斑节对虾白斑综合症杆状病毒(WSSV)感染的组织特异性

应用光镜和电镜研究斑节对虾白斑综合症杆状病毒 ( WSSV)感染的组织特异性 ,结果证实 WSSV组织特异性差 ,感染外胚层和中胚层来源的各种组织细胞的细胞核 ,如甲壳表皮细胞、鳃上皮细胞、神经细胞、造血组织细胞、胃上皮细胞、心肌细胞及其随体细胞、触角腺上皮细胞、胃和消化管的肌细胞和结缔组织细胞等 ,以甲壳表皮细胞、胃上皮细胞、结缔组织细胞和造血组织细胞最为显著 ,细胞解体环死 .电镜观察对虾中肠和肝胰细胞未发现病毒粒子 .

白斑综合症杆状病毒的感染途径和宿主种类

利用生物检测、ＰＣＲ、组织病理和电镜技术，通过投喂和浸泡感染方式，结果表明口和消化道是斑节对虾感染白斑综合症杆状病毒（ＷＳＢＶ）的主要途径；宿主经口摄食携带ＷＳＢＶ媒介生物是ＷＳＢＶ传播的主要途径；确定了２１种较大型的ＷＳＢＶ宿主种类，其中以虾蟹为主；

白斑综合症杆状病毒(WSBV)PCR检测方法的改进及应用

斑节对虾Penaeusmonodon白斑综合症是由白斑综合症杆状病毒 (WSBV)所致。患有典型白斑综合症的斑节对虾 ,用两种提取病毒模板DNA的方法 ,进行PCR扩增 :一种是用传统的方法 ,即蛋白酶K ,CTAB等消化 ,酚 /氯仿抽提 ,乙醇沉淀得到DNA ;另一种是用改进的煮沸法提取病毒DNA。对比发现后一种方法稳定性及敏感性比前者高 ,重复性好。用后一种方法对病虾的复眼进行检测 ,PCR结果为阳性。应用后一种方法还对病虾的各组织器官及人工感染的虾进行检测 ,发现病虾中除肝胰腺外 ,附肢、肌肉、心脏、鳃、胃、中肠、神经、复眼、表皮结果均为阳性。感染实验中 ,出现阳性结果注射感染比投喂感染早 ,而且肌肉和附肢较敏感。

白斑综合症杆状病毒致病性特征

对白斑综合症杆状病毒（ＷＳＢＶ）致病性特征的研究结果表明：ＷＳＢＶ的致病性与斑节对虾Ｐｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎ个体大小无关，ＷＳＢＶ的致病力与感染方式和病毒数量有关；在盐度为１４、温度为２８－３２℃的海水中，游离ＷＳＢＶ在４ｈ内失去感染活性；体长７ｃｍ的白斑综合症死亡斑节对虾，其携带的ＷＳＢＶ在５７ｈ失去感染活性；体长７ｃｍ死亡斑节对虾经２８℃空气干燥，其携带的ＷＳＢＶ在５０ｈ失去感染活性；ＷＳＢＶ不能通过体表感染健康斑节对虾，而斑节对虾摄食一定数量病毒才能导致感染；水不能作为游离ＷＳＢＶ的载体传播ＷＳＢＶ。

温度对白斑综合症杆状病毒致病力的影响

当患有白斑综合症的病虾肉在水温 5 5℃以上浸泡 15min后 ,白斑综合症杆状病毒 (WSBV)失活不能感染斑节对虾 ;患有白斑综合症的病虾肉在 - 2 0℃的冰箱保存 6 0d后 ,WSBV仍然具有致病力 ;用患有白斑综合症的病虾肉投喂日本对虾和脊尾白虾时 ,养殖水温越低 ,死亡率也越低 ;病厚蟹肉在水温 2 6～ 30℃的海水中浸泡81.5h后 ,WSBV不能感染斑节对虾 .

