人类白细胞抗原E基因全长序列测定及两个新等位基因的鉴定

背景:人类白细胞抗原E是非经典的人类白细胞抗原I类分子,目前的多态性分析研究主要针对其第3外显子人类白细胞抗原E~*01:01及人类白细胞抗原E*01:03进行区分,然而其全基因序列测定方法及新等位基因报道尚不多见。目的:利用中国深圳地区无偿献血正常个体建立人类白细胞抗原E基因全长序列测序分型方法,鉴定人类白细胞抗原E基因全长序列新的等位基因。方法:提取研究对象外周血DNA,根据IMGT/HLA数据库中公布的人类白细胞抗原E基因序列,在保守区设计全基因扩增及测序引物,利用高保真反应体系对人类白细胞抗原E全长序列进行扩增,随后测序、拼接、序列确认及基因定型。结果与结论:(1)成功建立了人类白细胞抗原E的全基因扩增及测序分型方法,发现了两个人类白细胞抗原E新等位基因——人类白细胞抗原E~*01:01:01:06与人类白细胞抗原E~*01:01:01:07,获得了WHO人类白细胞抗原命名因子委员会的命名;(2)人类白细胞抗原E~*01:01:01:06与其最接近的等位基因人类白细胞抗原E~*01:01:01:01相比,突变位点在5’-启动子区的NT-26(G->T),人类白细胞抗原E~*01:01:01:07与其最接近的等位基因人类白细胞抗原E~*01:01:01:01相比,突变位点在3’-非翻译区的NT3345位(T->C);(3)结果提示,中国人群中人类白细胞抗原E全基因序列多态性数据有待填补,试验建立的方法为该项研究提供了关键的技术。

NKG2A-HLA-E轴介导NK细胞应答在病毒感染性疾病中的作用及机制研究进展

自然杀伤(NK)细胞主要通过迅速释放细胞毒性介质以及细胞因子直接杀伤病毒感染的靶细胞。NK细胞表面抑制性和活化性受体的平衡以及靶细胞上相应配体的表达均参与调控NK细胞的杀伤功能。其中NK细胞2组成员A(NKG2A)是NK细胞上备受关注的抑制性受体之一,通过与其配体人类白细胞抗原E(HLA-E)的相互作用,可抑制NK细胞对自身正常组织细胞的杀伤活性。研究发现病毒感染细胞表面HLA-E表达上调,并且可与病毒蛋白来源的多肽结合形成复合物,通过与NKG2A的相互作用调控NK细胞功能,从而参与病毒感染性疾病发病过程。本文总结了NKG2A与HLA-E分子互作特点,以及NKG2A-HLA-E轴参与调控NK细胞的功能机制,有助于了解NK细胞在病毒感染性疾病中的重要作用。

人类白细胞抗原E在子宫腺肌病在位及异位内膜的表达

目的：通过检测AM患者在位及异位内膜的人类白细胞抗原E（HLA-E）的表达,探讨HLA-E在AM发病机制中的作用。方法：选取2008年12月~2009年10月因AM行子宫切除的标本62份作为病例组,同期因子宫肌瘤行子宫切除的标本20份作为对照。采用免疫组化SP法,检测两组中HLA-E的表达情况,比较检测的结果。结果：HLA-E在对照组内膜组织中低表达,在病例组在位内膜及异位内膜中表达的程度较对照组明显增强,差异有统计学意义（P〈0.05）,病例组在位内膜组织与异位病灶两者之间比较差异无统计学意义（P〉0.05）。细化分组,比较病例组增殖期组与分泌期组HLA-E的表达差异无统计学意义（P〉0.05）;比较病例组浅层组与深层组HLA-E的表达差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：①高表达的HLA-E可能参与子宫腺肌病的发病机制;②HLA-E分子表达的强度与月经周期的不同时期及病灶浸润肌层的深度无关;③改善患者免疫状态,为临床治疗子宫腺肌病提供新思路。

