Western blotting法检测腺病毒介导的IL-24基因在SGC-7901胃癌细胞中的转录;MTT法检测Ad-IL-24对SGC-7901胃癌细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测其诱导SGC-7901人胃癌细胞凋亡和细胞周期改变的效应,Hoechst33258染色荧光显微镜检测其诱导胃癌细胞凋亡的核形态改变;RT-PCR半定量法进一步检测SGC-7901胃癌细胞中凋亡相关基因的转录。结果显示,100MOI为感染SGC-7901胃癌细胞的腺病毒最佳感染剂量;Ad-IL-24能成功介导IL-24基因在SGC-7901胃癌细胞中转录性表达;Ad-IL-24感染SGC-7901胃癌细胞后,能明显抑制胃癌细胞生长和诱导凋亡;Ad-IL-24能显著上调SGC-7901胃癌细胞中bax、caspase-3和p53的表达和下调bcl-2的表达。因此,腺病毒介导的IL-24表达具有明显抑制SGC-7901人胃癌细胞生长和诱导凋亡的抗肿瘤效应,其机制可能与上调bax/bcl-2、caspase-3和p53密切相关。

真核双基因表达载体pIRES-IL-24-ES的构建与鉴定

目的构建白介素24(IL-24)与内皮抑素(ES)的真核双基因表达载体,检测它们在体外的表达。方法从外周血和人胎肝组织中经RT-PCR分别扩增IL-24与EScDNA序列,并将其定向克隆至真核双基因表达质粒pIRES中,重组质粒pIRES-IL-24-ES,经酶切及测序鉴定后,转染NIH3T3成纤维细胞。经RT-PCR及ELISA法检测IL-24和ES在NIH3T3中的表达。结果重组真核双基因表达载体pIRES-IL-24-ES构建成功,IL-24与ES可在NIH3T3细胞中有效表达。结论真核双基因表达载体pIRES-IL-24-ES成功构建为研究肿瘤的基因治疗提供了一定线索。