生物转化法制备白头翁皂苷A3

利用微生物酶法转化白头翁总皂苷,结合硅胶柱层析法和结晶法对酶产物进行分离,制备高活性的稀有白头翁皂苷A3。将1 000g中药白头翁经乙醇浸提3次,再经脱糖、脱色处理后共得总皂苷98.6g,得率为9.86%。采用微生物Absidiasp.P00r发酵产粗酶液,对50g总皂苷进行酶反应,酶解产物经脱糖、脱色处理后,得到含白头翁皂苷A3的粗产物34.2g。通过硅胶柱层析和结晶法对产物进行分离纯化,制备得到白头翁皂苷A3单体1.56g,得率为4.56%,HPLC检测其纯度为95.4%。

白头翁皂苷A3通过抑制巨噬细胞M2型极化增强结肠癌细胞对5-氟尿嘧的化疗敏感性

目的探讨白头翁皂苷A3通过调控巨噬细胞极化对5-氟尿嘧啶(5-FU)化疗敏感性的影响及其作用机制。方法利用白细胞介素(IL)-4和IL^(-1)3诱导巨噬细胞M2极化,采用CCK-8法检测白头翁皂苷A3对巨噬细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测白头翁皂苷A3对巨噬细胞极化表型的影响;采用RT-PCR检测白头翁皂苷A3对巨噬细胞CD206,IL^(-1)0,CCL18,CCL22 mRNA表达的影响。收集M2巨噬细胞及白头翁皂苷A3干预M2巨噬细胞后的上清液作为条件培养基(CM)与5-FU共同作用于结肠癌SW480细胞。采用CCK-8法检测CM干预下5-FU对SW480细胞增殖的影响;采用Annexin-FITC/PI双染法及Western印迹法检测CM干预下5-FU对SW480细胞凋亡及凋亡蛋白Bax、活化的胱天蛋白酶3表达的影响。结果白头翁皂苷A3浓度<100 mg·L^(-1)时对巨噬细胞增殖无抑制作用,故选择50,75和100 mg·L^(-1)作为白头翁皂苷A3实验浓度。白头翁皂苷A3呈浓度依赖性降低CD206的阳性细胞表达比例,显著抑制M2巨噬细胞表面抗原CD206和极化因子IL^(-1)0,CCL18,CCL22 mRNA的表达(P<0.01)。白头翁皂苷A3100 mg·L^(-1)能明显提高了5-FU对SW480细胞的抑制率(P<0.05),同时提高了SW480细胞的凋亡率及促凋亡蛋白Bax和活化的胱天蛋白酶3的表达(P<0.05)。结论白头翁皂苷A3通过抑制巨噬细胞M2极化减弱了M2巨噬细胞对SW480细胞促凋亡蛋白Bax和活化的胱天蛋白酶3的抑制作用,从而降低M2巨噬细胞介导的SW480细胞对5-FU的化疗抵抗,提高了5-FU的化疗敏感性。

白头翁皂苷A3通过M2型巨噬细胞提高人结肠癌SW480细胞对5-FU的化疗敏感性

目的:观察白头翁皂苷A3(A3)通过干预巨噬细胞极化增强人结肠癌SW480细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)化疗的敏感性,并探讨其作用机制。方法:采用CCK8法检测A3对人单核THP-1细胞存活率的影响,确定A3的安全作用浓度;采用佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞分化为M0型巨噬细胞,将M0型巨噬细胞分为M0对照组,M2模型组,A3低、中、高剂量干预组。其中M2模型组给予20μg·L^(-1)IL-4与20μg·L^(-1)IL-13进行造模,A3干预组在造模的同时给予低、中、高剂量(50,75,100 mg·L^(-1))A3进行干预。采用流式细胞术检测M2型巨噬细胞表面抗原CD206的表达;采用RT-PCR法检测M2型巨噬细胞极化因子CD206、IL-10、CCL22、CCL18 mRNA的表达;采用Western blot法检测细胞内p-STAT6、CD206、IL-10、CCL22蛋白的表达。A3干预巨噬细胞M2型极化后的细胞上清液作为条件培养基用于考察SW480细胞对5-FU的化疗敏感性,采用CCK8法检测SW480细胞的存活率;采用Annexin-FITC/PI双染法及Western blot法检测SW480细胞凋亡水平,以及Bax、Cleaved Caspase-3蛋白的表达。结果:A3在50,75,100 mg·L^(-1)浓度时对THP-1细胞存活率没有显著影响。A3呈剂量依赖性减少CD206阳性细胞表达比例,下调p-STAT6、CD206、IL-10、CCL22、CCL18基因与蛋白的表达(P<0.05,P<0.01)。A3干预巨噬细胞M2型极化后的条件培养基显著提高了SW480细胞对5-FU的敏感性,表现为SW480细胞的存活率下降、凋亡率升高,以及促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3表达上调(P<0.05)。结论:A3能够减弱M2型巨噬细胞对SW480细胞凋亡的抑制作用从而提高SW480细胞对5-FU的化疗敏感性,作用机制可能与A3调控STAT6信号通路抑制巨噬细胞M2型极化有关。

HPLC-MS法同时测定白蒲黄片中7种五环三萜皂苷类化学成分

目的：建立同时测定白蒲黄片中7种五环三萜皂苷类成分白头翁皂苷A3、白头翁皂苷B4、23-羟基白桦脂酸、白头翁皂苷B、白头翁皂苷C、刺人参苷S和齐墩果酸的HPLC-MS法。方法：采用Diamonsil ODS C18（250 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱,流动相为含0.1%甲酸的水（A）-含0.1%甲酸的甲醇（B）,梯度洗脱程序为25%A（0 min）,5%A（0-6 min）,5%A（6-14min）,25%A（保持6 min）,流速0.8 m L·min-1,柱温30℃,进样量10μL;采用正离子和负离子模式同时监测,正离子和负离子监测模式下源喷射电压分别为5.5 k V和-4.5 k V,离子源温度为650℃,雾化气（Gas 1）344 k Pa,加热气（Gas 2）412 k Pa,接口持续加热,帘气172 k Pa,全程氮气通入状态。结果：在14 min内白蒲黄片中7种有效成分白头翁皂苷A3、白头翁皂苷B4、23-羟基白桦脂酸、白头翁皂苷B、白头翁皂苷C、刺人参苷S和齐墩果酸被完全分离;峰面积与其浓度呈良好的线性;平均回收率范围为95.11%-107.3%,RSD为0.86%-3.26%。结论：本文建立的方法经验证简便、重现性好、专属性高,可为白蒲黄片质量控制提供参考。