抗原肽对人多发性骨髓瘤细胞HLA-E的表达调控及对NK细胞抗肿瘤活性的影响

目的研究HLA-I类基因抗原肽(B7)、巨细胞病毒(CMV)抗原肽对人多发性骨髓瘤细胞系U266表面HLA-E分子表达水平的调控及其表达水平的改变对NK细胞抗肿瘤活性的影响。方法将体外合成的B7及CMV抗原肽与U266共同孵育,流式细胞术检测这些抗原肽孵育前后U266细胞表面的HLA-E分子表达水平。分离健康人NK细胞,利用CD107a表达检测法研究U266细胞表面HLA-E表达水平改变后,NK细胞对其杀伤活性的变化。结果 HLA-B7抗原肽,CMV抗原肽,均可显著上调人多发性骨髓瘤细胞U266表面的HLA-E分子表达水平,且HLA-E表达上调后,可明显特异性抑制NK细胞杀伤肿瘤细胞活性。结论在肿瘤微环境中,细胞表面HLA-E表达上调可能是肿瘤细胞逃逸NK细胞免疫杀伤的一个重要手段之一。

HPV感染相关CIN患者血清HLA-E和HLA-G表达与疾病进展及治疗后复发的相关性

目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)感染相关宫颈上皮内瘤变(CIN)患者血清人类白细胞抗原E(HLA-E)、人类白细胞抗原G(HLA-G)表达及临床意义。方法选取2021年6~12月在河北中石油中心医院治疗的HPV感染相关CIN患者120例作为观察组,选取同期无HPV感染的CIN患者60例作为对照组,检测两组血清HLA-E和HLA-G表达水平,分析血清HLA-E和HLA-G表达与患者临床资料、治疗后复发的关系。结果观察组血清HLA-E和HLA-G水平分别为(75.59±18.28)pg/mL和(30.20±9.92)ng/mL,高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组CIN分级Ⅱ/Ⅲ级患者血清HLA-E和HLA-G分别为(83.33±13.90)pg/mL和(34.54±7.18)ng/mL,高于CIN分级Ⅰ级(P<0.05);观察组高危型HPV感染者血清HLA-E和HLA-G分别为(78.82±17.70)pg/mL和(32.23±9.43)ng/mL,高于低危型HPV感染者(P<0.05)。观察组血清HLA-E和HLA-G表达与CIN分级呈正相关(P<0.05)。复发患者治疗后1周血清HLA-E和HLA-G分别为(68.32±8.73)pg/mL和(24.43±5.58)ng/mL,高于未复发患者(P<0.05)。结论HPV感染相关CIN患者血清HLA-E和HLA-G表达与CIN分级呈正相关,同时与患者治疗后复发有一定关系。

肝癌Bel7402细胞HLA-E基因上调对NK细胞体外杀伤作用的影响

目的:探讨肝癌Bel7402细胞人类白细胞抗原-E(HLA-E)基因上调对NK细胞体外杀伤作用的影响。方法:体外构建Lentivirus/CMV/GFP-HLA-E慢病毒表达载体并转导肝癌Bel7402细胞,采用RT-PCR和Western blotting方法检测肝癌Bel7402细胞HLA-E基因mRNA水平和蛋白水平的表达,分析肝癌Bel7402细胞HLA-E基因上调及HLA-ABC抗体封闭靶细胞相应位点对NK细胞体外杀伤作用的影响。结果:Lentivirus/CMV/GFP-HLA-E重组慢病毒载体感染Bel7402细胞后不同时段(24h、48h、72h、96h)的HLA-E mRNA的表达明显上调,除在感染后24h(P<0.05)外,慢病毒过表达组在感染后48h、72h、96h与Bel7402组比较,显著差异(P<0.01)。蛋白水平的表达亦明显上调:24h、48h、72h、96h外源性/内源性HLA-E吸光度比值与12h比较显著差异(P<0.01)。未封闭的Bel7402组和Bel7402 LentiHLA-E组比较,NK细胞的杀瘤活性差异显著(P<0.05或P<0.01);封闭组和未封闭组比较,NK细胞的杀瘤活性差异显著(P<0.05);Bel7402(封闭组)和Bel7402 LentiHLA-E(封闭组)比较,NK细胞的杀瘤活性有显著差异(P<0.01)。结论:Lentivirus/CMV/GFP-HLA-E慢病毒表达载体能有效增加HLA-E的表达。NK细胞对HLA-E基因表达上调的Bel7402细胞的靶杀伤作用降低;抗HLA-ABC单抗封闭靶细胞相应位点后,NK细胞对靶细胞的杀伤能力普遍有所提高。