白斑综合症杆状病毒对对虾和罗氏沼虾致病性的研究

对比研究白斑综合症杆状病毒对斑节对虾、日本对虾、南美白对虾和罗氏沼虾的致病性 ,其生产养殖结果表明 :第一次在廉江龙营围虾场养殖的南美白对虾 ,在养殖了 2 7天以后开始爆发白斑综合症病毒病 ,患病的南美白对虾、斑节对虾、日本对虾病症相同 ,其甲壳特别是头胸壳具有白色斑点 .养殖的罗氏沼虾没有出现病症 .人工感染实验结果表明 :白斑综合症杆状病毒能引起南美白对虾 90 %左右的死亡率 ,引起罗氏沼虾大约 5 0 %的死亡率 .电镜观察结果表明 :这三种对虾感染的病毒都是白斑综合症杆状病毒 .

对虾白斑综合症杆状病毒越冬宿主的研究

实验结果表明:在冬季即将放水干枯的虾塘中,携带WSBV的厚蟹可达15%,其中有88.9%的病蟹能活至翌年春天,并引起新的白斑综合症爆发。用患白斑综合症的斑节对虾投喂厚蟹和虎头蟹,只能引起40%的死亡率。用发病虾塘的幼厚蟹投喂斑节对虾,在6d内引起死亡率达73.9%,死亡的斑节对虾具有典型的白斑综合症病征。根据研究的结果,我们认为厚蟹是WSBV的越冬宿主。

白斑综合症杆状病毒在养殖万氏对虾(Penaeus vannamei)中暴发流行和人工感染研究

白斑综合症杆状病毒(White spot syndrome baculovirus,WSBV)对万氏对虾有较强的致病力,在病虾被感染的2～3d内,就可以使万氏对虾死亡率达83.3%～90%.WSBV对万氏对虾的鳃上皮细胞、甲壳下表皮细胞、胃上皮组织细胞、肌细胞、结缔组织细胞和中肠基底膜下肌细胞以及结缔组织细胞敏感.在细胞质中的完整杆状病毒粒子大小为(129～164)nm×(365～412)nm,在细胞核中的完整杆状病毒粒子大小约为(135～176)nm×(429～480)nm.万氏对虾对WSBV没有明显的抗病性,60d养殖死亡率达90%.

斑节对虾白斑综合症杆状病毒致病性及组织细胞特异性研究

班节对虾白斑综合症杆状病毒（Whitespotsyndromebaculoviruses，WSSBV）感染胃上皮细胞，胃环肌和纵肌细胞，海绵结缔组织细胞；鳃下皮细胞；触角腺分泌型和非分泌型上皮细胞，触角腺体胶囊上皮细胞；造血组织细胞；心脏心肌细胞，随体细胞，结统组织细胞；神经系统胶质细胞，神经膜细胞，神经细胞和球形细胞；甲壳表皮细胞、肌细胞．WSSBV对中肠和中肠育囊上皮细胞，肝胰腺上皮细胞，雄性生殖系统精原细胞，输精管上皮细胞等不敏感．人工肌注感染，WSBV有3d内可致斑节对虾90％，甚至100％死亡．感染斑节对虾鳃经电镜观察发现了3种杆状病毒，2种为无包涵体细胞核杆状病毒，其中一种大小为（119～136）um×（289～306）um，核农壳（98～105）nm×（265～272）um，另一种大小为（101～112）um×（391～420）um，核衣壳（78～85）nm×（276～298）um；1种为细胞质杆状病毒，大小为（102～112）nm×（326～340）um，核衣壳（71～78）nm×（306～308）um．

斑节对虾白斑综合症杆状病毒(WSBV)的形态和感染的组织病理研究

应用光镜和电镜研究斑节对虾白斑综合症杆状病毒（ ＷＳＢＶ） 的形态和感染的组织病理，结果证实ＷＳＢＶ 感染的细胞解体坏死．电镜观察对虾肝胰腺细胞未发现病毒粒子，而鳃上皮细胞和甲壳表皮细胞感染３ 种杆状病毒，分别称之为细胞质杆状病毒，细胞核Ⅰ型杆状病毒，细胞核Ⅱ型杆状病毒，病毒粒子大小分别为（１０２ ～１１２） ｎｍ ×（３０８ ～３２６）ｎｍ ，（９８ ～１０５） ｎｍ ×（２６５ ～２７５） ｎｍ ，（１０１ ～１１２） ｎｍ ×（３９１ ～４２０） ｎｍ ．病毒不形成包含体．负染后病毒粒子还可见细端有一乳头状结构，大小约４０ ～５０ ｎｍ ，后带有一宽约１８ ｎｍ 、长约３４０ ｎｍ 的尾．

