白细胞弹性蛋白酶抑制剂筛选模型的建立及抑制剂F02ZA-2554A的研究

利用人源的白细胞弹性蛋白酶建立了一种快速、微量、灵敏的高通量体外筛选方法。利用该模型从微生物菌种库菌株的次生代谢产物中筛选得到一阳性真菌F02ZA-2554。该菌株发酵液经有机溶剂提取、硅胶柱层析、及HPLC ODS反相柱层析等活性跟踪下的分离纯化,得到活性化合物F02ZA-2554 A,该化合物对白细胞弹性蛋白酶有中等强度的抑制活性,其IC50为32.4μmol/L。通过对该化合物的紫外、质谱、核磁等理化分析,确定该化合物为蒽醌类化合物中的大黄素甲醚(physcion),该化合物的抗炎活性属首次报道。

多核白细胞弹性蛋白酶对人角膜基质细胞MMP-1、MMP-3表达的影响

目的探讨多核白细胞弹性蛋白酶与白细胞介素(IL)-1α对人角膜基质细胞MMP-1、-3表达的影响。方法体外培养人角膜基质细胞,在培养液中添加或不添加多核白细胞弹性蛋白酶或IL-1α,培养5 d,通过免疫印迹分析法测定培养上清中的MMP-1、-3的表达。结果在无任何刺激下人角膜基质细胞不表达MMP-1、-3;添加IL-1α后可诱导前体MMP-1、-3表达,而添加多核白细胞弹性蛋白酶不能诱导MMP-1、-3的表达;多核白细胞弹性蛋白酶可激活在IL-1α诱导下产生的前体MMP-1、-3转化为活化形式的MMP-1、-3。结论多核白细胞弹性蛋白酶和IL-1α可协同诱导角膜基质细胞的胶原降解,诱发角膜溃疡的发生。

慢性阻塞性肺病及吸烟人群血清MMP-9、NGAL、MMP-9/NGAL前体及中性白细胞弹性蛋白酶水平变化

目的确定吸烟情况对慢性阻塞性肺病(慢阻肺)患者血清基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、中性粒细胞明胶酶蛋白(NGAL)、MMP-9/NGAL前体及中性白细胞弹性蛋白酶(NE)水平的影响。方法在80名慢性阻塞性肺病患者(65名吸烟者,15名不吸烟者)和35名健康成年人(26名吸烟者,7名不吸烟者)中收集血清样本,随后进行ELISA测定血清样本中研究因子的水平。结果在患有慢阻肺的吸烟者中,MMP-9、NGAL和MMP-9/NGAL水平明显升高。此外,患有慢阻肺的吸烟者与健康的吸烟者相比,NE和MMP-3水平显著增高。结论 MMP-9、NGAL、MMP-9/NGAL和NE的血清水平能够反应与吸烟有关的慢阻肺患者的全身炎症状态。

多核白细胞弹性蛋白酶在白细胞介素-1诱导下对角膜基质细胞胶原降解的作用

目的观察多核白细胞弹性蛋白酶及白细胞介素-1α(Interleukin-1α,IL-1α)对人角膜基质细胞胶原降解作用的影响,探讨角膜溃疡的发生机理。方法角膜基质细胞三维胶原凝胶模型表面添加含多核白细胞弹性蛋白酶及IL-1α的MEM液,培养5天,通过测定培养液中的羟脯氨酸(HYP)的量作为胶原降解活性单位。结果多核白细胞弹性蛋白酶直接降解I型胶原,但对角膜基质细胞胶原降解无明显影响,同时添加弹性蛋白酶和IL-1α,明显增加角膜基质细胞胶原降解。结论多核白细胞弹性蛋白酶和IL-1α协同作用促进角膜基质细胞胶原降解,可能在角膜溃疡的发生过程中起着重要的作用。

人白细胞弹性蛋白酶抑制剂体外筛选模型的建立及优化

目的探讨人白细胞弹性蛋白酶(HLE)与其底物反应的最适条件,建立一种高通量的HLE抑制剂体外筛选模型。方法通过测定反应产物———对硝基苯胺(p-NA)的光密度值,研究电解质浓度、反应温度、反应体系pH值、酶和底物作用浓度、反应时间及检测波长等对酶促反应的影响程度,确定酶与底物反应的最佳条件。结果确定的最优反应条件为:HLE(0.2 U/ml)30μl,底物(50 mmol/L)100μl,含1.0 mol/L NaCl的Tris缓冲液(pH 7.5),反应温度37℃,反应时间24 h,检测波长为545 nm。结论建立了一种稳定的HLE抑制剂体外筛选模型,该模型灵敏度高、准确性和重复性强,可用作筛选HLE抑制剂的平台。