HLA-E在肝癌细胞系中的表达

目的:研究人类白细胞抗原E(HLA-E)在肝癌细胞系中的表达情况。方法:通过real-time PCR和Western blotting技术研究5种肝癌细胞系和胎肝细胞系中HLA-E mRNA和蛋白的表达情况,进行相对定量分析。结果:Real-time PCR检测显示,HepG2细胞、Bel7402细胞、PLC细胞、MHCC97细胞和Hep3B2.1-7细胞这5种肝癌细胞系与L02胎肝细胞系的HLA-E mRNA水平比较,除Hep3B2.1-7细胞表达几乎接近缺失(P<0.01)外,其余无显著差异(P>0.05)。HepG2细胞、Bel7402细胞、PLC细胞、MHCC97细胞和Hep3B2.1-7细胞与L02细胞的HLA-E蛋白水平比较,差异显著(P<0.01),其中Hep3B2.1-7细胞表达缺失。结论:肝癌细胞系的HLA-E mRNA和蛋白表达不同步,可能存在转录后调控。

子痫前期患者胎盘组织NK细胞及其表面KIR受体的配体HLA-G和HLA-E的表达及意义

目的检测子痫前期患者胎盘组织天然杀伤(NK)细胞及其表面KIR受体的配体HLA-G和HLA-E的表达并探讨其临床意义。方法选择2011年7月至2012年12月在东南大学附属中大医院及东南大学附属江阴人民医院妇产科住院分娩的孕妇60例,包括子痫前期及正常妊娠孕妇各30例。采用免疫组化法检测胎盘组织NK细胞分布和数量以及NK细胞表面KIR受体的配体HLA-G和HLA-E蛋白表达情况;采用western blot法定量检测子痫前期患者和正常妊娠孕妇(各10例)胎盘组织HLA-G蛋白表达水平。结果 NK细胞主要分布在胎盘组织的蜕膜层。子痫前期组NK细胞数量显著高于正常妊娠组(P<0.05);HLA-G表达水平显著低于正常妊娠组(P<0.05);两组间HLA-E表达水平差异无统计学意义。结论子痫前期患者母胎界面NK细胞数量异常增高以及HLA-G的表达降低可能与子痫前期的发病相关。

HLA-E介导孕激素对绒毛膜癌JEG-3细胞血管内皮生长因子表达的调节作用

目的:研究人类白细胞抗原E(HLA-E)是否参与孕激素对JEG-3细胞VEGF基因表达的调节作用。方法:JEG-3细胞分为5组,接受不同处理:空白对照(组1)、孕激素处理(组2)、转染HLA-EsiRNA慢病毒后孕激素处理(组3),HLA-EsiRNA慢病毒转染(组4)以及慢病毒阴性对照转染(组5)。48小时后收集细胞,分别采用Real-timePCR和Westernblot方法检测JEG-3细胞血管内皮生长因子(VEGF)mRNA及蛋白表达水平。结果:组2JEG-3细胞的VEGFmRNA和蛋白表达较组1增高,差异有统计学意义(P<0.05);沉默HLA-E基因(组4)导致VEGFmRNA和蛋白表达降低,与组1比较,差异有统计学意义(P<0.05)。组3JEG-3细胞经HLA-EsiRNA慢病毒转染、沉默HLA-E表达后再接受孕激素处理,VEGFmRNA及蛋白表达水平与组1比较差异无统计学意义(P>0.05)。组5与组1比较,VEGFmRNA及蛋白水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:HLA-E介导孕激素对JEG-3滋养细胞VEGF表达的上调,孕激素对JEG-3细胞VEGF的上调作用被HLA-E基因的沉默消除。

HLA-E与oHSV2 VP5蛋白相互作用研究

溶瘤病毒代表了一类新的免疫治疗药物。它通过选择性杀伤肿瘤细胞和诱导全身性抗肿瘤免疫的双重作用机制,促进抗肿瘤反应。溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒oHSV2是由单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)基因改造而来的新型溶瘤病毒。人类白细胞抗原E(HLA-E)是一种HLAⅠb类分子,是CD94/NKG2A的强效抑制配体,它们的结合会抑制CTL细胞和NK细胞功能。多项研究已证实HLA-E会在人肿瘤细胞表面过表达,研究团队前期研究也表明oHSV2会在体外上调部分肿瘤细胞系表面HLA-E的表达。应用GST pull-down和质谱技术确定oHSV2的VP5蛋白(由UL19基因编码)为HLA-E的相互作用蛋白,并通过激光共聚焦实验进行了初步验证。它们相互作用的确定,为探究oHSV2是否干扰HLA-E和CD94/NKG2A的结合奠定研究基础。

