不同胁迫条件对百脉根农艺性状、生理指标及内源激素的影响

[目的]研究不同胁迫条件对百脉根农艺性状、生理指标及内源激素的影响。[方法]以百脉根为试验材料,通过配制不同的营养液设置低营养(low nutrition,LN)、高重碳酸盐(high bicarbonate,HB)、低磷(low phosphorus,LP)3种胁迫处理,以用蒸馏水配制的霍格兰营养液为空白对照(CK);在百脉根2~3叶时移栽入不同处理的营养液瓶中,每瓶5株苗,每个处理15瓶,每3 d换1次营养液,培养1个月后收获;测定并比较不同胁迫处理下百脉根的农艺性状指标、生理指标及内源激素含量;采用隶属函数分析法综合评价不同胁迫处理对百脉根农艺性状、生理指标及内源激素含量的影响,分析百脉根在不同胁迫条件下的生长状况。[结果]LP处理下百脉根株高最高;与CK相比,3种胁迫处理下百脉根的根长、根际直径、茎粗、根体积、分枝数、地上鲜重、地下鲜重、单株鲜重均降低,地上干物质含量和地下干物质含量均提高;LN处理下鲜重根冠比、干重根冠比最大。LN处理下百脉根主根根系活力最大,须根根系活力显著(P<0.05)高于其他处理。LP处理下叶部叶绿素含量显著(P<0.05)高于其他处理,HB处理下茎部叶绿素含量最高。3种胁迫处理下百脉根叶部蛋白质含量显著(P<0.05)低于CK,茎部蛋白质含量高于CK,叶部丙二醛含量显著(P<0.05)高于CK,茎部丙二醛含量显著(P<0.05)低于CK,叶部和茎部脯氨酸含量均高于CK。3种胁迫处理均可显著(P<0.05)降低百脉根茎部超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性,显著(P<0.05)提高茎部过氧化氢酶活性和叶部谷氨酰胺合成酶活性;HB和LP胁迫处理可显著(P<0.05)降低百脉根叶部超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性;LN和LP胁迫处理可显著(P<0.05)降低叶部过氧化氢酶活性,显著(P<0.05)提高茎部谷氨酰胺合成酶活性。与CK相比,3种胁迫处理下百脉根的乙烯(ACC)、茉莉酸及其衍生物(JA)含量均显著(P<0.05)降低,游离态细胞分裂素(CTK)、脱落酸(ABA)、赤霉素类(GAs)含量均显著(P<0.05)提高;除LP处理的ACC/BHA值外,3种胁迫处理下百脉根ACC与其他内源激素的比值均不同程度降低,部分比值已小于1。隶属函数分析法分析表明,百脉根综合长势排序为LP处理>CK>HB处理>LN处理。[结论]综合各项指标来看,低磷胁迫对百脉根生长的影响较小,高重碳酸盐和低营养胁迫对百脉根生长的影响较大。在低磷、高重碳酸盐和低营养胁迫下,百脉根可通过调整形态结构、激活抗氧化系统、平衡内源激素来调控其生长发育,从而适应不良环境。

基于百脉根两代基因组的LjR2R3-MYB家族比较鉴定

【目的】探明LjR2R3-MYB转录因子家族的结构和功能,为二代测序与三代测序的差异研究、百脉根转录因子发掘鉴定及LjR2R3-MYBs的调控功能鉴定提供参考。【方法】对二代测序(SGS)与三代测序(TGS)2个版本百脉根全基因组数据的LjR2R3-MYB转录因子进行鉴定分析,研究其成员组成、进化特征、基因结构、蛋白性质、空间结构、染色体定位、顺式作用元件等。【结果】在SGS和TGS版本中,LjR2R3-MYB家族分别有96个和135个成员,TGS的基因序列比SGS多3条保守基序;家族成员均属于14个亚族,TGS获得的独有序列比SGS多39条;SGS中有86条基因含有UTR,TGS中有78条,二者的LjR2R3-MYB成员motif类型存在差异;所有LjR2R3-MYB基因编码蛋白均为亲水性蛋白,不含信号肽,定位于细胞核,二级结构组成基本一致;SGS的0号染色体上分布有25条R2R3-MYB基因,TGS含有6条染色体且无0号染色体;LjR2R3-MYB基因启动子含有逆境胁迫、防御、激素以及生长发育响应等顺式作用元件。【结论】同SGS相比较,从TGS数据中获得的基因信息量更完整丰富,百脉根TGS组装质量高于SGS。

