高纯度白喉毒素突变体CRM197的制备及鉴定

为了制备高纯度的白喉毒素无毒突变体CRM197,可作为载体蛋白用于细菌性结合疫苗开发,对CRM197基因进行大肠杆菌密码子优化,并克隆至表达载体pET28a(+)中,将鉴定正确的重组质粒pET28a-CRM197转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并分析其表达形式及表达条件的优化。再对表达的重组CRM197蛋白进行纯化,最后对纯化的CRM197进行WB、纯度、分子量和圆二色谱等检测项目的初步鉴定分析。PCR酶切和测序鉴定结果表明重组质粒pET28a-CRM197构建成功,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,获得重组工程菌(E.coli(DE3/p28a/197))。该重组工程菌发酵的最佳接种量为5%~10%(v/v),且主要以包涵体形式表达,收获的菌体在高压均质机破碎压力为1000 bar的条件下进行破碎,然后利用6 mol/L盐酸胍进行溶解变性,复性及经30 kD超滤膜包超滤后上纯化系统AKTA pure150 M,经一步阴离子交换层析进行纯化,其纯度可达98%以上,WB、分子量及圆二色谱等鉴定结果均与标准品一致。综上所述,成功建立大肠菌表达系统CRM197制备方法,具有无标签、产量高及纯度高等特点,可用于该蛋白的规模化生产。

原核表达及一步法制备可溶性白喉毒素突变体CRM197

目的构建一种新型的重组蛋白大肠杆菌胞内自动切割表达系统表达可溶性的CRM197重组蛋白,实现一步法纯化。方法将CRM197编码序列与硫氧还蛋白(Trx)序列融合并克隆于原核表达载体p ET-32a(+)载体上,Trx与CRM197之间加入HRV3C(人鼻病毒3C)蛋白酶识别区序列和组氨酸纯化标签编码序列,HRV3C蛋白酶基因克隆于原核表达质粒p GArasd,共同转化大肠杆菌Origami B(DE3),15℃温和诱导,并使用Ni-NTA基质亲和纯化CRM197重组蛋白。结果 CRM197融合蛋白表达后,随即被伴随表达的HRV3C蛋白酶水解释放出游离的带His标签的CRM197重组蛋白,经过一步法亲和纯化,得到纯度约95%的CRM197样品。与DNA共同孵育,显示所获CRM197重组蛋白具有脱氧核糖核酸酶活性。结论通过构建新型的双质粒自动切割原核表达系统,简化了在大肠杆菌表达纯化可溶性CRM197重组蛋白的工艺,降低了制备成本。

新型用于艾滋病基因治疗的结合白喉毒素突变体的慢病毒载体

慢病毒载体作为基因治疗的工具之一备受关注,尤其是基于HIV-1构建的慢病毒载体。结合笔者的研究工作,对特异性识别HIV阳性细胞的非整合性依赖Rev并结合白喉毒素突变体的新型慢病毒载体构建以及抗白喉毒素细胞系的建立作了介绍。

大肠杆菌表达白喉毒素突变体CRM197高密度发酵工艺研究

本文对具氨苄抗性编码白喉毒素突变体CRM197基因质粒的的大肠杆菌BL-21/pET25b的发酵条件进行了研究,获得了CRM197高效表达的最佳条件。在IPTG诱导作用下,CRM197以包含体的形式存在。采用变速补料分批发酵工艺,经10 h发酵菌体收获量可达50 g/L(湿重),目的蛋白表达量约占总蛋白的18%以上。

