针对断裂点集簇区-Abelson鼠白血病病毒癌基因(BCR-ABL)b3a2位点的兔多克隆抗体制备及鉴定

目的制备兔抗断裂点集簇区-Abelson鼠白血病病毒癌基因(BCR-ABL)b3a2位点的多克隆抗体并鉴定其特异性。方法针对BCR-ABL融合蛋白b3a2型的特异性抗原序列,设计并合成纯度高于90%的多肽。一方面通过透孔螺血蓝蛋白(KLH)偶联融合多肽用于免疫新西兰兔,多次加强免疫得到抗血清;另一方面通过仅偶联单独BCR或者ABL肽段对抗血清进行二次纯化,吸附并去除未结合融合表位的抗血清以达到进一步纯化抗体的效果。最终得到的抗血清用于ELISA及Western blot法检测。结果免疫前兔血清背景均低,免疫后抗血清效价达到1∶32000,满足实验要求。抗原亲和纯化所得抗体纯度及效价高,Western blot法检测表明抗血清能特异性识别BCR-ABL融合基因的b3a2位点,特异性好。结论制备了针对BCR-ABL基因b3a2位点的特异性兔源多克隆抗体。

siRNA沉默RALA基因影响人白血病K562细胞增殖和凋亡

目的:研究小干扰RNA(siRNA)抑制v-ral猴白血病病毒癌基因同系物A(RALA)基因表达对人慢性粒细胞性白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。方法:利用LipofectamineTM2000将化学合成的RALA siRNA转染体外培养的K562细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测RALA siRNA对K562细胞增殖的影响;台盼蓝拒染法检测RALA siRNA对K562细胞存活率的影响;real-time PCR检测RALA mRNA表达水平;Western blotting检测RALA蛋白表达水平;annexin V/PI双染流式细胞仪检测RALA siRNA对K562细胞凋亡的影响;Hoechst 33258染色荧光显微镜观察细胞形态学变化。结果:RALA siRNA可明显抑制K562细胞内RALA mRNA和蛋白的表达(P<0.05);与阴性对照组相比,转染RALA siRNA的K562细胞增殖明显受到抑制(P<0.05);流式细胞术结果显示转染RALA siRNA的K562细胞凋亡较阴性对照组显著增加(P<0.05);Hoechst 33258染色见转染RALA siRNA的K562细胞出现典型的凋亡形态学变化。结论:癌基因RALA在白血病发生发展过程中发挥重要作用。siRNA下调RALAmRNA和蛋白的表达,可抑制人白血病K562细胞增殖,诱导细胞凋亡,提示RALA可能是白血病治疗的新靶点。

敲低B-细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因对子宫颈癌细胞顺铂敏感性的研究

目的探讨子宫颈癌C4-1细胞敲低B-细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(Bcl-2)的表达,提高人子宫颈癌C4-1细胞对顺铂(DDP)化疗敏感性的作用与机制。方法应用敲低Bcl-2慢病毒转染子宫颈癌C4-1细胞,将其分为对照组、空载组及敲低组,上述分组通过DDP处理后分别作为对照+DDP组、空载+DDP组和敲低+DDP组。采用RT-PCR法检测C4-1细胞Bcl-2 mRNA表达水平,采用流式细胞仪检测C4-1细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测C4-1细胞对DDP的敏感性。结果敲低组与空载组及正常对照组比较,C4-1细胞的凋亡率明显增加(P<0.05),C4-1细胞Bcl-2 mRNA表达量降低;敲低组+DDP组与空载+DDP组和对照+DDP组比较IC50值降低,上述差异均有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒转染子宫颈癌C4-1细胞敲低Bcl-2表达可增加凋亡率,提高子宫颈癌C4-1细胞对顺铂的敏感性。

微小RNA-16对K562细胞向巨核细胞系分化的影响

目的:观察微小RNA-16(microRNA-16,miR-16)对人白血病细胞K562向巨核细胞系分化的影响,并初步探索其中可能的机制。方法:在K562细胞中通过转染miR-16模拟物(mimics)或miR-16抑制物(inhibitor),实时荧光定量PCR检测miR-16的水平变化,通过流式细胞术检测巨核细胞系分化指标CD41、CD42b及CD61的表达。用Western blotting检测miR-16对下游白血病癌基因(myeloblastosis oncogene,MYB)蛋白水平的影响,进而利用流式细胞术检测miR-16是否通过影响MYB调控CD41、CD42b及CD61的表达。结果:转染miR-16-mimics可显著升高K562细胞中的miR-16水平并促进CD41、CD42b及CD61的表达(P<0.05),而转染miR-16-inhibitor可明显抑制K562细胞中的miR-16水平同时降低CD41、CD42b及CD61的表达(P<0.05);Western blotting证实miR-16可调控MYB蛋白水平,而沉默MYB可逆转miR-16对CD41、CD42b及CD61表达的调控作用。结论:miR-16可通过调控MYB的表达,调节人白血病细胞K562向巨核细胞系分化的能力。

