山西汉族人类白细胞抗原-A B DRB1基因多态性与白血病关联性的研究

本研究采用流式聚合酶链反应-反向序列特异性寡核苷酸探针（PCR-RSSOP，简称流式反向SSO）的方法，对山西省汉族白血病患者的人类白细胞抗原（HLA）-A、B、DRB1 3个等位基因进行了基因分型，探讨这些基因的多态性与白血病的关系。

参照链介导的构象分析策略在人类白细胞抗原-A基因位点分型中的临床应用

目的 建立并稳定人类白细胞抗原 (HLA)分型新策略—参照链介导的构象分析 (RSCA)系统 ;以HLA A位点为靶标 ,鉴定RSCA分型策略的优劣。方法 采用国际RSCA协作组提供的 2 0例标准分型DNA首先确定RSCA系统的稳定性、准确性及可复性。然后分别提取 84例拟进行造血干细胞移植病人及家系成员的外周血DNA ,采用RSCA和序列特异性引物体外基因扩增 (PCR SSP)法平行对照对HLA A基因位点进行分型。结果 对 2 0例标准分型DNA的分型结果显示 ,所获分型结果与国际RSCA协作组的完全一致 ,准确性及重复率均为 10 0 %。在全部 84例移植病人及家系成员标本中 ,有 82 /84例 ( 97.6 %)标本可明确判定结果 ,其中有 33/84例 ( 39%)可直接指定等位基因型别 ;此外 ,还有 2 /84例 ( 2 .4%)标本因PCR扩增结果太弱 ,致使RSCA法未能获得分型结果。随机选择 2 0例移植标本进行RSCA重复性实验表明 ,前后结果完全一致 ,然而在PCR SSP分型中 ,约有 10 %的标本需要重复 1～ 3次方能判定结果。结论 RSCA与PCR SSP分型结果相比 ,具有灵敏、特异、分辨率高、重复性好、可发现变异基因及新的等位基因、高通量和低成本的优点 ,非常适合于对拟进行非血缘异基因造血干细胞移植供 受体进行HLA分型。

中国汉族群体中异基因造血干细胞移植前人类白细胞抗原的高分辨分型

目的:通过对异基因造血干细胞移植无关供受者对的人类白细胞抗原-A,B,DRB1基因的序列分析,探讨中国汉族群体中异基因造血干细胞移植前人类白细胞抗原高分辨分型的必要性。方法:实验于2000-08/2004-03在深圳市血液中心完成。供者和受者114对的血样分别来源中华骨髓库和各移植医院,供者和受者均签署知情同意书。采用聚合酶链式反应-测序分型技术对114对中国汉族无关供受者间的人类白细胞抗原-A,B,DRB1等位基因进行序列分析,观察中国汉族无关供受者对间等位基因水平的配合率、各等位基因家族的配对分布和错配分布规律。某些位点的模棱两可结果,则通过相应位点的高分辨聚合酶链式反应-序列特异性引物分型试剂进行分离并确认最后结果。结果:①高分辨与低分辨分型结果比较:114对无关供受者对中,110对人类白细胞抗原-A,B,DRB1的聚合酶链式反应-测序分型结果与低分辨(等位基因星号后两位数)DNA分型结果相吻合,4对聚合酶链式反应-测序分型结果与低分辨结果不相符。②供受者间人类白细胞抗原-A,B,DRB1高分辨配对分类结果:39%的中国汉族供受者对完全配合,但61%的供受者间存在至少一个等位基因的错配。③供受者间人类白细胞抗原-A,B,DRB1等位基因家族配对分布结果:3个座位的错配率分别为A(23%),B(10%),DRB1(17%);A和DRB1座位的错配比较集中,A座位仅见于A02,A11和A24家族,DRB1座位见于DRB104,DRB108,DRB112,DRB114和DRB115家族;而B座位的错配则比较分散,比较高的是B35,B48,B61和B62。④供受者间人类白细胞抗原-A,B,DRB1错配等位基因组合结果:3个座位的错配等位基因组合呈现较高的多样性,比较常见的几种组合为A0201/0207,A1101/1102,A0201/0206,A0203/0207,B4002/4006,DRB11201/1202和DRB11501/1502。结论:中国汉族异基因造血干细胞移植无关供受者对的人类白细胞抗原等位基因配合率低且其分布具有一定规律和特殊性,在移植前有必要对无关供受者对进行人类白细胞抗原高分辨分型。