b型流行性感冒嗜血杆菌结合疫苗(磷酸多核糖基核糖醇-白喉毒素突变体197)的安全性和免疫原性研究

目的评价b型流行性感冒嗜血杆菌结合疫苗(Haemophilus Influenzae Typeb Conjugate Vaccine,Hib)[磷酸多核糖基核糖醇-白喉毒素突变体197(Polyribosylribitol Phosphate-Cross Reacting Material197,PRP-CRM197)]在中国儿童使用的安全性、免疫原性和加强免疫后的抗体应答。方法研究分三个阶段:第一阶段为I期安全性研究,先入组20名16～20月龄的幼儿,接种1剂Hib PRP-CRM197;15d后入组20名2～4月龄的婴儿,按间隔1个月的程序接种3剂Hib PRP-CRM197。每剂接种后收集30d内的安全性数据。第二个阶段为Ⅲ期基础免疫,入组916名2～4月龄受试者,随机分配到试验组(611人)和对照组(305人),分别接种3剂Hib PRP-CRM197或Hib PRP-T(Tetanus Toxoid,TT;破伤风类毒素)对照疫苗,每剂间隔1个月。第三个阶段为Ⅲ期加强免疫,对基础免疫完成3剂疫苗接种的受试者,于1周岁后加强免疫1剂。在Ⅲ期临床研究中,收集安全性和免疫原性的数据。抗-PRP抗体测定采用酶联免疫吸附试验。结果Ⅰ期安全性研究发现,Hib PRP-CRM197在两个年龄组(婴儿和幼儿)都有良好的耐受性。基础免疫和加强免疫的Ⅲ期临床研究表明,Hib PRP-CRM197的安全性和HibPRP-T相似。在完成基础免疫后1个月,实验组和对照组的所有受试者均达到了短期血清保护性抗-PRP抗体水平[≥0.15微克/毫升(g/ml)],且分别有99%和97%的受试者达到了长期血清保护性抗-PRP抗体水平(≥1.0g/ml)。在完成加强免疫后,所有受试者均达到了短期和长期的血清保护性抗体水平。与HibPRP-T组相比,接种HibPRP-CRM197始终产生更高的抗体几何平均浓度。结论 Hib PRP-CRM197疫苗在基础免疫和加强免疫后,都显示了良好的耐受性和快速的抗-PRP抗体应答。Hib PRP-CRM197的免疫原性不劣于HibPRP-T,且安全性也相似。Hib PRP-CRM197可用于中国儿童抗Hib感染的常规免疫接种。临床试验注册国家食品药品监督管理局《药物临床批件》2008L03160。

白喉毒素突变体CRM197在大肠杆菌中的高效可溶表达、纯化及免疫原性分析

CRM197(Cross-reacting material 197)是白喉毒素的无毒突变体,在生物制药领域具有非常广泛的应用前景。为了实现CRM197在大肠杆菌中的无标签、可溶表达,以替代现有昂贵、复杂的白喉杆菌分泌发酵工艺,文中对目的蛋白的序列进行优化,转化大肠杆菌经IPTG诱导,目的蛋白获得了可溶性高表达,目的蛋白约占碎菌上清总蛋白的40%。超声破菌后、经阴离子交换、肝素亲和以及脱盐三步柱上层析获得纯度高于95%的CRM197样品。细胞毒性实验证明,CRM197的IC_(50)值是白喉毒素IC_(50)值的2.1×10~7倍,是白喉类毒素IC_(50)值的9.6倍,表明文中表达的CRM197是安全无毒的。随后,比较了高、低剂量的CRM197在小鼠体内的免疫原性,发现2μg组三免后的抗体滴度与20μg组的相当,可达1︰409 600。文中建立了CRM197的无标签、高效、可溶表达的大肠杆菌表达系和快速纯化体系,获得了具有较好免疫原性和安全性的重组蛋白,为该蛋白的进一步应用奠定了基础。

