人可溶性白介素-4受体(sIL-4R)在甲醇酵母中的表达

白细胞介素 4(IL 4)作为一种多功能的细胞因子在哮喘等变态性炎症反应中具有关键作用。IL 4通过结合细胞表面的白介素 4受体 (IL 4R)发挥其生物学效应。sIL 4R缺少跨膜和胞内结构域 ,结合IL 4后不能产生信号传递来介导IL 4的生物学活性 ,但sIL 4R与IL 4结合的高度特异性和极高的亲和力使它非常适合作为理想的IL 4拮抗剂应用于哮喘等疾病的治疗。采用RT PCR方法以人的单核细胞总RNA为模板扩增得到编码sIL 4R的基因片段 ,经测序证实后插入到甲醇酵母分泌表达质粒pPIC9K中 ,得到重组质粒pPIC9K sIL 4R ,利用限制性内切酶BglⅡ将其线性化后用电穿孔法导入PichiapastorisGS115。分别用SDS PAGE、Westernblot和Ligandbindingblot对重组菌发酵上清中的sIL 4R进行鉴定。结果表明 ,在分子量约为 3 0kD处有sIL 4R特异条带出现 ,并具有结合其配基IL

白介素-4受体基因多态性与哮喘发病关系的研究

目的 探讨白介素 4受体 (IL 4R)基因多态性 (Ile5 0Val)与哮喘发病之间的关系。方法 采用聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性分析法 (PCR RFLP)检测 34例哮喘患者、2 9例健康人IL 4R基因型。结果 哮喘组与健康对照组三种基因型 (Ile/Ile、Val/Ile、Val/Val)在分布上无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,哮喘组Ile5 0基因型出现的频率为 0 .4 85 ,对照组为 0 .5 5 2 ,两组比较无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 IL 4受体基因多态性 (Ile5 0Val)可能与哮喘发病无关。

靶向白介素-4受体的抗体类药物研究进展

白介素(interleukin,IL)-4是一种多效细胞因子,特异性地与细胞表面的IL-4受体(IL-4 receptor,IL-4R)结合后发挥其生物学效应。正常情况下细胞表面IL-4R表达水平较低,当受到激素、应激及炎症等刺激后表达量增高。目前发现IL-4/IL-4R在特应性皮炎(atopic dermatitis)、哮喘(asthma)及恶性肿瘤等疾病的发生、发展中起重要作用。当前,已有针对IL-4Rα靶点的抗体药物用于临床治疗,对于2型炎症疗效尤为突出,超过8个治疗型药物处在临床研究阶段。该文主要对IL-4/IL-4R信号通路及其相关疾病、靶向IL-4R的治疗性抗体药物研究现状及其临床应用作综述。

IRAK-4在白介素-1受体/Toll样受体(IL-1R/TLRs)介导的炎症信号通路中的关键作用

白介素-1受体相关激酶4(interleukin-1 receptor-associated kinase 4;IRAK-4)是近年来发现的参与机体先天性免疫反应过程中的关键分子。它与另外3个成员IRAK-1、IRAK-2、IRAK-M同属于IRAK家族,目前经过对IRAK-4分子的激酶活性以及其对炎症反应的正向和负向的调控作用的研究表明,IRAK-4分子联系着上下游的信号转导,在TLRs/IL-1R介导的炎症信号通路中的作用更为关键。本文就IRAK-4分子的活性、以及IRAK-4分子在TLRs/IL-1R介导的炎症信号转导通路中的作用作一综述。以期设计出针对IRAK-4特异性的药物,或者通过基因治疗手段干预IRAK-4表达,为感染控制提供新的思路,开发出新的抗炎药物。