慢性HBV感染者特异性细胞毒性T淋巴细胞及HLA-A2的变化研究

目的:探讨慢性HBV感染者特异性细胞毒性T淋巴细胞(specific cytotoxic T lymphocyte,CTL)及人类白细胞抗原-A2(human leucocyte antigen-A2,HLA-A2)的变化,并分析CTL与血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)水平和病毒载量的关系,以了解慢性HBV感染者特异性细胞免疫功能的状态。方法:采用HLA-A2限制的HBVcore18-27抗原表位肽五聚体(MHC Pentamers)法结合流式细胞技术,分析CHB组慢性乙型肝炎46例、LC组乙型肝炎肝硬化29例和NC组23例正常对照健康体检者,外周血HBV特异性CTL及HLA-A2的变化,并分析CTL与ALT水平和病毒载量的关系。结果:CHB组、LC组HLA-A2检出率均明显高于NC组;ALT水平和病毒载量与HBV特异性的CTL有一定的关系。结论:采用HLA-A2限制的HBVcore18-27抗原表位肽五聚体(MHC Pentamers)法结合流式细胞技术可以检测到低水平的HBV特异性CTL;HLA-A2是乙型肝炎肝硬化的易感基因之一;ALT水平和病毒载量与HBV特异性CTL有一定的关系。

青海土族人群HLA-A、B、DRB1基因多态性分析

目的:分析青海土族人群人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)A、B、DRB1的基因多态性特点。方法:应用聚合酶链反应-直接测序分型(Polymerase chain reaction sequence-based typing,PCR-SBT)法对土族人群中47名健康无血缘关系的个体进行HLA-A、B、DRB1基因座高分辨分型。并将青海土族人群的HLA-DRB1基因与国内其它少数民族人群进行比较。结果:检出HLA-A、B、DRB1的基因型数和等位基因数分别为34、41、42和17、28、30。这3个基因座分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。且HLA-DRB1基因座等位基因频率分布与蒙古族有相似之处,表现在基因频率较高的DRB1*04,DRB1*07,DRB1*09,DRB1*12等位基因。结论:青海土族人群具有独特的HLA-A、B、DRB1基因频率分布特征,且青海土族HLA-DRB1等位基因频率分布与蒙古族有相似之处。

慢性乙型肝炎病毒感染患者外周血特异性CD8^+T淋巴细胞检测的临床意义

目的研究慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者外周血特异性CD8+T淋巴细胞(CTL)频率的变化及临床价值。方法采用乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)18-27表位肽-人类白细胞抗原(HLA)-A*0201五聚体及CD8单克隆抗体,设计流式细胞技术检测HLA-A2+6例、HLA-A2-12例非HBV感染者、HLA-A2+49例和HLAA2-42例HBV感染者外周血中针对该肽段的特异性CTL数量,占总计数CD8+细胞数百分比表示。结果 HLA-A2-HBV感染未抗病毒治疗者特异性CTL(0.30%～14.40%,中位数1.13%,n=20)与HLA-A2-非HBV感染者(0.33%～3.90%,中位数1.04%,n=12),差异无统计学意义(P>0.05),但显著低于HLA-A2-抗病毒治疗者(0.25%～20.30%,中位数2.11%,n=22,P<0.05);HLA-A2-抗病毒治疗者特异性CTL和HLA-A2+未抗病毒治疗者特异性CTL(0.20%～29.90%,中位数2.22%,n=20)均显著高于HLA-A2-非HBV感染者(P<0.01);HLA-A2+抗病毒治疗者特异性CTL(0.14%～39.22%,中位数1.33%,n=29)显著高于HLA-A2-非HBV感染者(P<0.05)。HLA-A2+未抗病毒组中血清HBV DNA<103 copy/mL、丙氨酸氨基转移酶小于40U/L者特异性CTL频率增高(P<0.05、0.01)。结论 HBV抗原肽-HLA-A*0201五聚体流式细胞技术能在体外直接检测外周血HBV特异性CTL频率的变化,其水平一定程度反映不同临床感染状态慢性HBV感染患者T淋巴细胞对特异性抗原表位免疫应答的差异。