两种百脉根在云南省迪庆州高寒地区的适应性和生产性能评价

【目的】选育和推广适宜云南省高寒地区种植的百脉根品种。【方法】选取野生中甸百脉根和帝国百脉根为材料,对其在云南省迪庆州高寒地区的植株形态特征、生物量和生理指标进行了测定分析。【结果】帝国百脉根自然高度、拉直高度、叶长、叶宽、地上部分以及地下部分的鲜重干重均显著高于中甸(P<0.05),而茎叶比显著低于中甸(P<0.05)。生理分析表明:帝国百脉根根部丙二醛、脯氨酸含量显著低于中甸(P<0.05),而根部可溶性糖含量、超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性显著高于中甸(P<0.05)。二者叶片中可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量以及相对电导率差异并不显著(P>0.05)。【结论】综合分析认为帝国百脉根植株更高大,茎叶比小,牧用经济性高,适应性更强。在迪庆州香格里拉县试验基地或者在与其相似的地域和气候环境中种植,帝国百脉根的产量和适应性优于中甸百脉根。

根癌农杆菌介导的百脉根遗传转化体系的优化研究

百脉根(L otus corn icu la tus L.)是世界著名的多年生优良豆科牧草之一,也是常见的庭院观赏植物.本文通过比较不同根癌农杆菌转化百脉根的效率和优化百脉根子叶遗传转化的条件,建立了一套有效的遗传转化体系.实验结果表明,EHA 105作为宿主菌对百脉根进行转化较LBA 4404和GV 3101具有更高的转化率;5 d苗龄的子叶最适合作为转化的外植体;浸染过程中0.05 M Pa负压处理5 m im以及在共培养培养基中添加20 m g/L的乙酰丁香酮均可提高转化效率.卡那霉素抗性植株经3次选择继代培养后,PCR检测全部为阳性.对部分PCR阳性植株进行PCR-Sou thern杂交,证实PCR产物真实可靠,表明外源基因已整合进入百脉根基因组中.

干旱胁迫及复水处理对百脉根叶片丙二醛含量及抗氧化酶活性的影响

以栽培型和野生型百脉根(Lotus corniculatus L.)为试验材料,对干旱胁迫4,8,12,16 d和复水处理下4,8 d百脉根的部分生理生化指标的变化进行了研究。结果表明:随着干旱胁迫时间的延长,叶片相对含水量逐渐下降,叶绿素含量、MDA含量、SOD活性和POD活性呈先升高后降低的变化趋势。复水后,各指标得到了不同程度的恢复,但POD的活性明显仍低于对照(P<0.05);从MDA含量变化来看,复水后细胞膜受到的伤害仍然没有修复。干旱胁迫处理下,栽培型和野生型材料的生理生化变化具有一定的差异性,说明来自湿润环境中的野生百脉根的耐旱性相对较差。

2个百脉根品系种子萌发期的耐盐性评价

为探究2个百脉根(Lotus corniculatus L.)品系B1(来源于加拿大圭尔夫)和B2(引种于加拿大)种子萌发期的耐盐性,采用纸上发芽法,以蒸馏水为对照,采用不同浓度(0.3%,0.6%,0.9%,1.2%)NaCl溶液,通过测定发芽率、根长、苗长等7项指标,计算其盐害系数,利用方差分析、主成分分析以及隶属函数对其进行了综合评价。结果表明:随着盐浓度的增加两个百脉根品系的发芽指数呈现出先升高后下降的趋势,活力指数呈现先降低后升高再降低的趋势,其他指标的变化趋势均不一致。方差分析结果表明,当盐浓度为1.2%时,B2的发芽率、发芽势、发芽指数、苗长和幼苗干重均显著高于B1(P<0.05)。综合评价结果表明,种子萌发期耐盐性较强的是品系B2。

百脉根表达H5N1亚型禽流感血凝素的研究

【目的】将H5N1亚型禽流感病毒血凝素(AIVHA)基因转入牧草植物中,利用豆科牧草作为植物生物反应器来生产禽流感抗原蛋白,探索研制禽流感转基因植物可饲用疫苗的可行性。【方法】以百脉根子叶柄外植体作为转化受体,通过农杆菌介导法将AIVHA基因导入百脉根,子叶柄外植体经过共培养、筛选分化、再生,得到抗性植株。对抗性植株进行了PCR、RT-PCR检测和Western blot分析。【结果】证明AIVHA基因已经导入到百脉根基因组中,在核酸水平和蛋白水平都得到了表达。【结论】利用百脉根表达禽流感抗原蛋白是可行的。

