基于转录组和DNA甲基化组的白鲜碱致小鼠肝损伤的性别差异研究

背景白鲜碱是中药白鲜皮的主要成分,具有肝毒性,可诱导肝损伤。临床发现,白鲜碱致肝损伤的发病率女性高于男性。目的绘制DNA甲基化组及转录组图谱,探索白鲜碱致肝损伤性别差异的调控机制。方法构建白鲜碱诱导的肝损伤雌性和雄性小鼠模型,对小鼠肝进行转录组测序(RNA-sequencing,RNA-seq)和全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite sequencing,WGBS),探究雌性与雄性小鼠肝经白鲜碱诱导损伤后的差异信号通路和DNA甲基化调控的变化。结果白鲜碱会额外激活雌性小鼠肝的外源性药物分解代谢及脂肪酸代谢,并导致雌性小鼠肝全局性的DNA高甲基化。行使外源性药物分解代谢、脂肪酸代谢的核心基因Cyp2d9,Cyp2c67因基因体区域发生DNA高甲基化(diff.Methy=0.326,diff.Methy=0.355)而被促进表达(log2FC=4.247,P<0.001;log2FC=3.331,P<0.001)。结论白鲜碱导致雌性小鼠肝发生全局性的DNA高甲基化,从而上调肝分解代谢外源性药物、脂肪酸等功能,可能是白鲜碱导致雌性小鼠更易发肝损伤的原因。

白鲜皮中白鲜碱的提取工艺优化研究

通过单因素、正交实验设计优化白鲜皮中白鲜碱的提取工艺,白鲜碱作为对照品,制作标准曲线,采用高效液相色谱仪测定白鲜碱的含量。结果显示以乙醇作为溶剂时,白鲜碱的最佳提取工艺是乙醇浓度为90%,提取时间为1.5 h,料液比为1∶4,温度为70℃,在最佳提取工艺下,白鲜皮醇提取液中白鲜碱的含量为0.94 mg/g。标准曲线回归方程为y=215315x+740.97,R^(2)=0.999,在0.0005~0.02 mg/mL范围内呈良好线性关系。本工艺方法操作简便,易实现,为下一步提取白鲜碱进一步活性研究提供依据。

白鲜皮主要药效成分白鲜碱、黄柏酮、梣酮的抗皮炎作用比较及机制研究

目的:比较中药白鲜皮的3种主要活性成分白鲜碱、黄柏酮、梣酮在特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)治疗中的作用并探讨其机制。方法:利用2,4⁃二硝基氟苯(2,4⁃dinitrofluorobenzene,DNFB)构建小鼠皮炎模型,观察白鲜皮醇提物、白鲜碱、黄柏酮、梣酮、地塞米松对AD小鼠引起的慢性瘙痒的作用;采用皮损评分评估小鼠皮损严重程度。苏木精⁃伊红(hematoxy⁃lin⁃eosin,HE)和甲苯胺蓝染色评估小鼠表皮厚度和肥大细胞数目。酶联免疫吸附试验(enzyme⁃linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠皮损组织中白介素(interleukin,IL)⁃4、IL⁃31、IL⁃10水平;Western blot检测Janus激酶(janus kinase,JAK)1、p⁃JAK1、信号转导和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)3、p⁃STAT3、STAT6、p⁃STAT6的蛋白水平。结果:AD小鼠引起的慢性瘙痒能明显被白鲜皮醇提物抑制。与模型组相比,白鲜皮的3种主要活性成分中:白鲜碱和梣酮能明显抑制AD小鼠引起的慢性瘙痒,改善皮损症状和炎症细胞浸润,下调IL⁃4、IL⁃31水平,上调IL⁃10水平,并抑制JAK1⁃STAT3/STAT6信号通路,但黄柏酮组与模型组比较差异无统计学意义。结论:白鲜碱和梣酮可能是白鲜皮发挥抗皮炎作用的主要活性成分。

