应用多重RT-PCR检测百合无症病毒和百合斑驳病毒

根据病毒外壳蛋白基因序列,设计了2对检测百合无症病毒(LSV)、百合斑驳病毒(LMoV)的引物,对扩增条件进行优化,建立了同时检测LSV和LMoV的多重RTPCR检测方法。此方法可特异地从带有LSV和LMoV的样品中扩增出2条带LSV(876bp)、LMoV(662bp)。灵敏性测定结果表明,该双重PCR可从稀释104组织中检测出病毒,具有与单一PCR相同的灵敏性。扩增产物测序表明,LSV扩增产物与其它分离物核苷酸同源性为87.8%～99.3%,LMoV扩增产物与其它分离物的同源性为90.1%～99.5%。

百合无症病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR检测

应用DAS-ELISA,RT-PCR和IC-RT-PCR技术检测百合无症病毒(LSV)。结果表明:RT-PCR和IC-RT-PCR分别可从2ng和200ng百合叶片组织中检测出LSV,分别是DAS-ELISA敏感度的1000倍和10倍。百合鳞茎的不同取样部位对PCR检测结果的影响较大,RT-PCR难以从鳞片和根部检测出病毒,但IC-RT-PCR可以检测出病毒。

百合无症病毒云南分离物的CP基因克隆和序列分析

百合无症病毒Lily symptomless virus(LSV)为麝香石竹潜隐病毒属(carlavirus)成员,是为害百合的主要病毒之一.

百合无症病毒单克隆抗体制备及快速检测方法的建立

百合无症病毒(Lily symptomles virus,LSV)属于线形病毒科(Flexiviridae)、麝香石竹潜隐病毒属 (Carlavirus),是危害百合的主要病毒之一。LSV 的寄主范围很窄,只限于百合科(Liliaceae)植物, 单独侵染百合常为隐症,与其他病毒复合侵染时产生花叶、畸形、坏死斑等症状,严重影响百合切花的经济价值。近年来,我国百合种植规模不断扩大, 病毒病发生日趋严重。为了防止病毒随种球扩散与传播,迫切需要建立灵敏、快速的病毒检测方法。我们在百合病毒分子生物学研究的基础上,首次成功制备了LSV单克隆抗体,建立了以单抗为核心的间接抗原包被ELISA(ACP-ELISA)、三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)、免疫斑点法(Dot-ELISA) 和组织印迹法(Tissue blot-ELISA)等快速检测 LSV的方法。

单抗I-ELISA和TAS-ELISA检测百合无症病毒的研究

以抗百合无症病毒(Lily symptom less virus,LSV)的单克隆抗体为核心,建立了间接ELISA(I-ELISA)和三抗体夹心ELISA(TAS-ELISA)的检测方法。I-ELISA检测体系中,病叶汁液和单克隆抗体腹水的工作浓度分别为1∶20和1∶6 000,对病叶汁液的检测灵敏度达到了1∶2 560,可检测到提纯病毒绝对量为1.35 ng。TAS-ELISA检测体系中捕获抗体和单克隆抗体腹水的工作浓度分别为1∶200和1∶6 000,检测病叶汁液的灵敏度达到了1∶5 120,对于提纯病毒可检测到0.68 ng。使用美国Agd ia公司双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测试剂盒对病叶汁液的检测灵敏度为1∶2 560,提纯病毒检出量1.35 ng。用3种ELISA方法检测了采自浙江省丽水市的46个田间样品,I-ELISA、TAS-ELISA和DAS-ELISA测出的阳性样品数分别为19、21和18个,阳性率为41%、46%和39%。灵敏度检测和田间样品检测结果显示,TAS-ELISA的灵敏度高于DAS-ELISA和I-ELISA。相同样品I-ELISA所测出的OD405值和P/N值普遍高于DAS-ELISA,表明LSV单抗比多抗具有更强的特异性和更高的灵敏度。

单抗免疫斑点法和组织印迹法检测百合无症病毒

应用抗百合无症病毒(Lilysymptomlessvirus,LSV)的单克隆抗体,建立了快速检测田间样品的免疫斑点法(Dot-ELISA)和组织印迹法(Tissueblot-ELISA)体系。LSV单抗稀释2,000倍时,Dot-ELISA中病叶粗汁液可被检出的最大稀释度为1∶640。Tissueblot-ELISA中样品一次平切后第1次印迹与Dot-ELISA样品1∶40稀释的结果相当,前4次印迹均可获得满意的显色效果。常规Tissueblot-ELISA的灵敏度低于Dot-ELISA,但用丙酮处理点过样的硝酸纤维素膜后,二者的灵敏度相当,且Tissueblot-ELISA操作更简便,适合田间大量样品的快速检测。