口蹄疫病毒P12A-3C免疫原基因在百脉根中的遗传转化与表达

目的利用植物反应器研究口蹄疫转基因植物疫苗是近些年来科学家研究的热点,本研究以豆科牧草百脉根为转化受体,将口蹄疫病毒P12A-3C基因通过根癌农杆菌介导法导入百脉根基因组。方法百脉根外植体经过浸菌,抗性培养基上愈伤、出芽和生根等阶段。结果最终获得了转基因抗性植株。结论对转基因植株进行PCR、RT-PCR检测,表明外源基因整合在植物染色体基因组,并且具有转录活性,ELISA检测表明,转基因植株表达出外源目的蛋白。

百脉根原生质体的分离和酶解条件的研究

分别以百脉根里奥（Lotus corniculatus L.cv.Leon）无菌苗子叶及由下胚轴和子叶形成的胚性愈伤组织为供体材料,进行原生质体游离,研究不同酶解条件对原生质体分离的影响,以期为进一步开展属间体细胞杂交及培育新品种奠定研究基础。结果表明：子叶和愈伤组织原生质体分离最适的酶液组合均为2%纤维素酶＋0.5%果胶酶＋0.3%半纤维素酶、以及0.55 mol·L^-1甘露醇,产量及活力分别可达4.13×10^6个·g^-1,65%和3.8×10^6个·g^-1,67.4%;最佳酶解时间分别为6 h和12 h。预培养8-10 d,CPW-10溶液中预质壁分离1 h或预暗培养1 d等预处理措施可显著提高愈伤组织原生质体的产量及活力（P〈0.01）。

百脉根对干旱胁迫的生长、生理生态响应及其抗旱性评价

以不同来源的百脉根幼苗为试验材料,采用盆栽控水法研究各百脉根材料对干旱的生长、生理生态响应,并利用隶属函数法综合评价其抗旱性。研究结果表明:(1)连续干旱导致百脉根材料幼苗死亡、株高和干物质受到抑制、根冠重量比较对照显著提高。(2)随着干旱胁迫时间的延长,百脉根材料的相对含水量呈降低趋势,相对电导率值和MDA含量呈增加趋势,SOD活性呈先升高后降低的趋势。(3)干旱28d后,各百脉根材料的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、水分利用效率(WUE,除材料B04、B05和B08外)、最大光化学量子效率(Fv/Fm)、光化学量子产量和光化学猝灭系数(qP)均下降;非光化学猝灭系数(NPQ,除B12、B02和B01外)升高。(4)利用隶属函数法综合幼苗生长、生理生态等16个指标评价出8个百脉根材料间的抗旱性顺序为B08>B04>B05>B18>B03>B12>B02>B01。

百脉根农杆菌快速高效遗传转化体系的建立

以百脉根品种“里奥”作为受体材料,以GUS基因为报告基因,研究了影响农杆菌介导的百脉根遗传转化的几种因素及表面活性剂(PEG 4000)、真空处理和乙酰丁香酮对提高转化效率的影响,建立了农杆菌介导的百脉根快速高效遗传转化体系,并获得了转基因抗性苗。结果表明,以子叶(带叶柄)为外植体,在OD600为0.5的菌液中,加入150 mg/L的PEG 4000,真空度6×10-2Pa,抽真空12 min,共培养3 d,转入含卡那霉素50 mg/L和羧苄青霉素300 mg/L的分化培养基中,约20 d后,50%的外植体分化不定芽,生根成苗。PCR初步检测表明有83%的植株为GUS阳性,转化率约为42%。