短刺小克银汉霉AS 3.970对白鲜碱的微生物转化

目的采用短刺小克银汉霉AS 3.970(C.blakesleana AS 3.970)对白鲜碱展开微生物转化研究。方法利用30株丝状真菌对白鲜碱进行微生物转化,筛选出转化效果好的菌株;然后在该菌株微生物转化试验中考察接种量、转化温度、培养基pH值、转化时间等不同因素对白鲜碱微生物转化作用的影响,选择出最优的转化条件;在最优转化条件下,规模制备白鲜碱的微生物转化产物并进行结构鉴定。结果短刺小克银汉霉AS 3.970对白鲜碱的微生物转化效果好,在微生物转化研究中发现白鲜碱转化的最优条件是转化温度为28℃,培养基初始pH值为7.0,最适接种量5%(体积分数),转化时间为7 d;通过分离纯化和结构鉴定,最终得到两个主要转化产物,分别是4-甲氧基-2,3-二氢呋喃喹啉与3-(2-羟乙基)-4-甲氧基喹啉酮。结论通过微生物转化技术可以对白鲜碱进行微生物结构修饰。

白鲜碱靶向调控PI3K/KEAP1信号抑制卵巢癌细胞增殖并诱导自噬及凋亡

目的探讨白鲜皮活性单体白鲜碱(Dictamnine)对卵巢癌细胞增殖、凋亡和自噬的影响及其作用机制。方法人卵巢癌细胞系(A2780、PA-1)及人正常卵巢上皮细胞株(IOSE80)分别用不同浓度白鲜碱(0、32、65、125、250μmol/L)处理,CCK-8实验检测各细胞IC50值。利用网络药理学筛选出白鲜碱治疗卵巢癌的核心靶点,分子对接评估结合能力。选取A2780细胞用白鲜碱(0、50、75μmol/L)处理后,利用CCK-8实验、HE染色、Annexin V-FITC/PI双染法、Western blot法分析白鲜碱对A2780细胞增殖、凋亡和自噬的影响。裸鼠皮下移植瘤模型观察白鲜碱对卵巢癌移植瘤生长的影响,HE染色和透射电子显微镜观察移植瘤组织形态及超微结构,免疫组化染色(IHC)检测移植瘤组织中Cleaved PARP、Ki67的表达水平。结果CCK-8实验结果显示,白鲜碱作用于A2780细胞、PA-1细胞的IC50显著低于IOSE80细胞,其中对A2780细胞的抑制作用最强;白鲜碱(50μmol/L、75μmol/L)处理组的A2780细胞增殖能力较未处理细胞明显下降(均P<0.05)。网络药理学筛选出10个白鲜碱抗卵巢癌的核心靶点,结合能力较强的靶点为PIK3CD、KEAP1、AHR。流式细胞术结果显示白鲜碱处理48 h、72 h后A2780细胞凋亡率均明显上升(均P<0.01)。Western blot实验显示,与未处理组相比,白鲜碱处理组的A2780细胞中凋亡相关蛋白Cleaved PARP、PARP表达水平明显升高;自噬相关蛋白SQSTM1/p62、KEAP1表达水平下降,LC3BⅡ/Ⅰ比例升高;PI3K信号通路蛋白PI3K表达水平下降(均P<0.05)。白鲜碱处理后,裸鼠移植瘤体积明显减小(P=0.0053);镜下可见瘤组织有明显凋亡细胞;IHC染色结果显示Ki67表达水平降低,Cleaved PARP表达水平上升(均P<0.001)。HE染色结果显示白鲜碱处理后A2780细胞呈短纺锤形或卵圆形,且体积变小;移植瘤组织中存在凋亡/坏死细胞。结论白鲜碱可能靶向调控PI3K/KEAP1信号转导抑制卵巢癌细胞增殖并诱导自噬及凋亡。

白鲜碱及其衍生物的研究进展

白鲜碱是一种具有多种生物活性的天然产物,可以从多种植物中分离得到,也可以人工合成获得。在自然界中存在着具有与白鲜碱结构相类似的生物碱,人们对这类生物碱进行结构修饰和改造,得到了一些具有良好生物活性的衍生物。本文对白鲜碱及其衍生物的研究进展进行综述,并对白鲜碱及其衍生物的研发前景进行了展望。

从白鲜皮中同时制备梣酮、白鲜碱、黄柏酮单体的方法

以HPLC测定计算的梣酮、白鲜碱、黄柏酮3种单体的总单体得率为指标,探讨了提取溶媒、提取方式、提取时间、液料比和提取次数对提取效果的影响,并运用正交试验对提取工艺进行优选;提取得到的浸膏进行一次硅胶柱层析和重结晶即分离纯化出3种单体;单体经波谱方法进行结构鉴定,经TLC和HPLC进行纯度检查和含量测定。结果显示,最佳的提取工艺为加入药材重量6倍的乙酸乙酯回流提取3次,每次1 h;分离纯化后的3种单体纯度高,用其作为对照品对白鲜皮药材进行含量测定结果满意。实验表明提取工艺及分离方法能同时制备3种单体,方法简单快速,单体的纯度和回收率高。