b型流行性感冒嗜血杆菌结合疫苗(磷酸多核糖基核糖醇-白喉毒素突变体197)在13～59月龄儿童中的安全性和免疫原性研究

目的评价b型流行性感冒嗜血杆菌结合疫苗(Haemophilus Influenzae Typeb Conjugate Vaccine,Hib)[磷酸多核糖基核糖醇-白喉毒素突变体197(Polyribosylribitol Phosphate-Cross Reacting Material197,PRP-CRM197)]在13～59月龄儿童中使用的安全性和免疫原性。方法选择728名13～59月龄儿童,按1:1的比例随机分配到试验组(365人)和对照组(363人),分别肌内注射接种1剂PRP-CRM197或Hib[PRP-T(Tetanus Toxoid,TT;破伤风类毒素)],观察接种后7d内的局部和全身反应,收集接种后30d内的不良事件和用药情况。在接种疫苗前和接种疫苗后30d采集静脉血,用酶联免疫吸附试验检测抗-PRP抗体(Antibody to PRP,Anti-PRP)。结果分别有99%和100%接种PRP-CRM197和PRP-T的受试者,达到了短期[≥0.15微克/毫升(g/ml)]和长期(≥1.0g/ml)血清保护性Anti-PRP水平。两种疫苗的安全性相似。结论 Hib(PRP-CRM197)的耐受性良好,免疫原性不劣于Hib(PRP-T),为99%的受试者提供了血清保护性Anti-PRP。Hib(PRP-CRM197)可在13～59月龄儿童中进行免疫。临床试验注册国家食品药品监督管理局《药物临床批件》2008L03160。

人免疫缺陷病毒包膜蛋白V3多肽与白喉毒素无毒突变体CRM197结构域A融合蛋白的免疫原性分析及单克隆抗体筛选

目的 评估CRM197-HIV-V3作为HIV表位疫苗的潜力,以此筛选HIV单克隆中和抗体,为后续疫苗和治疗性抗体的研究奠定基础。方法 将HIV-1 NL4-3 V3肽（299~328 aa）展示在白喉毒素无毒突变体A结构域（CRM197-A）上,利用大肠杆菌原核表达系统进行表达。纯化后的融合蛋白免疫6~8周龄的雌性Balb/c小鼠,免疫3针后,进行脾脏免疫加强,后将小鼠的脾细胞与小鼠杂交瘤细胞进行融合实验。利用基于免疫斑点印迹法（ELISPOT）的HIV中和筛选平台筛选单克隆抗体,对获得的单抗进行抗原性的分析。结果 构建克隆后,成功表达了NL4-3 HIV V3肽融合蛋白（CRM197-A-V3）,免疫小鼠的多抗血清对NL4-3株HIV病毒的中和效价约为103,ELISA检测多抗血清结合CRM197-A-V3抗原效价达到105。通过融合筛选和单细胞克隆化获得8株单克隆抗体。ELISA结果显示与NL4-3-gp120蛋白有较好的结合活性。中和实验结果显示抗体对NL4-3株HIV病毒有很好的中和能力,NC50为0.02μg/m L。结论 本研究将HIV V3表位展示在CRM197-A上,成功刺激小鼠产生免疫反应,筛选获得特异性针对NL4-3株HIV的中和单抗。

分子伴侣对白喉毒素无毒突变体CRM197重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的促进作用

为了获得有活性的白喉毒素突变体蛋白(Cross-reactingmaterial197,CRM197),本研究利用分子伴侣pG-KJE8与重组质粒pET28a-CRM197在大肠杆菌原核表达系统中进行共表达,来促进目的蛋白的正确折叠,进而提高CRM197蛋白的可溶性表达。将质粒转化至大肠杆菌后并诱导其表达目的蛋白,再通过SDS-PAGE胶染色、Western blotting等技术对所得蛋白进行检测分析。结果发现:利用体外重组技术成功得到了pET28a-CRM197重组蛋白原核表达质粒,且CRM197重组蛋白在原核表达系统中主要以包涵体形式表达;通过探索和优化,确定了诱导蛋白的最佳浓度和温度,当加入终浓度为1.0 mmol/L IPTG、0.5 mg/mL L-阿拉伯糖、5.0 ng/mL四环素,在20℃条件下诱导16h时,目的蛋白的可溶性表达得到显著提高;可溶性表达的CRM197重组蛋白可以与CRM197一抗发生特异性结合,免疫反应性良好。因此,研究发现分子伴侣pG-KJE8可以促进CRM197重组蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式表达,且能很好地与CRM197一抗发生特异性结合,证实CRM197重组蛋白具有良好的免疫反应性,为CRM197蛋白的工业化生产及应用奠定了一定的基础。