百合无症病毒衣壳蛋白基因克隆和蛋白分析

根据已报道的LSV CP基因序列合成两条寡聚核苷酸引物,模板为感染LSV的百合叶片的总RNA,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出大小为876bp的LSV CP基因,经测序后,对该基因编码区全长序列及相应的氨基酸序列用生物信息学软件系统进行序列分析及结构功能预测.结果表明:该基因由876个核苷酸组成,编码291个氨基酸;与GeneBank公布的其他LSV分离物的基因序列同源性为93.4%～99.0%,氨基酸同源性为84.8%～99.5%;它含有一个卷曲螺旋结构和多个磷酸化位点,平均疏水值为-0.432;含有Carlaviruses完整的衣壳蛋白保守结构域,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主.

百合无症病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立

百合无症病毒(Lily symptomless virus,LSV)是侵染百合科植物的主要病毒之一。根据该病毒不同分离株外壳蛋白基因(coat protein,CP)的保守序列,设计特异性引物与荧光探针,建立了LSV的实时荧光RTPCR检测方法。利用该方法检测LSV的2个阳性样品,均能够得到典型扩增曲线,而在百合斑驳病毒、烟草环斑病毒、番茄环斑病毒等其他病毒阳性样品中没有典型的扩增曲线,表明了该方法的特异性。与普通RTPCR法相比,此方法灵敏度提高10倍。应用该方法,2012年6月至今,宁波出入境检验检疫局从荷兰进境的67批百合种球样品中检出53批百合无症病毒阳性,检出率为93%。

百合无症病毒的RT-PCR检测

以百合病株为材料,针对百合无症病毒(LSV)的CP基因序列,设计合成了一对特异引物,并通过RT-PCR技术扩增出与预期大小相一致的870 bp片段,而对照无任何产物,应用该方法对田间百合中的LSV的带毒情况进行检测,检出率达80%,检测灵敏度高,专一性强,为百合的病毒检测提供了一种分子生物学检测方法.

百合无症病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用百合无症病毒(Lilysymptomlessvirus,LSV)免疫的BALBC鼠脾细胞与SP20鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得4株能稳定传代并分泌抗LSV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞(2A2、5H9、5H2和5E12),并分别制备它们的单抗腹水。4株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-6,5H9和5E12的抗体类型及亚类均为IgG1,而2A2和5H2均为IgG3,4株单克隆抗体的轻链均为κ链。利用单克隆抗体建立了抗原包被间接ELISA(ACP-ELISA)检测LSV的方法。病叶作1300倍稀释、提纯LSV病毒浓度为18ngmL(每孔的病毒绝对量为1.8ng)时,该方法仍能检测到病毒。利用ACP-ELISA检测了田间样品,发现LSV在百合上发病很普遍。

基因芯片在百合无症病毒检测中的应用

设计百合无症病毒、植物18SrRNA基因的特异扩增引物和各种对照的探针,将探针固定在醛基化玻璃片基上,完成植物基因芯片制备。提取百合种球总RNA,经RT-PCR扩增相应区段并用Cy3dCTP进行标记,用标记的PCR产物与芯片杂交,扫描仪对杂交结果进行扫描,GenePix Pro4.0软件对杂交图像进行分析。结果从荷兰进口的百合种球中检测出百合无症病毒,证明了该实验研制的植物病毒基因芯片的准确性和灵敏性。

百合无症病毒CP基因在大肠杆菌中的表达

应用RT-PCR 方法从感病百合总RNA中扩增出百合无症病毒的外壳蛋白基因片段,连接到原核载 体pUC19,转化大肠杆菌DH5α并用IPTG诱导表达。SDS—PAGE及Western blot分析表明,CP基因在大肠肝 菌中获得了特异性表达,融合蛋白分子量约为35kD。