HLA-A、B血清学分型误定规律分析

目的:分析HLA-Ⅰ类血清学分型误定规律,研究HLA-A,B位点基因分型方法,提高移植配型的准确性。方法:应用聚合酶链反应—序列特异性引物(PCR-SSP)技术,检测180例骨髓资料库中已用血清学分型的自愿者HLA-A,B基因。结果:HLA-A特异性血清学分型错误率在纯合子与杂合子中分别占30.77%与17.19%,HLA-A特异性血清学分型总错误率19.48%;HLA-B特异性血清学分型错误率在纯合子与杂合子中分别占46.15%与30.14%,HLA-B特异性血清学分型总错误率32.09%;HLA-A,B血清学分型总错误率为27.50%。HLA-A特异性血清学分型假阴性8.75%,假阳性2.27%,错误指认特异性17.21%,HLA-B特异性则分别为9.00%、2.18%、29.91%。结论:HLA-A和HLA-B纯合子血清学分型错误率明显高于对应的杂合子分型(P值均小于0.005),HLA-B特异性血清学分型错误率显著高于HLA-A特异性;骨髓资料库中自愿者HLA-A,B位点须重新用基因分型方法分型。

HLA- A0201、A1101和A2402限制性HBV抗原肽的虚拟预测与实验鉴定

目的:筛选和鉴定基因总频率>50%的3种人类白细胞抗原(HLA)(A0201、A1101和A2402)分子限制的乙型肝炎病毒(HBV)抗原T细胞表位肽。方法:利用6种在线T细胞表位肽预测数据库,针对乙肝病毒表面抗原、核心抗原、DNA多聚酶和X蛋白等4种抗原,虚拟筛选3种HLA-A分子限制的T细胞表位肽。从南京市第二医院检验科收集乙型肝炎住院患者的外周抗凝血,制备外周血单个核细胞,通过γ干扰素酶联免疫斑点法(IFN-γELISPOT)筛选出对任何一组混合多肽呈现特异T细胞反应的乙型肝炎患者;重新采集这些乙型肝炎患者的新鲜外周血,用IFN-γELISPOT法鉴定混合肽中单种抗原肽的免疫原性;并采用聚合酶链反应测序分型法对这些乙型肝炎患者进行HLA-A等位基因分型。结果:经鉴定具有免疫原性的HLA-A0201分子限制性HBV表位肽8种,A1101限制性HBV表位肽6种,A2402限制性HBV表位肽7种。结论:本研究筛选鉴定了3种HLA-A分子限制的4种HBV抗原的21种T细胞表位肽,其中11种未见报道,而且HLA-A1101分子限制性表位肽的免疫原性明显弱于HLA-A0201和A2402分子限制性表位肽。

外体负载特异性抗原促进小鼠抗肿瘤效应的研究

目的:验证人树突状细胞(DC)分泌的外体(exosomes,EXO)负载NY-ESO-1抗原促进转基因小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)扩增及增强肿瘤杀伤效应。方法:应用人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-A2阳性健康成人的外周血分离诱导外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)来源的成熟DC,利用一系列不同速度的离心结合膜超滤的方法,从其上清中提取成熟DC分泌的EXO。人工负载肿瘤睾丸抗原NY-ESO-1于EXO之上(EXO/Ag),与聚肌胞(PolyI-C)共同免疫健康HLA-A2转基因C57小鼠,并在体系中加入EXO/Ag继续体外培养脾细胞。使用以上方法获得的脾细胞行四聚体实验,并对K562细胞及黑色素瘤细胞(对照组)行杀伤实验。结果:脾细胞中NY-ESO-1特异的CTL有所扩增,对K562肿瘤细胞有一定杀伤效应。体外实验显示NY-ESO-1特异的CTL较前大量扩增,对K562肿瘤细胞杀伤效应大大增加。结论:EXO/Ag结合PolyI-C作为新一代抗肿瘤疫苗具有良好的应用前景。

人类白细胞抗原-Ⅰ类基因位点多态性与河南地区儿童急性淋巴细胞白血病相关性研究

目的探讨人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-Ⅰ类基因A,B,C位点多态性与河南地区儿童急性淋巴细胞白血病发生的相关性。方法采用序列特异性聚合酶链式反应方法对河南地区98例急性淋巴细胞白血病患儿(观察组)和373例正常对照个体的(对照组)HLA-A,B,C位点的多态性进行检测。结果 2组受试者共检出HLA-A等位基因型16种,HLA-B等位基因型37种,HLA-C等位基因型15种;其中观察组检出HLA-A,B,C等位基因型分别13,26,13种,而对照组分别检出15,36,14种;HLA-B*07在观察组中的频率0.015明显低于对照组的频率0.056(P=0.026,OR=0.261,95%CI:0.080～0.850,χ2=8.734);除HLA-B*07外,HLA-A,B,C其他各等位基因在观察组和对照组中分布差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HLA-B*07在河南儿童急性淋巴细胞白血病发生中可能起保护作用。

