白喉毒素及其衍生物在脑胶质瘤靶向治疗中作用的研究进展

白喉毒素(DT)及其衍生物可通过受体介导的胞吞转运作用穿越血脑屏障(BBB),并将毒素或药物靶向递送至肿瘤细胞,是有前景的靶向治疗脑胶质瘤的策略之一。目前,用于靶向治疗脑胶质瘤研究的DT衍生物主要有CRM107、DT389-EGF、CRM197、DTAT/DTAT13/DTATEGF和DTEGF13。其中,CRM107和DT389-EGF已经进入临床Ⅱ期试验,其余衍生物尚处于临床前研究阶段。根据现有研究进展,CRM107和CRM197是最有希望在脑胶质瘤治疗中取得突破的两种衍生物,但关键在于降低其毒副作用和提高靶向性。因此,明晰DT及其衍生物在靶向治疗脑胶质瘤的关键作用机制及应用现状,可为促进开发高效低毒的脑胶质瘤治疗药物提供新的思路。

不同剂量白喉毒素对野生型听力成熟小鼠耳蜗结构及听功能的影响

目的观察不同剂量白喉毒素对野生型听力成熟小鼠的耳蜗结构及听功能的影响,为建立白喉毒素受体介导的细胞敲除系统动物模型提供参考。方法 4周龄C57BL/6J小鼠30只随机分为50ng/g组、100ng/g组和对照组,每组10只;其中50ng/g组和100ng/g组小鼠分别单次腹腔注射白喉毒素50ng/g、100ng/g,对照组小鼠单次腹腔注射等量生理盐水,注射后7天观察两组动物的一般情况,并记录小鼠ABR反应阈,观察小鼠内外毛细胞、螺旋神经节神经元。结果在白喉毒素注射后第7天,各组动物情况良好,无明显体重下降,中耳腔无积液。50ng/g组小鼠2、8、32kHz ABR反应阈分别为57.5±2.74、20.83±2.04、45.83±2.04dB SPL,与对照组比较(分别为56.25±2.31、20.0±3.78、49.38±6.78dB SPL)差异无统计学意义;内、外毛细胞损失率分别为0.8%±0.5%、1%±0.6%;对照组分别为0.3%±0.5%、0.4%±0.3%;螺旋神经节神经元SGN密度为39.45±3.65个/105μm2、对照组为41.03±3.73个/105μm2,均未见明显细胞缺失。100ng/g组小鼠2、8、32kHz ABR反应阈分别为85±3.54、63±4.47、90±0dB SPL,较前两组显著升高(t=19.62,P<0.001),内、外毛细胞损失率分别为0.5%±0.1%、10.7%±0.3%,损伤严重,底、中、顶回缺失达10%(t=42.219,P<0.001);SGN密度为25.55±3.66个/105μm2,平均减少38%,与对照组相比差异有显著统计学意义(t=10.985,P<0.001)。结论 100ng/g白喉毒素注射能引起听力成熟野生型C57BL/6J小鼠外毛细胞及螺旋神经元的损伤。

条件性子宫细胞剔除的研究

为了研究体内细胞的功能和各种细胞之间的相互作用,试验研究了可以特异性消除特定细胞的条件性细胞剔除新方法。通过PR^Cre/+工具鼠与pCAG-loxp-STOP-loxp-DTR-2A-EGFP转基因小鼠(DTR小鼠)交配获得子宫特异表达白喉毒素受体(DTR)的转基因小鼠,经过PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定基因后,筛选出PR^Cre/+/pCAG-loxp-STOP-loxp-DTR-2A-EGFP雌性小鼠(PR-DTR小鼠)。以DTR小鼠和野生型小鼠(WT小鼠)作为试验对照组,利用免疫组织化学和Western blotting检测子宫中绿色荧光蛋白(GFP)的表达。腹腔注射白喉毒素1 ng/d,连续2 d,观察PR-DTR小鼠、DTR小鼠和WT小鼠子宫的外部形态差异,并通过HE染色的方法观察子宫的内部形态。使用免疫组织化学方法检测注射白喉毒素后PR-DTR小鼠、DTR小鼠和WT小鼠子宫中叉头框蛋白A2(FOXA2)的表达。试验发现在小鼠子宫上皮、基质和肌层细胞中都有GFP的表达,注射白喉毒素后PR-DTR小鼠子宫红肿膨胀,DTR小鼠和WT小鼠子宫没有显著变化。HE染色试验结果发现,PR-DTR小鼠子宫中出现异常空腔,而DTR小鼠和WT小鼠子宫没有明显变化,并且对注射白喉毒素的PR-DTR小鼠子宫中FOXA2表达的检测结果表明,这些异常的空腔不属于腺体,说明白喉毒素使细胞死亡,证实在小鼠子宫中表达孕酮受体的细胞表达了DTR。试验结果表明,白喉毒素在PR-DTR小鼠子宫中可以条件性剔除子宫中表达孕酮受体的细胞,为研究子宫细胞的功能以及子宫细胞相互之间的作用提供了新方法。

巨噬细胞特异性表达载体的构建及鉴定

目的构建巨噬细胞特异性白喉毒素受体过表达载体并检测其在巨噬细胞中的表达情况。方法将白喉毒素受体基因Hbegf克隆入pc DNA3. 1载体中扩增Hbegf与BGHpoly A尾片段,与克隆入p UCm-T载体中的巨噬细胞特异性启动子相连接,分别转染巨噬细胞与其他细胞,通过荧光定量PCR鉴定其表达情况。结果特异性表达载体通过测序以及酶切鉴定构建成功,在巨噬细胞中的表达高于未转染的巨噬细胞以及转染的非巨噬细胞。结论构建了巨噬细胞特异性表达人白喉毒素受体载体,瞬时转染后可在巨噬细胞中特异性表达白喉毒素受体,为动脉粥样硬化易损性斑块的建立以及斑块内与凋亡相关的其他研究提供了一定依据。

巨核细胞通过血小板第4因子反馈调节造血干细胞的休眠：第55届美国血液学会年会报道

纽约爱因斯坦医学院的一个研究将白喉毒素受体在血小板第4因子（PF4）启动子驱动下选择性表达于巨核细胞,从而建立了一个小鼠株（PF4-cre：iDTR）.白喉毒素可耗尽小鼠的巨核细胞.白喉毒素处理使PF4-cre：iDTR小鼠骨髓中的巨核细胞下降.伴随着小鼠骨髓中的巨核细胞下降,造血干细胞（HSC）数量及增殖能力增加.这个小组进一步证明了PF4在维持HSC的休眠.因此,巨核细胞受体,一个HSC的后代细胞,首次被证明通过PF4反馈性调节了HSC的休眠状态.