斑节对虾白斑综合症杆状病毒检测方法及其应用

对白斑和红体带白斑斑节对虾光镜和电镜观察，对虾白斑综合症杆状病毒（WSBV）感染外胚层和中胚层组织器官．应用WSBVPCR检测技术证实一种WSBV感染鳃、甲壳表皮、神经和肌肉，在肝胰腺、消化管（含胃）、心脏和血液中未检测到，其结果与组织学观察有出入．PCR检测WSBV最佳取材部位是对虾甲壳表皮和肌肉．PCR方法可应用于WSBV的提纯，实验用健康虾的筛选，实验感染WSBV的跟踪，以及流行病学研究．通过PCR方法和电镜观察结合证实红体病斑节对虾（不带白斑者）不是WSBV所致，修正了前人的观点．

白斑综合症病毒(WSSV)的实验室检测技术

主要依据90年代关于对虾病毒病的资料,就病原学检测、血清学检测以及基因组检测技术在WSSV感染检测的应用进行了比较系统的综述。

对虾白斑综合征杆状病毒同源性比较的研究

比较我国沿海不同海域对虾白斑综合征杆状病毒三个分离株 :即唐海分离株 (渤海湾 ) ,宁波分离株 (东海 ) ,深圳分离株 (南海 )的同源性。三个WSSV分离株基因组的限制性内切酶 (SacI ,HindIII,PstI)酶切多态 (RFLP)以及病毒结构蛋白图谱完全一致 ,证实造成我国从南至北对虾爆发性流行病的对虾白斑杆状病毒为同一种病毒。利用高保真Taq酶 ,分别以报道的日本对虾杆状病毒 (RV -PJ =PRDV) ,斑节对虾白斑综合征杆状病毒 (WSBV =PmNOBIII)基因组核酸片段特异性引物进行PCR扩增 ,结果均能从中国对虾白斑杆状病毒 (WSSV)基因组中扩增得到相应大小的PCR产物 ,扩增产物序列分析表明中国对虾白斑杆状病毒 (WSSV)与斑节对虾白斑综合征杆状病毒 (WSBV =PmNOBIII) ,日本对虾杆状病毒 (RV -PJ =PRDV)同源率分别为 10 0 %与 97% 。

白斑综合症病毒基因组同源重复区结合蛋白WSSV021的鉴定

利用噬菌体展示技术,发现wssv021是与病毒基因组同源重复区中一个包含高度保守结构域的小重复片断DNA结合的蛋白质的编码基因,可能参与病毒复制或调控.时相转录分析发现,wssv021属于病毒感染的早期基因.将wssv021基因克隆到pQE-30表达载体,在E.coliXL1-Blue中进行融合表达.凝胶阻滞分析显示,体外表达的(His)6-WSSV021蛋白可以和同源重复区中小重复片断DNA特异性相互作用.

白斑综合症病毒(WSSV)感染对虾的途径及滴度研究

本研究利用荧光定量PCR技术,开展了白斑综合征病毒(WSSV)感染途径及染病最低病毒浓度的研究.用病毒分别感染对虾的口腔、鳃、背部甲壳和腹部软壳24 h后,利用qPCR测定血液中的病毒拷贝数,结果显示病毒主要通过口腔和鳃入侵宿主,并通过血液循环进行全身感染,但病毒不能穿过对虾的体表引起感染.此外,将对虾分别放在含不同病毒粒子浓度(101、102、103、104、105个/dm3)或含核衣壳的海水中培养,发现当海水中病毒粒子浓度低于102个/dm3时,对虾没有感染病毒,当浓度达到103个/dm3以上时能引起对虾感染.结果暗示103个/dm3是引起对虾感染的最低病毒粒子浓度,而核衣壳则不具有感染性.