白鲜碱体外抗白色念珠菌活性研究

白色念珠菌等真菌是能够引起人类及动物患病的重要致病菌,测定了白鲜碱对临床22株临床分离氟康唑耐药白色念珠菌的最小抑菌浓度(MIC),采用棋盘式微量稀释试验测定了两药联合应药的分级抑制浓度指数(ractional inhibitory concentration index,FICI)值。结果表明,白鲜碱有较好的抗白色念珠菌活性且与氟康唑有协同作用。

HPLC法测定白鲜皮中白鲜碱的含量

目的:建立白鲜皮中白鲜碱的含量测定方法。方法:用乙醇超声提取,以M erk C18色谱柱为固定相,甲醇-水(52∶48,v/v)为流动相,检测波长为220 nm。结果:在0.3104μg^3.1040μg范围内,白鲜碱的峰面积与进样量有良好的线性关系,r=0.9999;平均回收率为98.91%,RSD=1.5%。结论:该法准确可靠、重现性好,操作简便快速。

白鲜营养器官解剖结构及其与白鲜碱的积累关系

应用植物解剖学、组织化学及植物化学方法对白鲜营养器官根、茎、叶的结构及其生物碱的积累进行了研究。结果显示:(1)白鲜根的次生结构以及茎和叶的结构类似一般双子叶植物;白鲜多年生根主要由周皮、次生韧皮部、维管形成层以及次生木质部组成,根次生韧皮部中可见大量的淀粉、草酸钙簇晶、韧皮纤维以及油细胞;茎由表皮、皮层、维管组织和髓组成;叶由表皮、栅栏组织、海绵组织和叶脉组成;在茎和叶初生韧皮部的位置均分布有韧皮纤维,在叶表皮上分布有头状腺毛和非腺毛;在茎和叶紧贴表皮处分布有分泌囊。(2)组织化学分析结果显示:在白鲜多年生根中,生物碱类物质主要分布在周皮、次生韧皮部、维管形成层和木薄壁细胞中;在茎中,生物碱主要分布在表皮、皮层、韧皮部、木薄壁细胞及髓周围薄壁细胞中;在叶中,生物碱主要分布在表皮细胞、叶肉组织和维管组织的薄壁细胞;此外在分泌囊和头状腺毛中亦含有生物碱类物质。(3)植物化学结果显示,秦岭产白鲜根皮/白鲜皮、根木质部、茎和叶中白鲜碱含量分别为0.041%、0.012%、0.004%和0.002%,其中木质部中白鲜碱含量和其他部分地区白鲜皮中白鲜碱含量类似。研究表明,在秦岭产白鲜营养器官中,除根皮/白鲜皮外,在根木质部亦含有大量的白鲜碱,且在茎和叶中亦含有一定的白鲜碱,具有潜在的开发利用价值。

利用Caco-2细胞模型研究白鲜碱和茵芋碱在人小肠的吸收

目的:研究中药化学成分白鲜碱和茵芋碱的人小肠吸收情况。方法:利用人源结肠腺癌细胞系Caco-2细胞单层模型观察白鲜碱和茵芋碱由绒毛面(AP端)到基底面(BL端)、BL端到AP端2个方向的转运过程。应用偶联紫外检测器的高效液相色谱法对上述2种生物碱进行定量分析,计算转运参数和表观渗透系数,并与阳性对照药普萘洛尔和阿替洛尔进行比较。结果:由AP端到BL端,白鲜碱和茵芋碱的表观渗透系数(Papp)分别为(1.59±0.14)×10-5cm.s-1和(3.19±0.09)×10-5cm.s-1;由BL端到AP端,白鲜碱和茵芋碱的Papp分别为(2.57±0.33)×10-5cm.s-1和(5.86±0.49)×10-5cm.s-1,与在Caco-2单层细胞模型上呈良好吸收的阳性对照药普萘洛尔的基本一致。结论:白鲜碱和茵芋碱可以通过小肠上皮细胞被动吸收进入体内,属于吸收良好的化合物。