重组白喉毒素无毒突变体CRM_(197)柱复性及纯化工艺的优化

目的优化重组白喉毒素无毒突变体CRM197(recombinant cross reacting material 197,rCRM197)柱复性及纯化工艺。方法将Sephacryl S-200凝胶柱复性和Q Sepharose FF强阴离子交换层析结合,复性和纯化rCRM197;通过正交试验L9(34)考察凝胶层析复性时流速、离子交换层析纯化的pH值、淋洗液中NaCl浓度和洗脱液中NaCl浓度4种因素对rCRM197纯度及回收率的影响,筛选rCRM197复性及纯化的最佳工艺。结果包涵体经Sephacryl S-200凝胶柱复性后,相对分子质量小于36 000的杂质已被去除;经Q Sepharose FF离子交换层析后,rCRM197纯度达95%以上;在复性时流速为10 ml/min、离子交换层析纯化的pH值为7.5、淋洗液为50 mmol/L Tris-Cl+30 mmol/L NaCl、洗脱液为50 mmol/L Tris-Cl+50 mmol/L NaCl的条件下,rCRM197能达到纯度和回收率的共平衡。结论已筛选出rCRM197复性及纯化的最佳工艺,该工艺操作简便,制备的rCRM197纯度高,适用于rCRM197的产业化。

柯萨奇病毒A组6型VP1与白喉毒素无毒突变体GRM197融合蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CVA6)VP1蛋白与白喉毒素无毒突变体CRM197片段A的融合蛋白(CRM197A-CVA6 VP1),并评价其免疫原性。方法将经密码子优化的CRM197A基因与CVA6 VP1基因连接,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-CRM197A-CVA6 VP1,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA柱层析及透析复性后获得重组蛋白CRM197A-CVA6 VP1,检测重组蛋白的粒径及电位,并进行蛋白荧光光谱检测。经沙鼠腹腔注射免疫铝佐剂吸附的重组蛋白CRM197A-CVA6VP1,20μg/(只·0.5 mL),同时设对照组(等体积的铝佐剂);1周后进行加强免疫,免疫途径及剂量同上。首次免疫后4周,经沙鼠眼眶采血,分离血清,ELISA法检测血清结合抗体,微量细胞病变法检测血清中和效价。相同方法对沙鼠进行分组及给药,于初次免疫4周后,经沙鼠腹腔接种CVA6病毒液,1×10^(4)TCID_(50)/只,观察沙鼠的存活情况。结果测序结果表明,重组表达质粒pET-28a-CRM197A-CVA6 VP1构建正确。重组蛋白CRM197A-CVA6 VP1的粒径为81.16 nm,电位为23.12 mV,280 nm激发光下检测到最大发射波长为353 nm,纯度达88.3%。试验组及对照组沙鼠血清中结合抗体效价的几何平均数分别为44565和0,中和抗体效价的几何平均数分别为30.4和0,两组间结合抗体效价和中和抗体效价的几何平均数差异均有统计学意义(P均<0.05)。对照组沙鼠于攻毒后第3天开始出现死亡,第13天全部死亡;试验组沙鼠在攻毒过程中未发现死亡,保护率达100%。结论原核表达的重组蛋白CRM197A-CVA6 VP1在沙鼠体内可产生良好的免疫原性。