HLA-E基因多态性与白血病的相关研究

目的探讨HLA-E基因多态性与白血病的相关性,为白血病的发生发展机制提供新的分子标记。方法提取白血病患者组(n=59)及正常人群(对照)组(n=132)外周血DNA,利用长片段高保真PCR方法做HLA-E全长序列扩增并对HLA-E的第3外显子测序并分型;分别计算2组中各基因型的频率及各等位基因的频率。结果白血病患者组:共检出35例纯合子,检出率59.3%(35/59),其中29例(49.2%)为HLA-E*01:03纯合子、6例(10.2%)为HLA-E*01∶01纯合子;正常对照组:共检出62例纯合子,检出率47.0%(62/132)其中36例(27.3%)为HLA-E*01:03纯合子、26例(19.7%)为HLA-E*01∶01纯合子;白血病患者组和正常对照组HLA-E*01∶03等位基因频率分别为69.5%vs 53.7%(P<0.01),2组HLA-E*01∶03纯合子比例分别为49.2%vs 27.3%(P<0.01,OR=2.1)。结论 HLA-E*01∶03是白血病的易感基因。

HLA—E在RSA人绒毛组织中的表达与临床意义

目的研究人类白细胞抗原E（HLA-E）在反复自然流产（RSA）和正常流产人绒毛组织中的蛋白和mRNA表达，探讨HLA-E与不明原因RSA的相关性及其临床意义。方法采用免疫组织化学技术和逆转录一聚合酶链反应技术检测35例RsA人绒毛组织和35例正常流产人绒毛组织中细胞学定位以及HLA-E在mRNA水平的表达。结果免疫组织化学检测结果显示两组中均有HLA-E阳性表达，RSA组的HLA-E在人绒毛组织中阳性表达率低于正常流产组（χ2=131．125，P〈0．05）。逆转录-聚合酶链反应结果显示RSA组和正常流产组均有HLA-E表达，对比显示RSA组的HLA-E表达低于正常流产组（t=1．937，P〈0．05）。结论RSA妊娠妇女早孕绒毛组织中HLA-E在组织细胞学蛋白和mRNA水平均较正常人工流产妊娠妇女早孕绒毛组织中降低，提示自然流产妊娠妇女存在HLA-E表达异常，HLA-E可能与RSA的发生关系密切。

HLA-E的研究进展

人类白细胞抗原E(HLA-E)属于非经典人类主要组织相容性复合体(MHC-Ib)类分子,是继HLA-A、B、C之后人类发现的第4个MHC-I类分子,相比较MHC-Ia类分子,具有有限的多态性,广泛的组织分布和低水平的细胞表面表达等特点,在母胎免疫耐受、移植免疫、抗肿瘤和抗病毒免疫中的作用引起人们高度重视。

HLA-E在老年人群结肠癌前病变中的表达研究

目的分析人类白细胞抗原E(human leukocyte antigen-E,HLA-E)在老年人群结肠癌癌前病变中的表达现状。方法随机选取109例内镜手术患者的病理标本,其中管状绒毛状腺瘤组织59例,高级别类瘤变/癌变组织50例;肠镜活检获取20例健康体检者的正常黏膜组织。根据年龄分为<60岁、60~70岁及>70岁,比较不同年龄受试者结肠组织的一般资料,应用免疫组化检测HLA-E表达。结果不同年龄受试者在正常黏膜组、管状绒毛状腺瘤组及高级别类瘤变/癌变组中HLA-E表达差异有统计学意义(P<0.05)。HLA-E强阳性表达率在正常黏膜组、管状绒毛状腺瘤组和高级别类瘤变/癌变组中依次增多,随着年龄增加HLA-E强阳性表达率增高(P<0.001)。结论 HLA-E在老年人群结肠癌癌前病变中高表达,可能促使早期结肠癌细胞形成免疫逃逸。