化妆品中黄芩苷与白鲜碱的超高效液相色谱检测及质谱确证

建立了化妆品中黄芩苷和白鲜碱的超高效液相色谱（UPLC）检测方法和超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱仪（UPLC-Q-TOF）的质谱确证方法.不同基质类型的化妆品经甲醇-磷酸缓冲溶液（9∶1,pH 2.5）超声提取,氯化钠破乳化,以乙腈-0.1％甲酸水溶液为流动相,梯度洗脱,利用Waters CSH C18（2.1 mm ×l00 mm,1.7 μm）色谱柱对目标物和样品杂质进行有效分离,以314 nm为检测波长进行定量测定.黄芩苷和白鲜碱在0.05～10 mg/L范围内均呈良好线性,相关系数大于0.999,方法的回收率为92.2％～103.1％,相对标准偏差小于4％,方法检出限均为0.3 mg/kg.同时建立了对黄芩苷和白鲜碱的UPLC-Q-TOF质谱确证方法,通过一个母离子和子离子的精确质量数对黄芩苷和白鲜碱进行确证,分子质量精确度小于5 ppm,并结合紫外吸收光谱、精确质量数及同位素匹配对黄芩苷的降解产物进行了结构确定.

HPLC法同时测定白鲜皮中γ-崖椒碱和白鲜碱的含量

目的建立同时测定白鲜皮药材中2种生物碱含量的HPLC方法,并测定不同产地白鲜皮药材中生物碱的含量,为白鲜皮药材质量控制提供科学依据。方法色谱柱：Diamonsil C18柱（200 mm×4.6 mm,5μm）,流动相：乙腈-水（体积比为40∶60）,流速：1.0 mL.min-1,检测波长：240nm。结果γ-崖椒碱和白鲜碱能够达到基线分离。γ-崖椒碱质量浓度在2.4-72.0 mg.L-1（r=0.9998）内,白鲜碱质量浓度在7.2-216.0 mg.L-1（r=0.9997）内与峰面积呈良好的线性关系;γ-崖椒碱和白鲜碱的回收率分别为100.2%、99.9%,RSD分别为1.7%、1.5%。结论所建立的方法可用于白鲜皮的质量控制。

白鲜碱对小鼠脾淋巴细胞活力的体外抑制作用及机制研究

目的:研究白鲜碱对小鼠脾淋巴细胞活力的体外抑制作用并探讨其可能的作用机制。方法:分离并培养小鼠原代脾淋巴细胞,以0(空白对照)、50、100、150μmol/L白鲜碱作用细胞24 h后,采用MTT法检测细胞活力,乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞LDH释放率,流式细胞术检测细胞早期凋亡率,Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)双染法检测细胞坏死率,Western blot法检测细胞中胱天蛋白酶3(Caspase 3)、剪切体Caspase 3(Cleaved-Caspase 3)蛋白表达水平以及彗星试验法检测细胞DNA损伤(以DNA拖尾区域比例反映)。结果:与空白对照比较,100、150μmol/L白鲜碱可显著抑制细胞活力(P<0.01);150μmol/L白鲜碱可显著增加细胞LDH的释放(P<0.05),释放率达到79.37%;50、100、150μmol/L白鲜碱均可提高细胞的早期凋亡率,但差异均无统计学意义(P>0.05);150μmol/L白鲜碱可显著增加细胞坏死率(P<0.05),坏死率达到78.64%;50、100、150μmol/L白鲜碱均可升高Caspase 3蛋白表达水平,但差异均无统计学意义(P>0.05),然而50、100μmol/L白鲜碱可显著提高Cleaved-Caspase 3蛋白表达水平(P<0.05);白鲜碱可呈剂量依赖性地引起DNA损伤,其中100、150μmol/L白鲜碱可显著增加DNA拖尾区域比例(P<0.01)。结论:白鲜碱可以抑制脾淋巴细胞活力,其作用机制可能与诱导脾淋巴细胞坏死和造成DNA损伤有关。

HPLC法同时测定白鲜皮中白鲜碱、黄柏酮和梣酮的含量

目的：建立RP-HPLC同时测定白鲜皮中白鲜碱、黄柏酮和腀酮含量的方法。方法：采用RP-HPLC,70%乙醇超声提取,色谱条件：色谱柱AlltimaC18（4.6mm×250mm,5μm）,保护柱All-GuardTM C18（4.6mm×7.5mm,5μm）,流动相乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱,流速1.0mL/min,进样量10μL,柱温25℃,检测波长238nm。结果：该3种成分分离良好,线性范围依次为0.4～16.0,10～400和1.6～64.0mg/L,加样回收率分别为99.95%,98.91%,100.02%,RSD分别为：1.81%,1.83%,2.62%。结论：本方法简单、快捷,重现性好,准确率高,可用于白鲜皮药材的质量控制。