微生物来源的人白细胞弹性蛋白酶抑制剂N01 WA-735E

应用白细胞弹性蛋白酶抑制剂高通量的筛选模型对3 835株放线菌进行筛选,发现了阳性菌株N01WA-735.采用有机溶剂提取、硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱和结晶等方法对该菌株的发酵产物进行了分离纯化,得到了活性单体化合物N01WA-735E,它对人白细胞弹性蛋白酶具有较强的抑制活性,其IC50为11.5μmol/L.通过对N01WA-735E的理化性质和波谱数据进行分析,确定其结构与文献报道的化合物BE-52440A相同,该化合物对白细胞弹性蛋白酶的抑制活性尚未见报道.

多核白细胞弹性蛋白酶对人角膜基质细胞MMP-2、MMP-9表达的影响

目的观察多核白细胞弹性蛋白酶与白细胞介素-1α对人角膜基质细胞表达的MMP-2、MMP-9的影响,进而探讨角膜溃疡的发生机理。方法体外培养人角膜基质细胞,在培养液中添加或不添加多核白细胞弹性蛋白酶或白细胞介素-1α,培养5天,通过明胶酶谱分析的方法测定培养上清中的MMP-2和MMP-9的表达。结果体外培养的人角膜基质细胞无任何刺激下可释放MMP-2;白细胞介素-1α可加强并激活MMP-2的表达,同时可诱导MMP-9前体的释放;多核白细胞弹性蛋白酶在白细胞介素-1α诱导下可完全激活前体MMP-9转化为活化形式。结论多核白细胞弹性蛋白酶和白细胞介素-1α协同作用参与角膜溃疡的发生。

微生物来源的人白细胞弹性蛋白酶抑制剂F01-221A的研究

应用白细胞弹性蛋白酶抑制剂高通量的筛选模型对数千株真菌进行筛选,发现了阳性菌株F01-221。对该菌株的发酵产物进行有机溶剂提取、硅胶柱色谱、SephadexLH-20柱色谱和ODSHPLC制备等分离纯化,得到单体活性化合物F01-221A,它对人白细胞弹性蛋白酶有较强的抑制活性,其IC50为22.1μmol/L。通过对F01-221A的紫外、质谱、核磁等理化数据分析,确定其与化合物equisetin同质。

脓毒症患者外周血白细胞弹性蛋白酶及单核细胞表面脂多糖受体在CBP治疗下的变化趋势及相关性研究

目的探讨连续性血液净化(continuous blood purification,CBP)治疗对脓毒症患者外周血白细胞弹性蛋白酶(HLE)及单核细胞表面脂多糖受体(mCD14)的影响及两者变化是否存在相关性。方法前瞻性病例对照研究分析2015年6月—2017年12月绍兴市人民医院收治的60例严重脓毒症患者,根据是否同意接受连续性血液净化治疗,将患者分为CBP组(30例)及对照组(30例)。在2组患者治疗过程的0、12、24、48、72 h时,留取外周血标本,采用ELISA法检测HLE表达量的变化,流式细胞术检测其mCD14水平变化,Pearson分析对CBP组HLE水平及mCD14表达量变化进行相关性分析。结果治疗后12、24、48、72 h时,2组患者HLE水平均较治疗前下调(均P<0.001),CBP组下调幅度明显大于对照组。治疗后12、24、48、72 h时,2组患者mCD14水平均较治疗前上调(均P<0.001),CBP组上调幅度明显大于对照组。CBP组HLE水平与mCD14表达量呈负相关(r=-0.644,P<0.001)。结论CBP治疗可以通过清除脓毒症患者外周血炎症因子、促炎介质等,直接或间接降低HLE水平,减轻其对单核细胞mCD14表达的影响,从而使患者机体免疫功能得到一定恢复,这也许是CBP参与重建机体免疫内稳状态的机制之一。

中性白细胞弹性蛋白酶与白血病

中性白细胞弹性蛋白酶（NE）是中性白细胞分泌的一种重要细胞毒性分子，与人类白血病的发生密切相关。它能分解早幼粒细胞白血病（PML）-维甲酸受体α（RARα）融合蛋白，增强PML-RARα致自血病的作用，在急性早幼粒细胞白血病发病机制中占有重要地位；另外，它也能通过降低生长因子对正常血细胞生成的有效性，从而促进慢性髓细胞性自血病的克隆优势。