B细胞淋巴瘤-2原癌基因和发状分裂相关增强子-1在脑缺血预处理中介导神经保护的效应

目的研究B细胞白血病/淋巴瘤-2原癌基因(Bcl-2)和发状分裂相关增强子-1(Hes1)在脑缺血预处理后介导的神经保护作用。方法模型A组,以大脑中动脉闭塞法建立脑缺血模型;模型B组,行右侧颈内动脉短暂性血流阻断10 min 1次,3 d后,同模型A方法建立缺血模型;假手术组,大鼠仅需分离颈总动脉。于术后2,3,7,14 d,通过Zea-Longa法评估各组大鼠的神经行为,2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法检测脑梗死体积,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法测定Bcl-2和Hes1 mRNA水平。结果与模型A组比较,模型B组的各时间点神经功能缺损评分都明显降低(P<0.05),模型A与B组的脑梗死体积分别为(40.00±4.47)%,(19.00±2.75)%,A组显著大于B组(P<0.05)。模型A、B组Hes1 mRNA的表达均高于假手术组(P<0.05),但模型B组明显高于模型A组(均P<0.05)。Bcl-2 mRNA的表达,与假手术组比较,模型B组再灌注2 d时表达明显增高,且明显高于模型A组(P<0.05)。结论脑缺血预处理后Bcl-2和Hes1 mRNA的表达较脑缺血组增高,可能与神经保护效应相关。

人卵巢黄素化颗粒细胞bcl-2蛋白及mRNA的表达与卵巢反应性的关系

目的探讨体外受精-胚胎移植中人卵巢黄素化颗粒细胞凋亡相关基因bcl-2蛋白和mRNA的表达与相应卵巢反应性的关系。方法收集行体外受精-胚胎移植患者卵泡液中的黄素化颗粒细胞28例,根据卵泡数不同进行卵巢反应性分组分为低反应组、中反应组和高反应组;免疫细胞化学方法检测颗粒细胞bcl-2蛋白表达;RT-PCR测定颗粒细胞bcl-2 mRNA表达。分析人黄素化颗粒细胞bcl-2蛋白及mRNA表达与卵巢反应性的关系。结果分离提纯的人黄素化颗粒细胞于24 h内贴壁生长良好。免疫细胞化学结果显示,随着获卵数的增加bcl-2蛋白HSCORE评分(以下简称HSCbcl-2)逐渐上升,HSCbcl-2与获卵数呈正相关(P<0.01)。高反应组、中反应组和低反应组HSCbcl-2差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR结果显示,bcl-2 mRNA表达与年龄呈负相关(P<0.01),而与获卵数呈正相关(P<0.05)。高反应组、中反应组和低反应组bcl-2 mRNA表达有统计学差异(P<0.05)。结论凋亡相关基因bcl-2蛋白及mRNA的表达与卵巢反应性有明显的相关性。

BCR-ABL1候选参考物质的研制及测量不确定度评定

目的构建慢性粒细胞白血病(CML)融合基因断裂点簇集区-埃布尔森小鼠白血病病毒癌基因1(BCR-ABL1)候选参考物质。方法采用分子克隆技术构建含有BCR-ABL1基因的重组质粒,测序验证后采用紫外分光光度法初步测定浓度,并采用数字聚合酶链反应(dPCR)进行浓度定值,实时荧光定量聚合酶链反应(RQ-PCR)进行均匀性和稳定性研究,最终应用《测量不确定度表示指南》评定测量不确定度。结果质粒候选参考物质拷贝数浓度为(2.50±0.35)×10^6拷贝/μL,有较好的均匀性和稳定性。结论建立了制备BCR-ABL1候选参考物质的方法,构建了均匀稳定的BCR-ABL1候选参考物质。

BCR-ABL融合基因检测试剂盒质控品的建立

目的:建立BCR-ABL融合基因质控品,评价人类BCR-ABL融合基因突变检测试剂盒的性能。方法:根据人类BCR-ABL e1a2和e14a2型融合基因m RNA序列,设计覆盖断裂点序列,合成目的融合基因序列。用限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ对含有目的融合基因的质粒和表达载体进行酶切,连接酶切产物。将连接产物转化DH5α感受态细胞,筛选单个阳性菌落进行验证。将正确的单个菌落进行超声诱导,制备假病毒溶液。用荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法对假病毒溶液提取的RNA进行检测。结果:PCR结果和测序结果表明成功构建人类BCR-ABL融合基因e1a2和e14a2型假病毒质粒;荧光RT-PCR结果表明构建的e1a2和e14a2型假病毒质粒能够表达目的 RNA,并且能被市售试剂盒正确检出,可以作为RNA质控品。结论:本研究建立人类BCR-ABL融合基因RNA质控品,用于评价BCR-ABL融合基因突变检测试剂盒的性能,为BCR-ABL融合基因相关白血病的临床诊断及靶向治疗提供指导。