HPLC法同时测定白鲜皮配方颗粒中白鲜碱、黄柏酮和梣酮的含量

目的:建立同时测定白鲜皮配方颗粒中白鲜碱、黄柏酮和梣酮含量的方法。方法:色谱柱为Agilent Extend C18(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-水(55:45),流速为1.0 m L·min-1,检测波长为236 nm,柱温为室温,自动进样器进样,进样量10μL。结果:白鲜碱在2.505-40.08μg·m L-1质量浓度范围内与峰面积具有良好的线性关系(R2=0.999 7,n=5),平均回收率为99.04%(RSD=1.51%,n=6);黄柏酮在26.12-418.0μg·m L-1质量浓度范围内与峰面积具有良好的线性关系(R2=0.999 8,n=5),平均回收率为99.48%(RSD=2.25%,n=6);梣酮在7.540-120.6μg·m L-1质量浓度范围内与峰面积具有良好的线性关系(R2=0.999 8,n=5),平均回收率为99.54%(RSD=2.09%,n=6)。结论:本法操作方便,结果准确,精密度好,专属性强,可用于白鲜皮配方颗粒的质量控制。

白鲜皮中白鲜碱含量测定

白鲜皮中白鲜碱含量测定朱丹妮徐强邱南生（中国药科大学，南京２１００３８）ＴｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｄｉｃｔａｍｉｎｅｉｎｒｏｏｔｂａｒｋｏｆＤｉｃｔａｍｎｕｓｄａｓｙｃａｒｐｕｓＴｕｒｃｚ．ＺｈｕＤａｎＮｉ，Ｘｕ...

白鲜碱通过Wnt/β-catenin信号通路抑制前列腺癌骨转移PC-3细胞的作用

目的探讨白鲜碱对人前列腺癌细胞上皮-间充质转化的抑制作用及其机制。方法培养人前列腺癌PC-3细胞,用白鲜碱处理PC-3细胞,通过MTS检测白鲜碱的半抑制浓度IC50及对PC-3细胞增殖的时间依赖性。细胞侵袭能力的检测采用Transwell实验;E-cadherin、vimentin、β-catenin和Snail蛋白表达水平的检测采用Western blot实验;使用Wnt通道激活剂(LiCl)和白鲜碱联合作用PC-3细胞后,通过Western blot实验检测Snail和E-cadherin的m RNA及蛋白表达。结果 Transwell实验结果表明,与对照组相比,白鲜碱作用PC-3细胞后侵袭能力下降(P<0.01)。PCR及Western blot的结果表明,白鲜碱作用PC-3细胞后E-cadherin的mRNA及蛋白表达升高,vimentin和Snail及细胞核中β-catenin mRNA及蛋白的表达降低(P<0.01)。与白鲜碱组比较,白鲜碱与Li Cl联合作用PC-3细胞后Snail mRNA及蛋白表达升高,E-cadherin mRNA及蛋白表达降低(P<0.01)。结论白鲜碱可能通过抑制Wnt/β-catenin/Snail信号通路而抑制PC-3细胞上皮-间充质转化。

利用全基因组芯片研究新型保鲜剂白鲜碱的抗真菌转录组学

白鲜碱,一种从植物白鲜中分离的生物碱成分,具有抗微生物的活性,可作为天然食品保鲜剂。本试验应用寡核苷酸芯片从全基因组水平考察了白鲜碱对模式真菌酿酒酵母表达谱的影响,用聚类软件T-profiler,分析了基因芯片数据。结果表明:889个基因差异表达(表达倍数≥2倍),其中511个基因上调,378个基因下调。一些主要的转录反应如DNA复制和重组等相关基因受到白鲜碱的影响。

白鲜皮中白鲜碱薄层扫描测定

白鲜皮中白鲜碱薄层扫描测定郑力行，王志伟，吴钢，田玲（上海医科大学药学院药物分析教研室，药学院生药学教研室２０００３２）白鲜皮为芸香科植物白鲜ＤｉｃｔａｍｎｕｓｄａｓｙｃａｒｐｕｓＴｕｒｃｚ的干燥根皮，具有清热燥湿、祛风解毒等功效。用于治疗湿热疮毒、...