人可溶性白介素4受体(sIL4R)在大肠杆菌中的表达和纯化

白细胞介素 4 (IL 4 )作为一种多功能的细胞因子在哮喘等变态性炎症反应中具有关键作用 .IL 4通过结合细胞表面的白介素 4受体 (IL 4R)发挥其生物学效应 .sIL 4R缺少跨膜和胞内结构域 ,结合IL 4后不能产生信号传递介导IL 4的生物学活性 ,但sIL 4R与IL 4结合的高度特异性和极高的亲和力使它非常适合作为理想的IL 4拮抗剂 ,应用于哮喘等疾病治疗 .采用RT PCR方法 ,以人单核细胞总RNA为模板扩增得到编码sIL 4R的基因片段 ,经测序确证后插入大肠杆菌高效表达质粒pBV2 2 0 ,得到重组质粒pBV2 2 0 sIL 4R ,重组质粒转化E .coliDH5α .重组菌经温度诱导后超声破碎得到包涵体 ,经SuperdexHR75分子筛柱和DEAE SepharoseFastFlow离子交换柱进行纯化 ,HPLC检测表明纯度达到 90 % .N端测序证明 ,重组sIL 4R与天然sIL 4RN端序列完全一致 .Western印迹、配基结合印迹对重组sIL 4R进行鉴定 .结果表明 ,重组sIL 4R具有结合IL

基因工程人可溶性白细胞介素4受体（sIL-4R）

白细胞介素-4(IL-4)作为一种多功能的细胞因子在哮喘等变态性炎症反应中具有关键作用。IL-4通过结合细胞表面的白介素-4受体(IL-4R)发挥其生物学效应。sIL-4R缺少跨膜和胞内结构域，结合IL-4后不能产生信号传递介导IL-4的生物学活性，但sIL-4R与IL-4结合的高度特异性和极高的亲和力使它非常适合作为理想的IL-4拮抗剂应用于哮喘等疾病的治疗。国外已经应用重组sIL-4R蛋白进行治疗哮喘的临床研究，美国Immunex公司制备的sIL-4R重组蛋白(商品名为NuvanceIM)己进入临床Ⅱ期研究，结果显示了良好的治疗效果，无副作用，

白细胞介素4受体α亚单位基因多态性与重症肌无力的相关性

目的探索IL-4R基因多态性与汉族人MG易感性和严重程度的相关性。方法采用SNPscan^(TM)技术对480例MG患者和487例健康对照的6个SNP(rs2107356、rs1805010、rs1805011、rs1805015、rs1801275和rs8832)进行分型,比较MG与对照组、MG亚组与对照组及亚组间等位基因和基因型的频率。结果 rs2107356和rs1805010的等位基因和基因型频率在伴胸腺瘤的成人亚组高于对照组和不伴胸腺瘤的成人亚组,但不伴胸腺瘤的成人亚组和对照组之间无差异。MG患者rs1801275 G等位基因的频率高于对照组,尤其是在AChR抗体阳性不伴胸腺瘤的成人亚组。rs1801275的基因型是MG患者AChR抗体阳性的独立相关因素。结论在中国汉族人群,rs2107356、rs1805010和rs1801275与MG的易感性相关。

系统性红斑狼疮患者外周血单一核细胞IL-4受体水平的研究

目的:探讨白介素(IL)-4受体在系统性红斑狼疮(SLE)发病中的作用及其临床意义。方法:应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测89例SLE患者和30名健康对照者外周血单一核细胞(PBMC)中IL-4受体mRNA的表达水平;用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中IL-4水平。结果:①活动期SLE患者、非活动期SLE患者及健康对照者PBMCIL-4受体表达阳性率为100%。②活动期SLE患者、非活动期SLE患者及健康对照者PBMCIL-4受体mRNA表达水平分别为0.604±0.147、0.400±0.130、0.370±0.070。活动期SLE患者和非活动期SLE患者比较、活动期SLE患者和正常对照者比较差异均有显著性(P=0.000),非活动期SLE患者和正常对照者比较差异无显著性(P=0.351)。③血清中IL-4水平在活动期SLE患者显著高于非活动期SLE患者和正常对照组(P=0.000),非活动期SLE患者显著高于正常对照组(P=0.000),活动期和非活动期SLE患者血清中IL-4水平与PBMCIL-4受体表达水平呈正相关(r=0.622～0.859,P<0.05)。结论:IL-4及其受体的异常表达可能在SLE疾病活动和进展过程中起重要作用。检测SLE患者PBMCIL-4受体的表达水平可作为了解疾病活动性的指标之一。