一种抗对虾白斑综合症病毒(WSSV)线性抗原表位单链抗体的筛选

对虾白斑综合症病毒(WSSV)是全世界对虾养殖业最主要的病原体之一,虽然对该病毒的研究已较为深入,但目前仍无有效的防治方法。本研究应用噬菌体展示技术,构建了抗变性WSSV的单链抗体噬菌体展示文库,分别以WSSV病毒粒子和原核表达的囊膜蛋白VP28为靶分子对该文库进行淘选。经过数轮淘选后,得到5个能特异识别WSSV的单链抗体,且首次获得了能特异识别WSSV线性抗原表位的单链抗体P75E8。并通过免疫胶体金电镜分析,对5种单链抗体对应在病毒粒子上的表位进行了定位。为获取识别多种WSSV抗原的抗体提供了新的方法路线,也为获取特异性识别线性表位的单链抗体提供了一种新的淘选技巧。

罗氏沼虾白斑综合症病毒WSSV ORF147片段的克隆、表达与序列分析

白斑综合症病毒WSSV（White Spot Syndrome Virus），是严重危害虾类养殖业的主要病原之一。本实验根据已知南美白对虾WSSV ORF147序列设计1对特异性引物，从患疑似白斑病毒病的罗氏沼虾中提取总DNA，用PCR法扩增得到1特异性片段。将该片段克隆进pET-28a（＋）载体，测序表明该片段全长1475bp．最大开放式阅读框为1380bp，编码459个氨基酸，预计其相对分子质量为51．9kDa；与GenBank登录的WSSV ORF147序列（登录号AF369029）进行比对，核苷酸同源性为99％，证实为WSSV ORF147片段。将该片段在大肠杆菌Ecoli中进行表达，能获得相应的特异多肽条带。根据测序结果推导WSSV ORF147多肽在N端有信号肽序列，并且在氨基酸序列的122～144区间形成跨膜螺旋区。

对感染白斑综合症病毒的亲虾子代的跟踪检测

感染白斑综合症病毒 (whitespotsyndromevirus,WSSV)的斑节对虾Penaeusmonodon亲虾能产出携带WSSV的卵子 ,这些卵子可完成胚胎发育过程、孵化出无节幼体 ,并可以培育出状幼体、糠虾幼体和仔虾。在确认只有亲虾作为WSSV传染源的情况下 ,培育出的部分幼体和部分仔虾携带WSSV ;在相同的条件下 ,不带WSSV的亲虾产出的卵及幼体、仔虾未检测到WSSV。

对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP28的表达及其抗病毒感染作用

根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因vp28的序列,设计并合成引物,PCR扩增得到vp28基因,成功构建重组表达载体pET22b-vp28并转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程菌株37℃IPTG诱导,表达产物经Western-blot和SDS-PAGE检测显示有与预期大小32kDa相符合的目的蛋白。用Ni2+-柱纯化的目的蛋白分别直接注射螯虾和包被饲料投喂螯虾,实验结果表明vp28在大肠杆菌中的表达产物有显著提高虾体抗WSSV感染力的作用,而且注射效果更好。

不同温度下哈维氏弧菌和白斑综合症病毒对凡纳滨对虾的致病性

在不同温度[(19±1)、(25±1)、(31±1)℃]条件下,研究了不同浓度哈维氏弧菌Vibrio harveyi和白斑综合症病毒(WSSV)对凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei(体长8.12 cm±0.83 cm)的致病性。结果表明:温度为(19±1)℃时,整个试验过程中对虾死亡率均低于8.9%,各组病毒携带量低于3.9×104copy/g;温度为(25±1)℃时,病毒单独感染组对虾的死亡率和病毒携带量(最大值71.1%,1.9×105copy/g)和高浓度继发感染组的死亡率和病毒携带量(最大值77.8%,3.2×106copy/g)从试验中期开始明显高于其他组,死亡加快,病毒携带量迅速增加,单独感染细菌组死亡率随感染浓度的升高而升高(最大值为21.1%);温度为(31±1)℃时,病毒单独感染组的死亡率和病毒携带量(最大值47.8%,2.2×104copy/g)从试验中期开始明显低于继发感染组(最大值80.0%,6.1×106copy/g),单独感染细菌组的累积死亡率随细菌浓度的升高而升高(最大值24.4%)。研究表明,温度对WSSV和哈维氏弧菌的致病力影响显著,继发感染和细菌单独感染随温度的升高致病力升高,高温和低温对WSSV的致病力有抑制作用。