献血人群丙型肝炎病毒感染与人类白细胞抗原A基因的相关性

目的探讨浙江献血人群中丙型肝炎病毒感染与人类白细胞抗原A基因的相关性。方法选择2011年10月-2013年10月浙江省血液中心献血人群,经血液核酸筛查HCV RNA阳性的样本45例。采用基因测序方法检测HLA-I类基因中A等位基因情况,同时以健康人8 333例为对照样本。结果 HLA-A基因的A*02∶01(P=0.002 9,OR=2.18,95%CI:1.32~3.59)和A*33∶01(P=0.0270,OR=26.74,95%CI:3.25~219.7)位点在HCV RNA阳性献血者中的频率与健康对照人群比较差异有统计学意义。结论在浙江献血人群中HCV感染与HLA-A基因中部分多态性位点有相关性。

HLA-A基因甲基多态性与维吾尔族饲鸽者肺发生风险的关系

目的研究南疆维吾尔族饲鸽者肺发生风险与人类白细胞抗原(HLA)基因甲基多态性的关系。方法选择2019年1月至2021年10月在南疆地区养殖鸟禽类1年以上的维吾尔族饲鸽者,其中维吾尔族患饲鸽者肺的30例作为患病组,30例维吾尔族饲养鸽子未患病为阴性对照组,同时选择维吾尔族健康体检者30例作为正常对照组。抽取空腹静脉血4 ml,离心收集血浆和全血细胞并保存待用。应用Sequenom Mass ARRAY Methylation方法对cg1408363基因甲基化水平进行检测。结果从抗原暴露情况分析,发病患者在抗原中有着较长时间暴露,这表明伴随抗原暴露时间越长,饲养鸽子数量越多,出现饲鸽者肺的可能性越大。患病组CpG岛甲基化位点为10的人数、CpG岛甲基化率20%~40%人数明显高于阴性对照组、正常对照组(P<0.05),不同性别及不同年龄段研究对象的HLA-A基因甲基化状态无明显差异(P>0.05)。对3组HLA-A基因11个CpG位点单位差异进行研究,结果显示HLA-A基因CpG5基因位点上存在差异(Z=-2.102,P=0.028)。结论饲鸽者肺患者HLA-A基因CpG5位点甲基化水平异常降低,HLA-A基因甲基化水平与饲鸽者肺发生有着密切联系。

地高辛标记PCR—SSOP法进行HLA—A^＊02等位基因检测

目的 :建立聚合酶链反应 -序列特异性寡核苷酸探针 (PCR- SSOP)分型方法 ,并分析其实用价值。方法 :采用一对引物扩增所有 HL A- A2特异性抗原 ,用 2 3个探针和扩增产物杂交 ,探针用地高辛系统标记和检测 ,可鉴定 A2的 2 5个等位基因 ,并在中国人群 HL A- A*0 2等位基因的检测中进行应用 ,用 B淋巴母细胞株作阳性对照 ,同时与聚合酶链反应 -序列特异性引物 (PCR- SSP)检测方法作比较。结果 :采用本方法检测 HL A - A 2等位基因的结果与用 PCR- SSP方法检测的结果一致。结论 :实验证明本分型技术具有质控好、特异性强、敏感性高、费用低廉。

重组腺相关病毒介导HLA-A2基因转导肝癌细胞增强杀伤性T细胞抗肿瘤免疫应答

目的 本研究旨在探讨重组腺相关病毒（rAAV）介导HLA-A2基因转导肝癌细胞增强杀伤性T细胞（CTL）抗肝癌免疫应答.方法 利用携带人类甲胎蛋白（AFP）基因的rAAV（rAAV-AFP）转导人树突状细胞（DC）体外诱导AFP特异性抗肝癌CTL免疫应答.利用携带人类HLA-A2基因的rAAV（rAAV-HLA-A2）体外转导肝癌细胞提高HLA-A2分子表达水平,增强肝癌细胞对rAAV-AFP转导DC疫苗诱导的AFP特异性CTL免疫反应的敏感性.结果 rAAV-AFP转导DC疫苗能够有效诱导AFP特异性抗肝癌CTL免疫应答.rAAV-HLA-A2能够提高肝癌细胞HLA-A2分子表达,并增强肝癌细胞对rAAV-AFP转导DC疫苗诱导的CTL免疫反应的敏感性.结论 通过rAAV-HLA-A2提高肝癌细胞HLA-A2分子表达是增强CTL抗肝癌免疫应答的有效途径.为AFP表达阳性但HLA-class I分子表达低下的肝癌患者的主动性免疫治疗提供了新的解决方案.