NKG2A和HLA-E在肿瘤中介导免疫逃逸的研究进展

免疫检查点阻断疗法的出现标志着肿瘤治疗进入新时代, 部分患者因此获益。近年来, 自然杀伤细胞受体家族成员2A(natural killer group 2 member A, NKG2A )和人类白细胞抗原E(human leukocyte antigen E, HLA-E )作为新的免疫检查点受到广泛关注, 且与多种肿瘤细胞的免疫逃逸有关。NKG2A主要表达于大部分自然杀伤(natural killer, NK)细胞表面并在CD8^(+)T细胞上选择性表达。其配体HLA-E在多种肿瘤细胞中表达增强。目前, 部分研究显示, NKG2A抑制剂参与的肿瘤联合免疫治疗可以明显提高肿瘤患者对免疫治疗的总体反应率。因此, NKG2A有望成为肿瘤免疫检查点治疗的新靶点, 为肿瘤患者提供治疗新策略。

抗原特异性HLA-E限制性CD8^(+)T细胞在感染性疾病中的作用

HLA-E是非经典的HLAⅠ类分子中的重要成员之一。在免疫系统中,HLA-E不仅可以作为NK细胞和CD8^(+)T细胞表面CD94和NKG2A/C的配体介导细胞生物学功能,而且可以提呈抗原表位给CD8^(+)T细胞的TCR识别,介导CD8^(+)T细胞应答。HLA-E可结合来自病原体、肿瘤以及自身抗原等的多种抗原表位,并将其提呈给CD8^(+)T细胞,通过与CD8^(+)T细胞上的不同受体相互作用介导不同的免疫效应。在感染性疾病中,HLA-E可提呈病原体来源的抗原表位给CD8^(+)T细胞的TCR特异性识别,激活CD8^(+)T细胞,增强适应性免疫应答。因此,HLA-E限制性CD8^(+)T细胞是免疫应答过程中的一个重要参与者。该文对HLA-E限制性CD8^(+)T细胞在感染性疾病中的作用及机制进行综述。

NKG2A参与抗肿瘤免疫的生物学机制及前景

自然杀伤细胞受体第二组成员A(natural killer cell receptor groupⅡnumber A,NKG2A)是NKG2受体家族的抑制性受体成员,主要表达在以NK细胞为代表的多种免疫细胞上,研究发现NKG2A参与多种肿瘤的发生、发展。目前针对NKG2A的靶向药物已进入一系列上皮性肿瘤的临床期试验。该文通过阐述NKG2A的生物学特性及其在CD8^(+)T细胞、NK细胞等免疫细胞中的生物学作用,进而探讨NKG2A作为免疫检查点在抗肿瘤免疫中的作用机制,以期为临床抗肿瘤免疫治疗提供理论依据。

四君子汤调节NKG2A表达影响NK细胞抗结肠癌作用

目的:探讨中药复方四君子汤通过调节NKG2A的表达影响自然杀伤(NK)细胞抗结肠癌的作用。方法:分离、纯化来自健康人外周血NK细胞进行培养,分别构建人NK细胞单培、HCT116细胞单培和NK细胞与HCT116细胞共培模型,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测NK细胞中自然杀伤细胞2族成员A(NKG2A)、白细胞介素(IL)-15及结肠癌细胞中组织相容性白细胞抗原E(HLA-E)mRNA的表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测NK细胞中IL-15分泌;噻唑蓝(MTT)比色法筛选IL-15的浓度,检测四君子汤和IL-15对NK细胞活性和共培模型中HCT116细胞活性的影响,Real-time PCR检测四君子汤和IL-15对NK细胞中NKG2A和HCT116中HLA-E mRNA表达的影响;使用Anti-NKG2A抗体(M)阻断NKG2A/HLA-E通路,MTT比色法检测共培模型中HCT116细胞增殖情况。结果:与单培组比较,NK细胞和HCT116细胞相互作用引起NK细胞的NKG2A和HCT116中的HLA-E mRNA表达均上调(P<0.05);IL-15 mRNA表达和分泌也增加(P<0.05);IL-15可增强NK细胞活性和抗结肠癌作用(P<0.01),也可上调NKG2A表达(P<0.05);与空白组比较,四君子汤组、四君子汤+IL-15组的NK细胞活性和抗结肠癌作用进一步增加(P<0.01),Real-time PCR结果显示,与空白组比较,四君子汤组和四君子汤+IL-15组中NK细胞NKG2A表达下调(P<0.05),共培模型中四君子汤组HCT116中HLA-E表达下调(P<0.01);与相应未加M组比较,M组与IL-15+M组HCT116细胞增殖被抑制(P<0.01)。结论:NK细胞与结肠癌细胞相互作用可引起NKG2A-HLAE通路活化导致NK功能受损,四君子汤可抑制该信号激活从而恢复NK细胞抗结肠癌作用。