白细胞弹性蛋白酶抑制剂

人白细胞弹性蛋白酶广泛参与体内的组织损伤反应,与炎症反应、自身免疫、肿瘤形成和转移等有密切关系。目前人白细胞弹性蛋白酶抑制剂已成为新药开发的热点,具有很高的应用价值,其中西维来司钠已经成功进入市场。本文对近几年发现的人白细胞弹性蛋白酶抑制剂的结构及其作用进行综述。

中性粒细胞弹性蛋白酶在慢性阻塞性肺疾病发病中的作用

目的:探讨中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)在慢性阻塞性肺病(COPD)发病中的作用及其相互关系。方法:收集COPD患者104例,其中急性发作期(发作组)53例、稳定期(稳定组)51例;健康查体者(对照组)50例,测定并比较3组血常规和血清NE、α1-AT含量及肺功能指标。结果:3组白细胞(WBC)、中性粒细胞比例(GRA)及NE差别均有统计学意义(P<0.01),均是发作组>稳定组>对照组,发作组与稳定组的α1-AT差别无统计学意义。COPD患者血清α1-AT与NE水平呈正相关(r=0.416,t=3.861,P<0.01)。COPD稳定期患者血清α1-AT水平与残气量/肺总量(36.49±7.23)%呈负相关(r=-0.508,t=4.212,P<0.01),而与第1秒用力呼气容积占预计值的百分比(68.63±10.39)%无明显相关性(r=0.268,t=1.987,P>0.05)。结论:COPD急性发作期NE水平升高、α1-AT水平相对不足是造成肺部炎症的重要原因。

中性粒细胞弹性蛋白酶、髓过氧化物酶在大鼠哮喘中的变化及意义

目的:观察中性粒细胞(PMN)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和髓过氧化物酶(MPO)在大鼠哮喘中的表达水平变化及意义。方法:18只大鼠被随机平均分成2组:哮喘组、正常对照组,以卵清白蛋白(OVA)致敏激发法复制大鼠哮喘模型,对血PMN进行分离纯化,免疫组化和比色法检测MPO的表达水平,ELISA法测定NE的蛋白浓度。结果:(1)免疫组化法显示哮喘组血PMN和支气管壁中MPO的表达水平均显著高于对照组(P<0.01),比色法显示哮喘组支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织中MPO的活性显著高于对照组(P<0.05,P<0.01);(2)哮喘组PMN和BALF中NE蛋白浓度显著高于对照组(P<0.01);(3)哮喘组BALF、支气管壁、肺组织中PMN的计数均显著高于对照组(P<0.01)。结论:PMN计数、NE和MPO的表达水平在此实验性哮喘中增加,PMN可能通过分泌NE、MPO参与哮喘炎症过程。

Ezrin介导中性粒细胞弹性蛋白酶诱导的人气道上皮细胞株分泌黏蛋白增加

目的探讨膜连接蛋白Ezrin在中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)诱导气道黏液高分泌的作用及相关调节机制。方法以中性粒细胞弹性蛋白酶刺激培养的人气道上皮HBE16细胞,ELISA法、real-time PCR法测定黏蛋白(MUC)5AC的蛋白及mRNA水平。免疫荧光法检测Ezrin蛋白含量。结果 NE刺激30 min后MUC5AC mRNA表达增强,细胞中及培养上清中黏蛋白MUC5AC的含量均显著高于对照组(P<0.01);转染Ezrin永久磷酸化载体pEGFPN1-Ezrin-T567D的细胞经NE刺激后,胞质内磷酸化Ezrin表达明显增强,且胞膜分布增多。同时,细胞培养上清液中的MUC5AC蛋白含量亦显著高于单纯NE组(P<0.01)。遏制Ezrin磷酸化pEGFP-N1-Ezrin-T567A载体转染组在NE刺激后,Ezrin蛋白与pEGFP-N1-Ezrin-T567D组相比有明显减少,且未出现向胞膜聚集的趋势,同时分泌至培养上清的MUC5AC蛋白也有明显减少(P<0.01),同时伴随胞质内MUC5AC蛋白有所增加(P<0.05)。结论 Ezrin蛋白参与了NE诱导的MUC5AC蛋白分泌,是气道上皮细胞MUC5AC分泌的重要调控分子。