大豆GmHAT5的克隆及其转基因百脉根的抗盐分析

【目的】从大豆盐胁迫基因表达谱中筛选并克隆得到同源异型域亮氨酸拉链蛋白(HD-Zip)家族基因GmHAT5,将其转化豆科模式植物百脉根并进一步探究其抗盐调控机制。【方法】使用多种生物信息学软件对GmHAT5的开放读码框(ORF)、编码蛋白的分子量、等电点、序列结构和蛋白定位等进行预测,同时将大豆GmHAT5蛋白与其他10个物种的同源蛋白进行比对分析,并对GmHAT5在大豆不同器官及盐胁迫下的表达特性进行分析。此外,构建GmHAT5的植物超表达载体,通过对发根农杆菌LBA1334的转化,得到"复合体"百脉根植株,并在盐胁迫条件下对其进行抗盐表型分析;通过对根癌农杆菌EHA105的转化,获得百脉根的稳定转化株系,并对其进行抗盐表型分析及相关生理指标检测。【结果】多种生物信息学软件分析表明,该片段包含1个1 038 bp的ORF,编码345个氨基酸。GmHAT5的理论分子量和等电点分别为39.17 k D和4.63。GmHAT5蛋白定位于细胞核,与其他HD-Zip家族蛋白一样,属于典型的核蛋白。序列分析表明,GmHAT5包含一个同源异型结构域和一个亮氨酸拉链结构域,属于第I类同源异型域亮氨酸拉链蛋白。同源蛋白比对表明其与野生大豆GsHAT5同源性最高。基因表达特性分析表明,GmHAT5在大豆植株的各个不同器官中均有表达,是一个受盐诱导上调表达的HD-Zip类转录因子。发状根转化的结果表明,使用200 mmol·L^(-1) NaCl处理植株7 d后,"复合体"植株生长状态良好,对照组植株叶片明显萎蔫、失绿;不同NaCl浓度处理离体转基因发状根14 d后,对照组较试验组发状根明显干枯、生长受到抑制。稳定转化结果显示,不同盐浓度处理14 d后,转GmHAT5百脉根与两组对照植株相比生长状态更好。相关生理指标检测结果显示,与两组对照相比,转基因百脉根植株中丙二醛含量和相对质膜透性明显降低(P<0.05),而叶绿素含量和根系活力则显著升高(P<0.05)。测定不同植株阳离子含量的结果表明,转基因百脉根株系与两组对照相比,Na^+在叶片和根中含量显著下降,K^+和Ca^(2+)在叶片和根中含量显著升高。【结论】从大豆中克隆得到一个编码HD-ZipⅠ类同源异型域亮氨酸拉链蛋白基因GmHAT5,该基因在大豆中受盐胁迫诱导表达量显著升高。超量表达GmHAT5显著增强百脉根的耐盐能力,发状根转化法可以作为一种快速有效筛选抗盐候选基因的手段。推测GmHAT5在大豆盐胁迫应激调控中扮演重要角色。

干旱胁迫对百脉根叶绿素荧光特性的影响

以8个百脉根种质为材料,采用盆栽连续干旱法测定干旱胁迫不同时间各百脉根种质的叶绿素荧光参数,探讨百脉根对干旱胁迫的适应机制和抗旱性差异。研究结果表明,干旱胁迫对叶绿素荧光参数的影响非常显著(P<0.05)。随着干旱胁迫天数的增加,叶片PSⅡ的潜在活性、最大光化学效率、实际光量子产量和光化学猝灭系数等荧光参数均呈下降趋势,而叶片非光化学荧光猝灭系数则呈现先升高后降低(B01、B02和B12)或呈一直升高(B04、B05、B08、B03和B18)的变化趋势。干旱胁迫下,种质B04、B05和B08的光合机构受破坏轻,初步评定其抗旱能力较强;其次为B03和B18;B01、B02和B12的光合机构受破坏重,初步评定其抗旱性较差。

气相色谱法测定红景天属植物中红景天甙及百脉根甙的含量

采用硅醚化方法，用甘露醇丙酰化物作内标物，建立了红景天植物药材中红景天甙和百脉根甙的气相测定方法。测定了青海省产１０种红景天共１９个样品。红景天甙和百脉根甙的回收率分别为１００．０５％，９７．８５％。

根癌农杆菌介导的1─磷酸甘露醇脱氢酶基因转化百脉根的研究

本文以百脉根子叶外植体为受体材料，通过根癌农杆菌介导的方法，导入外源目的基因1－磷酸甘露醇脱氨酶（mtlD）基因和npt－Ⅱ基因，建立了转化系统，获得转基因植株，转化频率为9．7％．转化处理的外植体再生植株的茎段在含卡那霉素的分化培养基上膨大，再生成苗和植株。抗性植株的形态正常，移入盆栽后生长良好。PCR扩增与扩增产物的Southern杂交证明外源基因已整合到百脉根基因组上。

猪瘟病毒E2基因在百脉根叶绿体基因组中定点整合载体的构建

【目的】构建猪瘟病毒主要抗原E2基因在百脉根叶绿体基因组中定点转化载体,为百脉根叶绿体的转化及用叶绿体生产动物可直接食用疫苗奠定基础。【方法】通过用BLAST、DNAMAN等分子生物学分析软件对百脉根叶绿体基因组序列进行分析选定同源重组片段,采用PCR、分子克隆技术进行载体构建和鉴定。【结果】在百脉根叶绿体基因组中选择合适的外源基因整合位点,设计引物用PCR扩增叶绿体同源片段,将同源片段克隆后,构建百脉根特异的叶绿体转化载体;构建的百脉根叶绿体定点转化载体pAKE2以扩增的1.35kbpsbA和1.5kbtrnK两段相邻叶绿体DNA为定点整合外源基因的同源重组片段,包含以叶绿体基因特异强启动子Prrn和终止子TpsbA为调控序列的E2基因表达盒和aadA壮观霉素抗性基因表达盒。【结论】经PCR和酶切验证,所构建的转化载体符合预期设计。叶绿体转化及后续工作目前正在进行之中。