龙山卷丹百合无症病毒的检测

以龙山卷丹百合的病叶作为试材,采用DAS-ELISAS检测法对样品进行百合无症病毒的检测,检出率为58.3%;提取总RNA为模板,通过RT-PCR扩增其外壳蛋白基因,大小为287 bp,和预期条带大小一致。经Blast比对发现,该基因片段与Genbank上发表的LSV CP基因序列同源性达92%以上。

利用RT-PCR和Dig-cDNA探针检测百合无症病毒

根据百合无症病毒(LSV)的核苷酸序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR技术扩增得到了一条与目的片段大小一致的条带;进一步克隆测序表明,该序列与已知的LSV序列有96%的同源性。用随机引物法合成地高辛标记的cDNA探针,建立了核酸斑点杂交检测体系。本研究分别建立了用于LSV的特异性的高灵敏度RT-PCR检测体系(其检测灵敏度为1.4ng/叶片)和适合大通量检测的Dig-cDNA(地高辛标记)核酸斑点杂交检测体系(其检测灵敏度为20μg/叶片)。

百合无症病毒检测方法研究进展

综述了百合无症病毒病原学、病害流行学和分子生物学的研究进展;系统总结了目前常用的百合无症病毒快速检测方法和技术——免疫电镜法、酶联免疫吸附法、核酸分子杂交技术、反转录PCR技术等。

百合无症病毒检测方法的研究

[目的]建立从百合种球幼芽中直接检测百合无症病毒(LSV)的体系。[方法]通过DAS-ELISA和一步法RT-PCR两种方法对百合种球幼芽和百合植株叶片中的百合无症病毒(LSV)进行对比检测研究。[结果]从百合种球幼芽和叶片中均可用DAS-ELISA检测到LSV,且两种方法检测阳性结果表现高度一致性。[结论]两种方法均可实现对百合无症病毒LSV的检测,但DAS-ELISA法更经济,更便于操作。

侵染厦门百合的百合无症病毒的鉴定及其分子检测

百合无症病毒(Lily symptomless carlavirus, LSV)属于香石竹潜隐病毒组(Carlavirus),是单链正义RNA病毒。基因组全长为8 394 bp,共有6 个开放阅读框(Open reading fragment,ORF),分别编码RNA依赖的RNA复制酶,三基因连锁结构, 外壳蛋白和16 kD核酸结合蛋白。主要侵染百合属、郁金香属植物,通常在百合上不产生明显症状,与黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)复合侵染时,导致叶片出现坏死斑。LSV 是危害百合的重要病毒,在世界各地都有分布。近年来国内陆续有该病毒病的报道,其发病率一般在40％-50％,二代种球的带毒率在90％以上, 严重制约了我国百合鲜切花的产量和质量,目前LSV已成为各口岸进出口百合种球的主要检疫对象。

百合无症病毒的ELISA检测

对两个百合品种应用ELISA检测法进行百合无症病毒检测,发现样品、阳性对照与底物的反应均表现出阳性,结果表明样品100%带有LSV病毒。

两种蚜虫携带百合无症病毒、烟草花叶病毒的基因芯片检测

蚜虫作为病毒的传播介体为害植物造成的经济损失远远超过蚜虫本身,因此急需建立快速、准确、灵敏的蚜虫带毒检测方法。根据百合无症病毒(LSV)和烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白基因保守序列设计引物与探针,制备基因芯片;用Cy3标记下游引物,提取饲毒(LSV和TMV)棉蚜、桃蚜总RNA,RT-PCR扩增产物与芯片杂交,荧光扫描仪检测并分析信号。结果表明,该芯片可以同时检测上述2种蚜虫的带毒情况,此方法有较好的特异性和重复性,能快速、准确地对介体蚜虫的带毒情况进行检测。

复合RT-PCR方法同步检测百合X病毒、百合无症病毒及百合斑驳病毒

建立了特异性检测百合X病毒(LVX)、百合无症病毒(LSV)及百合斑驳病毒(LMoV)的单一、双重及三重PCR体系并对各体系的灵敏度进行了研究。结果表明,单一PCR体系可检测的LVX最低浓度在1×10-7μg/mL,LSV最低浓度在1×10-8μg/mL,LMoV最低浓度在1pg/mL;双重PCR体系可明显检测的LVX、LSV最低浓度在1pg/mL,LSV、LMoV最低浓度在1ng/mL,LVX、LMoV最低浓度在1pg/mL;三重PCR体系可明显检测的LVX、LSV和LMoV的最低浓度为1ng/mL。