MAPK1/ERK2通过SRF调控中性粒细胞弹性蛋白酶分泌在子痫前期发病中的研究进展

子痫前期是一种累及全身多脏器的妊娠期特发性疾病,是导致孕产妇及围生儿死亡的主要原因。发病机制包括过度氧化应激、炎症免疫过度激活、内皮细胞功能障碍等,其中中性粒细胞过度活化释放弹性蛋白酶,导致血管内皮细胞损伤是关键环节。研究发现子痫前期患者中性粒细胞中丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)及中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)水平显著升高。血清反应因子(SRF)是MAPK1途径下游靶蛋白,使活化的中性粒细胞黏附和迁移,导致内皮细胞损伤。MAPK1可能通过调控SRF从而导致中性粒细胞过度活化释放NE从而参与子痫前期的发病。本文将对MAPK1通过SRF调控NE分泌的相关作用机制进行综述。

不同牙周状况下唾液和龈沟液中弹性蛋白酶的含量

目的:比较不同牙周状况者唾液和龈沟液(gingival crevicular fluild,GCF)中的中性多形核粒细胞弹性蛋白酶(granulocyte elastase,EA)含量,并分析唾液与龈沟液EA水平的相关性。方法:采用底物法对牙周健康者(17例)、牙龈炎患者(14例)、慢性牙周炎(chronic periodontitis,CP)患者(24例)和侵袭性牙周炎(aggressive pe-riodontitis,AgP)患者(24例)的唾液和/或龈沟液样本中的EA含量进行测定分析。结果:AgP患者龈沟液EA水平高于CP患者(0.485 3±0.225 0 vs.0.288 4±0.193 1,P<0.01);牙周炎患者(AgP和CP)唾液EA水平高于牙周健康者和牙龈炎患者(0.844 5±0.660 6,0.637 3±0.648 9 vs.0.012 2±0.005 8,0.031 6±0.020 6;P均<0.001)。牙周炎患者唾液与龈沟液EA水平呈正相关关系(r=0.660)。结论:龈沟液EA的测定对不同类型牙周炎的诊断可起一定的辅助作用,唾液EA水平的测定可用于在人群普查中筛选牙周炎患者及进行全口牙周评估。

全反式维甲酸与弹性蛋白酶对肺组织破坏的干预作用

目的采用胚肺成纤维细胞三维立体培养技术,直接观察全反式维甲酸(RA)和中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)对肺的主要成分之一胶原组织降解的干预作用。方法在胚肺成纤维细胞三维立体培养过程中加入细胞因子〔肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)〕来诱导基质金属蛋白酶(MMPs)的表达,同时加入RA或NE干预MMPs及其组织抑制因子(TIMPs)的表达;用明胶酶谱法测定MMP-2、MMP-9,用Western blotting法测定MMP-1、MMP-3及TIMP-1、TIMP-2,同时在培养5d后测定胶原的含量及面积大小。结果TNF-α和IL-1β诱导在立体胶原内培养的胚肺成纤维细胞产生MMP-1、MMP-3和MMP-9,但是只引起少量胶原降解(P>0.05),同时加入NE,结果导致胶原几乎完全降解(P<0.01)。NE使MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9由非活化的形式转化为分子量较小的活化形式,同时,清除TIMP-1和TIMP-2。RA抑制了MMP-1的表达及MMP-3、MMP-9的活化,并削弱了NE对TIMP-1、TIMP-2的清除作用,进而抑制了胶原的降解。胶原降解后基质发生强烈收缩。结论MMPs可直接降解肺内胶原和其他间质组织,导致肺组织破坏;NE通过活化MMPs引起或加速细胞外基质的破坏;MMPs与NE的协同作用可能是肺气肿等肺组织破坏的机制。RA通过抑制MMPs的表达与活化对抗NE对肺组织的破坏作用。

兔缺血再灌注肺损伤中蛋白酶变化及蛋白酶抑制剂的保护作用

目的观察兔缺血再灌注肺损伤中蛋白酶及细胞因子的表达变化,并探讨蛋白酶抑制剂乌司他丁对缺血再灌注肺损伤的保护作用。方法30只新西兰白兔随机均分为对照组、创伤失血性休克组(休克组)和创伤失血性休克乌司他丁治疗组(治疗组),观察休克前、休克末及复苏后2、4h血清中细胞因子TNF-α、IL-8的动态变化,并于复苏后4h测定肺组织髓过氧化物酶(MPO)及肺泡灌洗液中中性粒细胞弹性蛋白酶(BALF-NE)的活性。结果休克组和治疗组休克末及复苏后2、4h血清TNF-α水平及复苏后4hIL-8水平均明显高于休克前,但治疗组均明显低于休克组(P<0.05)。复苏后4h休克组和治疗组肺组织MPO活性及BALF-NE活性均明显高于对照组,但治疗组明显低于休克组(P<0.05)。结论乌司他丁可降低血清TNF-α、IL-8水平及肺组织MPO、BALF-NE活性,对兔缺血再灌注肺损伤具有一定的保护作用。