肝X受体激动剂对脂多糖诱导的炎症反应相关因子IRAK-4和NF-κB的影响

目的:观察在枯否细胞中人工合成的肝X受体激动剂在脂多糖(LPS)诱导的炎症反应中,对白细胞介素-1受体相关激酶-4(IRAK-4)和核因子NF-κB的影响。方法:雄性昆明小鼠,用胶原酶原位灌注法分离和培养肝脏Kupffer细胞,获得的细胞随机分为正常对照组、LPS处理组、LXR人工合成激动剂T0901317处理组和LPS+T0901317共同处理组。实时-聚合酶链式反应和蛋白Western blot检测各组细胞LXR、IRAK-4和NF-κB的mRNA和蛋白表达水平;凝胶电泳迁移率(EMSA)检测NF-κB活性水平。结果:LXR mRNA和蛋白在T0901317组表达都是最高的,而在LPS处理组最低。I-RAK4和NF-κB的mRNA和蛋白水平在LPS处理组最高,联合处理组要低于LPS处理组。NF-κB的活性在LPS最高,联合处理组和T0901317处理组都较LPS组降低。结论:LXR激动剂能有效的上调LXR基因和蛋白水平,同时抑制TLR4信号通路中IRAK-4和NF-κB的mRNA水平和蛋白表达水平,并且能抑制NF-κB的活化。

miR-485-5p通过靶向白介素-1受体关联激酶4调控巨噬细胞炎症反应

目的探究miR-485-5p对白介素-1受体关联激酶4(IRAK-4)的靶向作用,研究其在巨噬细胞模型炎症反应中的调控作用。方法合成miR-485-5p模拟物(mimics)及其抑制剂(inhibitors),分别转染HEK-293T细胞,RT-PCR检测miR-485-5p的表达水平。根据miRNA靶向作用预测数据分析选定IRAK-4作为研究的靶基因,构建IRAK-43'UTR及其突变体萤火虫-海肾双荧光素酶报告基因系统,通过检测在细胞模型中过表达/抑制表达miR-485-5p后对荧光素酶活力的影响,验证miR-485-5p与IRAK-4之间的靶向关系,Westernblot检测IRAK-4蛋白质表达水平。构建巨噬细胞模型,将miR-485-5pmimics及inhibitors分别转染巨噬细胞,RT-PCR检测靶基因IRAK-4mRNA的表达水平,ELISA检测上清中下游致病因子IL-6、IL-17、IL-18的表达。结果通过实验证实miR-485-5p与IRAK-4存在靶向作用。细胞模型中,与对照组相比,转染miR-485-5pmimics后miR-485-5p表达水平升高了17.15倍(P<0.01),转染miR-485-5pinhibitors后miR-485-5p表达水平降低了79.80%(P<0.05)。过表达miR-485-5p后明显抑制IRAK-4的蛋白水平表达及mRNA相对含量,抑制下游炎性因子IL-6、IL-17、IL-18的表达(P<0.05);抑制表达miR-485-5p,则上调IRAK-4的蛋白水平及mRNA相对含量,可显著提高IL-6、IL-17、IL-18的释放(P<0.05)。结论证实miR-485-5p可以通过对靶向IRAK-4的特异性序列,调控下游炎性细胞因子的表达,进而调控细胞的炎症反应。

anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1纳米粒子的构建及其治疗哮喘小鼠的应用

采用基因工程方法分别将抗表皮生长因子受体(EGFR)的单链抗体(anti-EGFR scFv)和靶向白介素-4-受体(IL-4R)的AP1短肽分别修饰到铁蛋白重链亚基(FTH1)的N端,再通过蛋白表达、体外混合复性后成功制备了anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1双靶向纳米粒子。结果表明:该纳米粒子能正确组装成铁蛋白的特征笼状结构,粒径为(13.2±1.3)nm。在哮喘小鼠模型中发现该纳米粒子能有效抑制哮喘多种症状,且在缓解气道高反应方面的效果优于单靶向anti-EGFR scFv-FTH1/FTH1纳米粒子。

白细胞介素-1受体相关激酶-4短发夹RNA阻断库普弗细胞激活效应的实验研究

目的探讨以白细胞介素-1受体相关激酶-4(IRAK-4)特异性短发夹RNA(shRNA)阻断内毒素诱导的库普弗细胞(KCs)激活效应的可行性。方法构建两对表达IRAK-4-shRNA的阳性载体质粒(pSⅡRAK-4-A,pSⅡRAK-4-B)及一对阴性载体质粒(pSⅡRAK-4-C)。分离培养小鼠KCs,分为正常对照组,RNA干扰(RNAi)对照组(转染pSⅡRAK一4 C)与RNAi抑制组(转染pSⅡRAK-4-A, pSⅡRAK-4-B)。质粒转染后24 h,加入0.1 μg/ml脂多糖(LPS)。6 h后,蛋白免疫印迹法及逆转录-聚合酶链反应测定IRAK-4蛋白和mRNA表达水平;酶联免疫吸附法检测0、1、3、6、12 h后KCs的核因子- κB(NF-κB)活性及培养上清液中肿瘤坏死因子α含量。结果RNAi抑制组IRAK-4表达水平,以及LPS刺激后NF-κB活性、肿瘤坏死因子α峰值均明显低于正常对照组和RNAi对照组,t值分别为22.50, 4.18及958.49,P<0.01;尤其是pSⅡRAK-4-A组,抑制效果明显优于pSⅡRAK-4-B,t值分别为12.60, 3.36及256.39,P<0.01。结论以IRAK-4为靶点的shRNA能有效的阻断内毒素诱导的KCs激活效应。

IRAK4对心肌细胞凋亡的影响

目的探讨白介素-1受体相关激酶-4(interleukin 1 receptor-associated kinase-4,IRAK-4)对心肌肥厚诱导的心肌细胞凋亡的影响。方法本研究采用野生型(C57)和IRAK4基因敲除型(heterozygous IRAK4 knockout,IRAK4 HET)两组小鼠,行胸主动脉缩窄术(aortic banding,AB)建立动物模型。术后4周取材,用TUNEL法检测心肌组织细胞凋亡水平,Western blot法检测Bcl-2、Bax、C-caspase-3的表达水平。观察IRAK4基因敲除对压力负荷诱导的小鼠心肌组织中心肌细胞凋亡的影响;采用H9C2细胞(对照组)和IRAK4过表达的H9C2细胞(pc DNA3.1-IRAK4),使用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)分别刺激0、15、30、60min,用Western blot法检测各组细胞中Bcl-2、Bax、C-caspase-3的表达水平;AngⅡ组和pc DNA3.1-IRAK4组细胞经AngⅡ刺激48h后,用TUNEL法检测心肌细胞凋亡水平。观察IRAK4过表达对AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡的影响。结果 AB术后,与C57组小鼠相比,IRAK4 HET小鼠Bax、C-caspase-3蛋白表达水平显著增高,Bcl-2蛋白表达水平降低,心肌细胞凋亡水平明显增加;AngⅡ刺激后,与AngⅡ组细胞比较,PC DNA3.1-IRAK4组细胞Bcl-2的表达水平上调,Bax、C-caspase-3的表达水平下调,细胞凋亡数量明显降低。结论 IRAK4对心肌肥厚所诱导的心肌细胞凋亡具有保护作用。