北京地区人群HLA-A、B、DRB1的聚合酶链反应-直接测序分型研究

目的调查北京人群人类白细胞抗原(humanleukocyte antigen,HLA)-A、B、DRB1的基因多态性,获得完整准确的遗传学数据。方法应用聚合酶链反应-直接测序分型(polymerase chain reaction se-quence-basedtyping,PCR-SBT)法对北京地区人群中618名健康无关个体进行HLA-A、B、DRB1基因座高分辨分型。结果检出HLA-A、B、DRB1的基因型数和等位基因数分别为199和84、366和143、286和122,这3个基因座分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。结论从基因水平分析了北京地区HLA-A、B、DRB1基因座的群体分布特征,提供了一套比较完整准确的HLA-A、B、DRB1等位基因频率、基因型频率,为器官移植的供体选择、法医学个体认定、HLA与疾病相关性及人类学等研究提供了重要的参考数据。

兰州地区汉族人群HLA-A、B和DRB1等位基因多态性分析

目的分析兰州地区汉族人群HLA-A、B和DRB1位点等位基因多态性特点。方法采用序列特异性引物聚合酶链反应技术对兰州地区200名健康无血缘关系的汉族个体HLA-A、B和DRB1基因座进行分型,并与西北、北方和南方汉族、西北回族、维吾尔族和藏族人群进行比较。结果兰州汉族人群中HLA-A基因座共检出14个等位基因,以A02,A11,A24,A33,A30,A01和A31基因最常见;HLA-B基因座共检出32个等位基因,以B40,B15,B46,B13,B51,B60,B58和B44基因最为常见;HLA-DRB1基因座共检出13个等位基因,最多见的基因依次为DRB109,DRB115,DRB112,DRB104,DRB111,DRB107,DRB108和DRB114,接近北方汉族而与南方汉族有差异,与西北回族无明显差异,但与西北维吾尔族和藏族差异有统计学意义。结论兰州地区汉族人群HLA-A、B和DRB1位点等位基因多态性与南、北汉族人群存在不同程度的差异,与西北维吾尔族和藏族差异显著。

一例HLA-A新等位基因A＊3308的测序分析

目的研究HLA新的等位基因HLA A3308的分子机制。方法样本DNA抽提采用PEL FREEZ抽提试剂盒,应用PCR方法扩增先证者HLA A基因的第1～8外显子,PCR产物直接经TOPO转染克隆到质粒载体中获得等位基因的单链,对所得克隆进行第2、3、4外显子双向测序分析。结果先证者样本克隆测序得到两个等位基因,其中1个等位基因为A0201,另一个经BLAST验证其为新的等位基因,新的等位基因序列已递交GenBank(DQ089631,DQ089632,DQ089633)。与最接近的A3303等位基因序列相比,新的等位基因在第2外显子上有5个核苷酸不同,即第240位A→T,第256位C→G,第259位A→G,第261位C→G和第270位T→A;这导致3个氨基酸改变:第62位Arg→Gly、第63位Asn→Glu和第66位Asn→Lys。结论该等位基因为新的HLA A等位基因,被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLAA3308。

山西汉族人群HLA-A、-B、-DRB1基因多态性研究

目的调查山西汉族人群HLA-A、-B、DRB1基因多态性,获得完整准确的遗传学数据。方法应用聚合酶链反应-序列特异性引物方法对7440名健康、无血缘关系的山西汉族个体进行HLA-A、-B、-DRB1基因型检测,并与不同人群等位基因进行比较。结果检出A等位基因18个,B等位基因40个,DRB1等位基因13个,其中A*02、A*24、A*11、A*01、A*03、B*13、B*51、B*15、B*40、B*35、DRB1*15、DR*09、DR*12、DR*04、DR*07等位基因频率分布较高。结论山西汉族人群HLA-A,-B,-DRB1基因具有中国北方汉族人群共有的遗传特征,但也有其自身的分布特点。

沈阳汉族群体HLA Ⅰ类基因座PCR-序列特异性寡核苷酸探针分型研究

目的检测和分析沈阳汉族HLA-A、-B、-Cw位点等位基因的多态性。方法采用聚合酶链反应-寡核苷酸探针杂交分型方法对108名沈阳籍健康献血员进行HLA-A、-B、-Cw等位基因分型。结果检出等位基因HLA-A位点21个,B位点43个,Cw位点23个;所有位点的等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。结论从基因水平分析了HLAⅠ类基因的群体分布特征,提供了沈阳汉族群体HLAⅠ类基因座更准确的基因频率。