烧伤、冲击伤及烧冲复合伤后大鼠早期血清中性粒细胞弹性蛋白酶的变化及意义

目的 探讨中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）在大鼠烧伤、冲击伤与烧冲复合伤后早期血清中浓度的变化及意义.方法 选择雄性SD大鼠176只,随机分为对照（C）组、烫伤（BU）组、冲击伤（BL）组与烧冲复合伤（BB）组.C组不致伤;BU组背部脱毛置人94 ℃水中12 s,致25%体表面积（TBSA）Ⅲ°烫伤;BL组以5 g 8701压缩炸药柱为爆炸源,以左侧胸壁距爆炸源75 cm距离进行爆炸,致中度冲击伤;BB组同BL、BU组伤情先致冲击伤后立即烫伤.伤后24 h内,BU、BB组按照50 ml/kg,腹腔注射乳酸钠林格注射液抗休克治疗,1次/12 h.致伤组分为伤后3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、7 d共7个时相点.测定各时相点支气管肺泡灌洗液（BALF）总蛋白浓度（BCA法）、肺组织含水率（称重法）及血清NE浓度（ELISA法）.结果 各致伤组SD大鼠的BALF总蛋白浓度、肺组织含水率及血清NE浓度伤后各时相点均高于C组（P＜0.01或P＜0.05）,其伤后峰值均出现在2 d以内,尤其是伤后2 d,BU组、BL组及BB组血清NE浓度分别为（319.85±19.50）ng/ml,（467.43±31.64）ng/ml,（626.00±26.38）ng/ml;C组（78.53±25.10）ng/ml.组间比较,总体伤情水平BB组＞BU组及BL组（P＜0.01或P＜0.05）.相关分析表明,伤后3d内,BU组血清NE浓度与BALF总蛋白浓度、肺组织含水率均存在显著正相关（r=0.7910,0.8078,P＜0.05）,BB组血清NE浓度与BALF总蛋白浓度存在显著正相关（r=0.8672,P＜0.05）.结论 NE可能在烧伤、冲击伤,尤其是烧冲复合伤的早期肺损伤中起到了重要作用.

乌司他丁辅助治疗的脓毒症患者HLE、mCD14水平变化及早期检测HLE、mCD14水平对治疗反应性的评估价值

目的:探讨乌司他丁辅助治疗脓毒症时,患者血人白细胞弹性蛋白酶(HLE)、单核细胞表面脂多糖受体(mCD14)水平变化,以及早期检测血HLE、mCD14水平对治疗反应性的评估价值。方法:选取2020—2022年该院脓毒症患者196例,均在经典常规治疗方案基础上加用乌司他丁治疗,根据治疗效果分为反应良好组(38例)、反应差组(158例)。治疗前后检测两组患者血HLE、mCD14水平。通过电子病历系统收集患者资料,根据最邻近匹配法对两组进行1∶1匹配。分析乌司他丁辅助治疗脓毒症患者的治疗反应性影响因素并建立预测模型,通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析早期检测血HLE、mCD14水平对治疗反应性的评估价值。结果:两组患者治疗后的血HLE水平低于治疗前,mCD14水平高于治疗前,差异均有统计学意义(P<0.05)。反应差组患者倾向性评分匹配后的严重程度和治疗前后降钙素原(PCT)水平、C反应蛋白(CRP)水平、HLE水平高于反应良好组,治疗前后mCD14水平低于反应良好组,差异均有统计学意义(P<0.05)。对于乌司他丁辅助治疗脓毒症患者,严重程度和治疗前PCT、CRP、HLE水平是治疗反应性的危险因素,治疗前mCD14水平是治疗反应性的保护因素(P<0.05);建立联合预测模型,P=1/[1+1/exp(0.826×严重程度+0.941×治疗前PCT水平+0.694×治疗前CRP水平+1.112×治疗前HLE水平-0.963×治疗前mCD14水平-3.968)],有较好的校准能力;治疗前HLE、mCD14水平预测治疗反应性的药时曲线下面积(AUC)分别为0.777、0.779,而联合预测模型预测治疗反应性的AUC为0.947,高于HLE、mCD14单独评估的AUC,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:采用乌司他丁辅助治疗脓毒症,患者血HLE水平降低,mCD14水平升高;血HLE水平降低、mCD14水平升高与治疗反应性密切相关,联合检测可进一步提升预测价值。