大建中汤治疗大鼠脾阳虚胃炎的机制

目的:探讨大建中汤治疗脾阳虚胃炎的作用机制。方法:SD大鼠,随机分为正常对照组、模型组、枸橼酸铋钾对照组,大建中汤高、中、低剂量组。采用RT-PCR检测单核细胞白介素-1受体相关激酶-4(IRAK-4)mRNA表达水平;ELISA法检测血清中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α);同时观察胃黏膜的病理。结果:与正常对照组相比,模型组大鼠IRAK-4mRNA和血清中IL-6、TNF-α的水平升高,胃黏膜显示腺萎缩、浸润;与模型组比较,大建中汤高剂量组、中剂量组IRAK-4mRNA和血清中IL-6、TNF-α均降低,差异有统计学意义;大建中汤低剂量组血清中IL-6、TNF-α差异亦显著;大建中汤低剂量组IRAK-4mRNA无明显差异。结论:大建中汤高剂量组、中剂量组均对脾阳虚胃炎有显著治疗作用,大建中汤降低IRAK-4、IL-6及TNF-α可能是治疗胃炎的机制之一。

尿酸性肾病中IL-1β、IRAK-4的表达及意义

目的：通过研究尿酸性肾病动物模型中白介素-1（IL-1）β和白介素-1受体相关激酶4（IRAK-4）表达的意义,了解IL-1β信号通路在尿酸性肾病中的作用。方法：Wistar大鼠54只随机分为高尿酸血症组30只、正常组24只,制备尿酸性肾病大鼠模型,检测尿酸（UA）、尿素氮（BUN）、肌酐（CR）及肌酐清除率（Ccr）、24 h尿微量白蛋白（m A1b）;取肾脏组织行HE染色,观察形态学变化;免疫组化测定IL-1β的表达;荧光定量PCR检测IRAK-4 m RNA的水平。结果：高尿酸组2、4、6周时IL-1β的表达均增加,免疫组化评分（IHS）均明显升高（P〈0.01）;高尿酸血症组较正常组IRAK-4 m RNA在2、4、6周时均出现表达上调,4~6周IRAK-4 m RNA表达明显增加,与正常组比较有显著性差异（P〈0.01）。结论：IL-1β、IRAK-4参与了尿酸性肾病炎症反应的过程,可能为尿酸性肾病治疗提供新的可能。

桂枝挥发油及桂皮醛抗流感病毒的机制研究

目的考察桂枝挥发油及其主要成分桂皮醛体外对甲型流感病毒鼠肺适应株A/PR/8/34(H1N1)的直接杀灭作用,探讨其抗流感病毒作用机制中Toll样受体7(TLR7)信号通路的作用。方法以流感病毒感染的狗肾传代细胞(MDCK)为载体,测定桂枝挥发油及桂皮醛体外抑制流感病毒增殖的半数抑制浓度(IC50)和治疗指数(TI);ELISA法检测MDCK细胞干扰素-β(IFN-β)的分泌;RT-PCR法考察MDCK细胞中Toll样受体3(TLR3)、TLR7、肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF-3)、白介素-1受体相关激酶4(IRAK-4)、IFN-β基因的表达。结果桂枝挥发油及桂皮醛对流感病毒有明显的直接杀灭作用,IC50分别为1.85×10 7、5.77×10 7g/mL,TI分别为27.04、9.51。与病毒组比较,桂枝挥发油和桂皮醛0.25×10 5g/mL显著升高感染甲型流感病毒的MDCK细胞上清液中IFN-β的量(P<0.05),显著上调细胞中TLR7、IRAK-4、IFN-βmRNA表达水平(P<0.05)。结论桂枝挥发油及桂皮醛对流感病毒H1N1的增殖有显著抑制作用,作用机制可能与其激活TLR7信号通路、活化IRAK-4、诱导IFN-β高表达有关。