百脉根种质苗期抗旱性鉴定及综合评价

采用土培法对21份百脉根种质材料进行了苗期抗旱性评价。结果表明:在干旱胁迫下,明显抑制百脉根的正常生长,地上生物量、地下生物量、株高、分枝数明显减小,根冠比明显增加;渗透调节物质丙二醛(MDA)、脯氨酸(PRO)、可溶性糖、可溶性蛋白的含量明显增加,过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性比正常灌水处理明显增强;运用了6种方法进行抗旱性评价,其中,五级评分法和标准差系数赋予权重法的准确度较高,聚类分析是较好的分类法,二者相结合效果更好;依据标准差系数赋予权重法与聚类分析结果,可将百脉根种质分为3类:抗旱性强的有B90、B85、B78、B79、B83、B92、B81,抗旱性中等的有B73、B89、B76、B93、B75、B86、B91,抗旱性弱的有B77、B84、B74、B80、B82、B88、B87。

发根农杆菌介导的百脉根的基因转化

本文报道了豆科植物简单有效的转化再生实验系统。百脉根子叶外植体被含发根性Ri质粒载体的发根农杆菌感染，孩载体带有一个npt－Ⅱ基因和一个甘露碱合成酶基因。在含卡那霉素的筛选培养基上，外值体能诱导出毛根，并不断生长，毛根诱导频率为45．5％。切取毛根根段在筛选培养基上培养，毛很能膨大，并分化再生成苗和植株，其再生率为77．9％。抗性植株形态正常，浅层根系发达。DNA斑点杂交与Southern杂交证明外源基因已整合到百脉根基因组上。甘露碱测定结果表明外源甘露碱合成酶基因已在百脉根植株水平上表达。

百脉根小G蛋白Rac1基因的克隆与功能分析

小G蛋白Rop在植物细胞信号转导中发挥着重要的分子开关功能。该实验通过RT-PCR方法克隆了百脉根的一个Rop编码基因LjRac1,并对LjRac1基因序列进行生物信息学分析,然后采用半定量RT-PCR检测LjRac1基因在百脉根不同组织中的表达,用荧光实时定量PCR方法检测百脉根接种根瘤菌后LjRac1基因在不同阶段根系中的表达,构建过表达重组质粒,利用发根农杆菌介导的遗传转化法对LjRac1基因功能进行分析。结果表明:(1)序列分析显示,LjRac1完整编码区的cDNA序列长度为594bp,编码197个氨基酸,其编码蛋白具有典型的Rop家族保守结构域;同源分析显示,百脉根LjRac1与大豆GmRac1、野大豆GsRac1的一致性最高(94.42%)。(2)LjRac1基因在百脉根的根、茎、叶、根瘤和花中均有表达,且在根和根瘤中的表达水平较高;接种根瘤菌0.5h后,LjRac1基因在根系中的表达量呈显著升高趋势。(3)过表达转基因植株中LjRac1mRNA的表达水平为对照植株的14.3倍,且过表达植株的结瘤数目较对照明显增加。研究认为,LjRac1基因是一个受根瘤菌诱导增强表达的基因,过表达LjRac1基因可以引起植株结瘤数目的增加,说明LjRac1基因可能参与早期结瘤信号转导途径,从而在根瘤的发育中发挥一定作用。

高温胁迫下百脉根生理生化响应及耐热性评价

以8个百脉根(Lotus corniculatus)种质资源为试验材料,在不同高温胁迫下,测定分析了各种质叶片的相对电导率值、丙二醛(MDA)含量、游离脯氨酸(Pro)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性和过氧化氢酶(CAT)活性6项指标,采用主成分分析与隶属函数相结合的方法对种质间耐热性进行综合评价。结果表明,随高温胁迫增强,百脉根各种质的相对电导率、MDA和Pro含量增加,CAT和POD酶活性(除B01种质外)呈升高趋势,SOD酶活性呈先升高后降低趋势。通过主成分分析可从测定的6个单项指标中抽取出两个相互独立的综合指标,累积贡献率达85.41%。综合3个温度梯度下8个百脉根种质资源的综合评价(D)值,可以推测出各种质耐热性顺序为B08>B04>B05>B18>B03>B12>B02>B01。