CRM9与兔抗人IgG连接方法探讨

目的:用直接偶联法构建新型蛋白兔抗人IgGCRM9.方法:分别应用异型双功能连接剂(m Maleimido benzoyl N hydoxysuccinimideester,MBS)和N琥珀酰亚胺3(2吡啶二巯基)丙酸盐(SPDP)将兔抗人IgG多抗和白喉毒素突变体(CRM9)进行连接,制备出新的蛋白.结合后的蛋白经SephacrylS300分离纯化,用聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖电泳证明二者的结合情况.采用酶联免疫法检测IgG与CRM9按不同比例反应后所构建的蛋白复合体中抗体部分的活性.结果:用MBS连接剂连接IgG与CRM9后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示出的条带明显滞后于IgG所显示的条带,而在琼脂糖凝胶电泳中IgG与CRM9混合反应的样品所显示的两条条带均与IgG和CRM9单独所在的条带一致.酶联免疫实验测得的各组A450nm值表明,IgG与CRM9按1∶1和1∶3两种比例制备的样品对抗体活性影响最小,而按1∶5和1∶两种比例制备的蛋白,抗体活性受到很大的抑制.结论:兔抗人IgG与CRM9可以通过MBS结合,二者在1∶1～1∶3之间的比例时,可以有较好的连接,而且对抗体活性的影响最小.SP DP则不适用于本实验中的两种蛋白的连接.这将为免疫毒素的新型连接提供有效的方法.

两种ACYW135群脑膜炎球菌多糖-CRM197结合疫苗的制备及质量与免疫原性分析

目的 对比2种结合方式的以白喉毒素无毒突变体197(cross-reacting material 197,CRM197)蛋白为载体制备的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗的质量与免疫原性。方法 方法一以CRM197蛋白羧基为结合位点,用1-氰基-4-(二甲氨基)吡啶四氟硼酸盐(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate, CDAP)分别将A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖羟基活化为氰基,以己二酸二酰肼(adipic acid dihydrazide, ADH)作为连接剂,最后通过4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐[4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl morpholinium chloride, DMTMM]与CRM197反应得到单价结合物;方法二用CRM197蛋白氨基为结合位点,用高碘酸钠分别氧化A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖羟基为醛基,加入CRM197蛋白生成席夫碱,最后通过氰基硼氢化纳还原,得到单价结合物。对2种结合方式制备的结合物原液进行理化检测,合格后再分别将2种路线的单价结合物按比例与冻干辅料混合后经冻干制成2种ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗(ACYW135-CRM197),分别免疫NIH小鼠后,用ELISA检测小鼠血清中抗体并进行统计学分析。结果 2种结合方式制备的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗,游离多糖含量均<20.00%,K_D值在0.2以前的洗脱液多糖回收率均>80.00%,但以CRM197蛋白羧基为结合位点的ACYW135群脑膜炎球菌单价结合物原液中游离多糖含量(3.20%~11.50%)均低于以氨基为结合位点的相应结合物原液中的游离多糖(8.35%~17.42%);疫苗成品的平均相对分子质量,以CRM197蛋白羧基为结合位点的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗更大。2种结合疫苗免疫小鼠后其体内产生的抗体经检定后统计分析,A群、C群多糖免疫原性差异均无统计学意义(P=0.080,P=0.176),W群、Y群多糖免疫原性差异均有统计学意义(P=0.015,P=0.027)。结论 以CRM197蛋白载体羧基为结合位点的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗在质量和免疫原性方面均不差于传统的以CRM197蛋白载体氨基为结合位点的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗。

大肠杆菌表达CRM_(197)及其在通用流感疫苗中的应用

利用基因工程技术在大肠杆菌BL21(DE3)中表达白喉毒素无毒突变体CRM_(197),经变性条件下亲和纯化后,作为蛋白载体与流感抗原M2e经BMPH偶联,制备CRM_(197)-M2e结合物,用其免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA法测定血清中M2e特异性IgG抗体.结果表明,重组CRM_(197)在大肠杆菌中成功表达,优化后蛋白表达量约为250±30 mg/L,纯度达95%以上;所制CRM_(197)-M2e结合物可有效免疫BALB/c小鼠,其刺激产生的M2e特异性IgG抗体滴度分别是健康组、M2e免疫对照组、CRM_(197)免疫对照组及CRM_(197)+M2e混合组的430.5,32,181和215倍.