坤泰胶囊对卵巢储备功能下降大鼠卵巢凋亡调控蛋白Bcl-2,Bax表达的影响

目的:探讨坤泰胶囊对去氧乙烯基环己烯(4-vinylcyclohexene diepoxide,VCD)所致卵巢储备功能下降(decreasing ovarian reserve,DOR)大鼠凋亡调控蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达的影响,研究该药的作用机制。方法:SD雌性大鼠连续腹腔注射VCD(80 mg·kg^(-1))15 d,建立与人类相似的生理性卵巢储备功能下降模型。将动物分为正常组,模型组,坤泰胶囊高、中、低剂量组(1.89,0.63,0.21 g·kg-1),补佳乐(戊酸雌二醇,0.13 mg·kg^(-1))组,于造模第1天开始灌胃给药,每天1次,连续45 d。酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测大鼠血清激素卵泡刺激素(FSH),黄体生成素(LH)及雌二醇(E2)水平,苏木素-伊红(HE)染色观察卵巢、子宫的病理组织变化,蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测卵巢组织Bcl-2,Bax蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组FSH与LH明显升高,E_2明显降低(P<0.05);模型组卵巢、子宫体积明显缩小,原始卵泡与初级卵泡数目明显减少,子宫内膜变薄,腺体数目减少;模型组大鼠卵巢Bcl-2蛋白表达明显减少,Bax蛋白表达明显增加(P<0.05),Bcl-2/Bax显著下降(P<0.01)。与模型组比较,坤泰胶囊高、中、低剂量组FSH明显降低,E_2明显升高(P<0.05);补佳乐组FSH,LH明显降低,E2明显升高(P<0.05)。各给药组卵巢、子宫体积增大,原始卵泡与初级卵泡数目增多,子宫内膜变厚,腺体数目增加,改善程度顺序依次为坤泰胶囊低、中、高剂量组、补佳乐组。坤泰胶囊高、中、低剂剂量组及补佳乐组大鼠卵巢Bcl-2蛋白表达明显增加(P<0.05,P<0.01);坤泰胶囊高、中、低剂量组及补佳乐药组大鼠卵巢Bax蛋白表达减少(P<0.05);坤泰胶囊高、中、低剂量组及补佳乐组大鼠卵巢Bcl-2/Bax升高(P<0.05,P<0.01)。结论:坤泰胶囊可能通过上调卵巢Bcl-2蛋白表达及下调Bax蛋白表达,抑制卵泡的凋亡,从而改善卵巢功能。

甘草酸预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及Bcl-2和Bax表达的影响

目的：观察甘草酸预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI）的保护作用及B细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因（B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein,Bax）表达的影响,探讨其可能机制。方法：50只SD大鼠随机分为假手术组,心肌缺血再灌注损伤组（模型组）,甘草酸预处理低、中、高剂量组。采用结扎左冠状动脉前降支建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。假手术组穿线后不结扎;模型组于缺血前30 min腹腔注射2 mg·kg-1生理盐水;甘草酸低、中、高剂量组于缺血前30 min腹腔注射2,4,10 mg·kg-1甘草酸。光镜下观察心肌组织的病理组织学变化;检测肌酸激酶同工酶（CK-MB）活性,乳酸脱氢酶（LDH）活性,心肌肌钙蛋白-T（c Tn T）水平,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平,白细胞介素-6（IL-6）水平,髓过氧化物酶（MPO）活性,超氧化物歧化酶（SOD）活性,谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性,丙二醛（MDA）水平;末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记测定法（TUNEL）检测心肌细胞凋亡指数;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测心肌Bcl-2和Bax的表达。结果：与模型组比较,甘草酸预处理低剂量组、中剂量组、高剂量组明显减轻心肌缺血再灌注损伤;与模型组比较,甘草酸预处理低剂量组、中剂量组、高剂量组显著降低CKMB,LDH,c Tn T,TNF-α,IL-6,MPO,MDA水平,显著升高SOD,GSH-Px活性（P〈0.05,P〈0.01）;与模型组比较,甘草酸预处理低剂量组,中剂量组,高剂量组显著降低心肌细胞凋亡指数（P〈0.01）;与模型组比较,甘草酸预处理低、中、高剂量组显著上调心肌Bcl-2表达,下调Bax表达及上调Bcl-2/Bax（P〈0.05,P〈0.01）。结论：甘草酸预对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,且能上调心肌Bcl-2表达和下调心肌Bax表达,从而抑制细胞心肌凋亡。